方法文章

从人诱导多能干细胞高效且可扩展地生成人腹侧中脑星形胶质细胞

DOI：

10.3791/62095

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2021年10月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一种从 hiPSC 可重复生成腹侧中脑模式星形胶质细胞的方法，以及用于其表征以评估表型和功能的方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在帕金森病中，腹侧中脑多巴胺神经元的进行性功能障碍和退化会导致改变生活的症状。帕金森病的神经元变性有多种原因，包括由星形胶质细胞介导的非细胞自主机制。在整个 CNS 中，星形胶质细胞对神经元存活和功能至关重要，因为它们维持神经环境中的代谢稳态。星形胶质细胞与 CNS、小胶质细胞的免疫细胞相互作用以调节神经炎症，这在帕金森病的早期阶段就观察到，并对其病理进展有直接影响。在具有慢性神经炎症因素的疾病（包括帕金森氏症）中，星形胶质细胞获得神经毒性表型，从而增强神经退化。因此，星形胶质细胞是减缓或阻止疾病的潜在治疗靶点，但这需要更深入地了解它们在帕金森病中的特性和作用。因此，迫切需要用于体外研究的人腹侧中脑星形胶质细胞的准确模型。

我们开发了一种方案，可以从 hiPSC 生成腹侧中脑特异性星形胶质细胞 （vmAstros） 的高纯度培养物，可用于帕金森病的研究。vmAstros 可以由多个 hiPSC 系常规产生，并表达特异性星形胶质细胞和腹侧中脑标志物。该方案具有可扩展性，因此适用于高通量应用，包括药物筛选。至关重要的是，hiPSC 衍生的 vmAstros 表现出其体内对应物的典型免疫调节特性，从而能够对帕金森病的神经炎症信号进行机制研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

帕金森病影响了 2%-3% 的 65 岁以上人群，使其成为最普遍的神经退行性运动障碍1。它是由黑质内腹侧中脑多巴胺神经元的退化引起的，导致运动症状衰弱，以及常见的认知和精神问题2。帕金森病的病理学以 α-突触核蛋白的聚集体为代表，这种蛋白质对神经元有毒，导致神经元功能障碍和死亡 1,2,3。由于多巴胺能神经元是帕金森病的退化群体，因此它们在历史上是研究的重点。然而，很明显，大脑中的另一种细胞类型，即星形胶质细胞，也表现出帕金森病的异常，并且被认为会导致帕金森病模型的退化 4,5,6,7。

星形胶质细胞是一种异质性细胞群，可以根据需要进行物理和功能转化。它们通过多种机制支持神经元功能和健康，包括调节神经元信号传导、塑造突触结构以及通过分泌特定因子对神经元群进行营养支持 6,8,9,10。然而，星形胶质细胞也具有重要的免疫调节作用，是神经炎症发展和传播不可或缺的一部分10,11。在帕金森病患者的大脑中观察到神经炎症，并且最近显着证明可以先于帕金森病症状的发作 12,13,14,15，从而成为帕金森病研究的中心舞台。

在细胞水平上，据说星形胶质细胞对损伤、感染或疾病做出反应，以促进神经保护 9,6,10,16。反应性描述了星形胶质细胞表型的变化，其特征是基因表达、分泌组、形态以及细胞碎片和毒性副产物清除机制的变化 9,10,11,17。这种反应性转变是响应来自小胶质细胞的感应信号而发生的，小胶质细胞是 CNS 的免疫细胞，也是损伤和疾病的第一反应者9。星形胶质细胞和小胶质细胞都通过调节自身功能来响应炎症信号，并且可以转导炎症信号，从而直接影响神经炎症 9,10。然而，帕金森病的慢性性质导致反应性星形胶质细胞对神经元产生毒性，并且它们本身会促进退化和疾病病理学 6,9,10,18,19。值得注意的是，最近证明，在动物模型中阻断星形胶质细胞转化为反应性神经毒性表型可以防止帕金森病的进展11。因此，神经炎症范式中的星形胶质细胞反应性已成为帕金森病研究的主要焦点，并且同样与中枢神经系统的广泛疾病有关。这些发现共同构建了一幅星形胶质细胞与帕金森病病因学的重要参与图景，强调了准确研究模型的必要性，这些模型概括了与帕金森病有关的人类星形胶质细胞群的表型。

在胚胎脑中，神经元首先出现，星形胶质细胞谱系，即星形胶质细胞和少突胶质细胞，出现在发育后期6。体内和体外研究强调了许多信号通路，这些通路似乎控制着神经祖细胞从神经元到星形胶质细胞衍生物的效力。特别是，JAK/STAT、EGF 和 BMP 信号转导在星形胶质细胞的增殖、分化和成熟中发挥作用20,21。这些途径一直是从多能细胞（包括 hiPSC）产生星形胶质细胞的体外方案的重点 6,22,23。从 hiPSC 生成星形胶质细胞的成功例子很多 6,24,25。然而，很明显，CNS 中的体内星形胶质细胞具有特定的区域身份，这与它们的功能直接相关，这与这些星形胶质细胞相对于其特殊神经元邻居的特定要求 17,24,25,26。例如，专门与腹侧中脑相关，已经证明该区域的星形胶质细胞表达特定的蛋白质集，包括多巴胺受体，能够与当地的中脑多巴胺神经元群进行交流26。此外，腹侧中脑星形胶质细胞表现出独特的信号传导特性26。因此，要研究腹侧中脑星形胶质细胞在帕金森病中的作用，我们需要一个反映其独特特征集的体外模型。

为了解决这个问题，我们开发了一种从 hiPSC 生成腹侧中脑星形胶质细胞 （vmAstros） 的方案。所得的 vmAstros 表现出其体内腹侧中脑对应物的特征，例如特定蛋白质的表达以及免疫调节功能。所呈现的结果来自 NAS2 和 AST23 hiPSC 细胞系的分化，这些细胞系是由 Tilo Kunath27 博士衍生并赠予我们的。NAS2 来自健康的对照受试者，而 AST23 来源于帕金森病患者，在编码 α-突触核蛋白 （SNCA） 的基因座中携带一式三份。这些 hiPSC 细胞系之前已在许多已发表的研究论文中进行了表征和使用，包括用于生成各种神经细胞类型 27,28,29,30,31。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 人 hiPSC 细胞系解冻、维持和冻存

  1. 对于包被 hiPSC 培养板，以每 10 cm2 细胞培养板表面积 1 mL 的 PBS 将玻连蛋白稀释至 5 μg/mL （1:100）。在室温下放置 1 小时。
  2. 去除玻连蛋白并立即向培养板中加入 hiPSC/培养基。
    注 从板中去除玻连蛋白时，不允许培养表面变干，这一点至关重要。
  3. 要解冻 hiPSC，请从液氮中取出含有 hiPSC 的冻存管，并置于 37 °C 水浴中，直到内容物完全解冻。
  4. 准备 9 mL 预热的细胞培养基（例如 E8 或 E8 Flex），其中含有 1x 细胞补充剂（例如 Revitacell）。向冻存管的内容物中滴加 1 mL。将剩余的 8 mL 培养基放入 15 mL 离心管中，然后加入冷冻管中稀释的内容物。
    注意: 不要研磨内容物。
  5. 以 150 x g 离心 3 分钟。在不干扰细胞沉淀的情况下吸出液体，并重悬于含有 1x 细胞补充剂（例如 Revitacell）的适当体积的细胞培养基（例如，E8 或 E8 Flex）中。例如，6 孔板每孔 2 mL。
  6. 将重悬的 hiPSC 添加到玻连蛋白包被的培养皿中，并置于 37 °C/5% CO2 培养箱中。
    注意:hiPSC 应在解冻后 30 分钟至 2 小时内开始附着在玻连蛋白涂层的塑料器皿上。
  7. 将 hiPSC 维持在细胞培养基（例如 E8 或 E8 Flex）中。每天通过培养基交换给细胞。补料前务必预热培养基 30 分钟。
    注意 如果使用 E8 Flex，hiPSC 不需要每 24 小时更换一次培养基，如果需要，补料增量可以延长至 48 小时。E8 Flex 或 E8 培养基均可产生同样高质量的 hiPSC 培养物。HiPSC 应在解冻后和开始分化步骤之前培养至少 14 天。少于 14 天的培养期似乎会对初始分化期间 hiPSC 的存活产生负面影响。传代 hiPSCs 汇合度约为 80%（图 1A:3-4 天传代间隔）。
  8. 开始前 1 小时，向 hiPSC 培养物中加入 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）。
  9. 用 PBS（不含钙或镁）洗涤 hiPSC 一次，并加入 0.5 mM EDTA（从不含钙或镁的 PBS 中从原液中稀释）。
  10. 在室温下孵育 5 分钟，或直到 hiPSC 开始相互分离并呈现更圆润的外观，每个 iPSC 的边界在明场显微镜下显得更亮。
  11. 用移液管将 200 μL EDTA 添加到 hiPSC 的聚焦区域。如果它们很容易分离，在细胞层中形成一个空隙，那么它们就可以被收获了。如果它们不容易分离，请留在 EDTA 中并在 1 分钟后重复。
  12. 准备继续时，轻轻去除 EDTA，并使用移液管用细胞培养基（例如 E8 或 E8 Flex）轻轻洗涤 hiPSC 两次。
    注:为了在不分离 hiPSC 的情况下实现此目的，请倾斜板并沿培养板侧面滴加培养基。
  13. 要收获 hiPSC，请使用含有 1x 细胞补充剂（例如 Revitacell）的 1 mL 细胞培养基（例如 E8 或 E8 Flex）。将培养基直接释放到 hiPSC 层上，细胞应分离。如果需要，对另一个 1 mL 培养基重复此作。
  14. 在显微镜下观察 hiPSC。理想情况下，hiPSC 应以相对均匀的簇状出现，如图 1B 所示。如果 hiPSC 簇要大得多，或大小变化很大，请使用移液器打碎较大的 hiPSC 簇（图 1B）。
    注意 不要过度研磨 hiPSC。尽管该补充剂提高了整体细胞存活率，但过度研磨会对 hiPSC 培养物的存活产生负面影响。建议使用移液器进行 1-4 次。
  15. 使用血清移液管，将 hiPSC 悬液转移到 步骤 1.1 中制备的玻连蛋白包被板上。将 hiPSC 培养物放回 37 °C/5% CO2 培养箱中。
    注:将 hiPSC 冷冻保存至约 80% 汇合度。
  16. 开始前 1 小时，向 hiPSC 培养物中加入 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）。
  17. 如 步骤 1.4 所述，使用 0.5 mM EDTA 从培养板中分离 hiPSC，将细胞收集在含有 1x 细胞补充剂（例如 Revitacell）的细胞培养基（例如，E8 或 E8 Flex）中。以 150 x g 离心 3 分钟。
  18. 在细胞冷冻培养基中重悬沉淀的 hiPSC（参见 材料表）。每 10 cm2 培养面积使用 700 μL，相当于 6 孔板每孔 1 个冻存管细胞。
  19. 将冻存管转移到适当的细胞冷冻容器中（有关详细信息 ，请参见材料表）。
  20. 将冷冻容器转移到 -80 °C 冰箱中 24 小时。24 小时后，冻存管可转移至液氮 （-196 °C） 中长期储存。

2. vmAstro 差异化协议

注意:vmAstros 差异化协议的示意图摘要如图 1A 所示。 表 1 给出了方案所需的试剂及其制备的详细列表。

  1. vmNPC 的归纳
    注意:该方案已经过优化，从至少 6 孔板 （10 cm2） 的 1 倍孔开始，hiPSC 70%-80% 汇合，约为 4-5 x 104 个细胞/cm2 （图 1B）30。必须针对每个 hiPSC 细胞系优化起始细胞数量和密度，因为它会显著影响存活和分化效率。
    1. 从 hiPSC 中取出细胞培养基，并在 DMEM/F12 + glutamax 中洗涤 3 次。用 2 mL vmNPC 诱导培养基 （N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH（C24ii） + LDN193189 替换培养基。有关制备培养基和试剂的详细信息，请参见 表 1 ）。
    2. 隔天补料，24 小时后更换半培养基，48 小时更换全培养基。
      注意:3-4 天后，vmNPC 培养物将需要传代。建议使用 1:3 或 1:4 的标准传代比例 - 这需要针对所使用的每个 hiPSC 系进行优化。
    3. 传代前 1 小时，向 vmNPC 中加入 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell），并准备 1x 基底膜基质（例如，Geltrex）包被的组织培养塑料（第 2.2 节准备基底膜基质和涂层 rissue 培养塑料）。
    4. 从 vmNPC 中取出培养基并用 D-PBS 洗涤 2 次。每 10 cm2 培养区域添加 1 mL 预热的细胞分离溶液（例如 Accutase）（6 孔板每孔 1 mL）。
    5. 置于 37 °C 下 1 分钟，然后使用相差显微镜检查 vmNPCs。
      注意:vmNPC 将开始四舍五入，它们的进程将重新收缩，并且单元格层中将出现间隙。这可能需要 1-3 分钟，具体取决于细胞密度。
    6. 当 vmNPC 出现这种外观时，将 100 μL 细胞分离溶液（例如 Accutase）添加到 vmNPC 层上。
      注意:如果 vmNPC 已准备好分离，则单元层中将出现一个孔。如果没有发生这种情况，则 vmNPC 需要使用细胞分离溶液进一步孵育。
    7. 如果 vmNPC 容易分离，则轻轻去除细胞分离溶液并用 N2B27 培养基洗涤 vmNPC 2 次。将 N2B27 培养基轻轻地沿孔或培养容器的侧面加入，然后轻轻旋转洗涤，确保 vmNPC 不会脱落。
      注意:必须快速完成此步骤，以确保 vmNPC 不会重新连接到单元表面。如果 vmNPC 在洗涤步骤中开始分离，则通过以 150 x g 离心 3 分钟收集。vmNPC 在传代时不按标准离心，因为这会降低它们的存活率。
    8. 最后，使用移液管去除 vmNPCs，将含有 1x 细胞补充剂（例如 Revitacell）的 vmNPC 诱导培养基直接喷射到细胞层上。这应该会去除 vmNPC，然后可以直接转移到新的基质包被的包被培养容器中。
      注意:请勿重复使用已经包含重悬 vmNPC 的培养基来去除更多细胞，因为这会导致它们过度研磨，从而降低它们的存活率。
    9. 更换至 37 °C/5% CO2 培养箱中。vmNPC 应在 20-30 分钟后开始附着在基质涂层的表面上。24 小时后，用新鲜的 vmNPC 诱导培养基（不含细胞补充剂）更换一半的培养基，并像以前一样继续饲喂计划。
    10. 继续喂养和传代 10 天。
  2. 制备基底膜基质和涂布组织培养塑料
    注:为了维护 vmNPCs，使用 1x 基底膜基质（例如 Geltrex）涂覆塑料器皿。为了维持 vmAPC 或 vmAstros，可以使用 0.25x 基底膜基质。
    1. 从-80°C冰箱中取出基底膜基质原液，并置于4°C冰箱中过夜解冻。
    2. 用冰冷的 DMEM/F12 + glutamax 以 1:10 稀释，等分试样，并在 -80 °C 下作为 10x 原液储存。
    3. 涂布塑料器皿时，用冰冷的 DMEM/F12 + glutamax 将此 10x 原液稀释至 1x（用于 vmNPC）或 0.25x（用于 vmAPC 或 vmAstros）。
    4. 立即以每 10 cm2 1 mL 的浓度添加到组织培养塑料中，例如，6 孔板每孔 1 mL。
    5. 在 37 °C 下放置 1 小时。在准备好添加培养基/细胞之前，不应从塑料器皿中取出基底膜基质溶液，以确保涂层塑料器皿不会变干。基质包被板在添加细胞之前不需要洗涤。
  3. vmNPC 的扩展
    1. 在方案的第 10 天，用 vmNPC 扩增培养基（N2B27 + GDNF + BDNF + 抗坏血酸）替换诱导培养基。有关制备培养基和试剂的详细信息，请参见 表 1 ）。
      注意 vmNPC 不需要添加有丝分裂原来诱导增殖。BDNF、GDNF 和抗坏血酸支持 vmNPC 的存活和维持30。
    2. 隔天补料，24 小时后更换半培养基，48 小时更换全培养基。
      注意:3-4 天后，vmNPC 培养物将需要传代。对于传代，建议使用 1:3 或 1:4 的标准传代比例（这需要针对所使用的每个 hiPSC 系进行优化）。确定 vmNPC 的最佳存活率、增殖率和生成率）。
    3. 传代前 1 小时，向 vmNPC 中加入 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell），并提前准备 1x 基质包被的板/烧瓶（第 2.2 节准备基底膜基质和涂层 rissue 培养塑料）。将细胞分离溶液（例如，Accutase）预热至37°C。 预热含有 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）的新鲜 vmNPC 扩增培养基。
    4. 从 vmNPC 中取出培养基并用 D-PBS 洗涤 2 次。每 10 cm2 培养面积添加 1 mL 细胞分离溶液（例如 Accutase）（6 孔板每孔 1 mL）。置于 37 °C 下 1 分钟，然后使用相差显微镜检查 vmNPCs。
      注意:vmNPC 将开始四舍五入，它们的进程将重新收缩，并且单元格层中将出现间隙。这可能需要 1-3 分钟，具体取决于细胞密度。
    5. 当 vmNPCs 呈圆形外观时，将 100 μL 细胞分离溶液（例如 Accutase）添加到 vmNPCs 层上。
      注意:如果 vmNPC 已准备好分离，则单元层中将出现一个孔。如果这没有发生，那么 vmNPC 需要用细胞分离溶液进一步孵育。
    6. 如果 vmNPC 确实很容易分离，则轻轻去除细胞分离溶液并用 N2B27 培养基洗涤 vmNPC 2 次。将 N2B27 培养基轻轻地沿孔或培养容器的侧面加入，然后轻轻旋转洗涤，确保 vmNPC 不会脱落。
      注意:如果 vmNPC 在洗涤步骤中开始大量分离，请以 150 x g 离心 3 分钟收集。vmNPC 在传代时不按标准离心，因为这会降低它们的存活率。必须快速完成此步骤，以确保 vmNPC 不会重新连接到单元表面。
    7. 使用移液管去除 vmNPCs，并将含有 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）的 vmNPC 扩增培养基直接弹出到细胞层上。这应该会去除 vmNPC，然后可以直接转移到预先制备的基质包被板/培养瓶中（参见第 2.2 节"制备基底膜基质和包被组织培养塑料"）。
      注意:请勿重复使用已经包含重悬 vmNPC 的培养基来去除更多细胞，因为这会导致它们过度研磨，从而降低它们的存活率。
    8. 更换至 37 °C/5% CO2 培养箱中。vmNPC 应在 20-30 分钟后开始附着在基质涂层表面。24 小时后，用新鲜的 vmNPC 扩增培养基（无细胞补充剂）替换一半的培养基，并继续之前的喂养计划。
    9. 继续这种喂养和传代制度 10 天。vmNPC 可以扩展到第 50 天。
  4. vmAPC 的分化和扩展
    注意:vmNPC 可以成功地用于从初始 hiPSC 阶段开始 30 到 50 天之间的任何时间生成 vmAPCs/vmAstros（图 1A）。
    1. 取汇合的 vmNPC 培养物，在高级 DMEM/F12 中洗涤 vmNPC 3 次，以去除 vmNPC 扩增培养基成分的痕迹。将介质更换为 vmAPC 扩展介质（ASTRO 介质 +EGF +LIF。有关制备培养基和试剂的详细信息，请参见 表 1 ）。
    2. 传代 72 小时后，vmNPC 培养物呈高比例 （1:7.5）。例如，假设 vmNPC 维持在 6 孔板的单个孔中，现在应将它们传代到 1x 基质包被的 75 cm2 培养瓶中（如第 2.2 节"准备基底膜基质和包被组织培养塑料"中所述包被）。使用细胞分离溶液进行传代，如第 2.3 节"vmNPC 的扩增"中对 vmNPC 的描述。
    3. 将 vmNPC 重悬于适当体积的 vmAPC 扩增培养基（每 75 cm2 培养瓶 7.5-15 mL 培养基。每 3 天或根据细胞需要完成培养基更换。
      注意:从这一点开始，vmNPC 被称为 vmAPC，应作为单个细胞而不是细胞簇传代。vmAPC 应每 3-7 天传代一次，或在它们汇合时传代，以避免过度汇合。从这一点开始，应使用降低浓度的 0.25x 基质来涂覆塑料器皿（如第 2.2 节:准备基底膜基质和涂布组织培养塑料中所述）。
    4. 扩增 vmAPC 直到它们达到第 90 天（从 hiPSC 阶段），在其扩增的各个点冻存 vmAPC。
  5. 从 vmAPC 生成成熟的 vmAstro
    注意:在此阶段，vmAPC 可以在 175 cm2 组织培养瓶中生长。这可以扩展到生成大量成熟的 vmAstros。
    1. 当 vmAPC 达到 80% 汇合度时，用 ASTRO 培养基洗涤 3 次，并替换为 vmAstros 成熟培养基（ASTRO 培养基 +BMP4 +LIF。有关制备培养基和试剂的详细信息，请参见 表 1 ）。
    2. 每 3 天进行一次完整的培养基更换，或根据细胞需要进行 10 天。
      注意:a） 在这一点上，表征表明 vmAstros 已经成熟，免疫细胞化学（图 2G - I）和基因表达分析（手稿正在准备中）证实。b） 成熟后立即使用的 vmAstros 应重新电镀在新制备的基质涂层表面上。将 vmAPC 或 vmAstros 维持在同一培养表面上超过 14 天可能会导致培养效果不佳，其中细胞开始缩小甚至分离。c） 对于检查神经炎症调节的应用，在神经炎症刺激前 72 小时去除 BMP 和 LIF。这是为了避免 BMP/LIF 信号传导和诱导的神经炎症信号之间的任何潜在相互作用。
    3. vmAstros 现在可以重新接种用于实验分析，例如，接种在盖玻片上用于免疫细胞化学或冷冻保存以备将来使用（第 3、4 节）。
      注意:在方案的这个阶段，传代不是必需的，因为增殖只应以非常低的速度发生。在此阶段铺板过密的 vmAPC 保持更高水平的增殖。如果是这种情况，则传代并分流细胞以达到如图 1F 所示的密度。

3. vmNPC、vmAPC 和 vmAstros 的冻存

注意:将 vmNPCs/vmAPCs/vmAstros 完全融合。

  1. 开始前 1 小时，向培养物中加入 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）。在室温下用异丙醇填充低温储存容器（参见 材料表）。
  2. 如前所述，使用细胞分离溶液将细胞从培养板上分离，将细胞收集在含有 1x 细胞补充剂（例如，Revitacell）的适当培养基（N2B27 或 ASTRO 培养基）中。以 150 x g 离心 3 分钟。
  3. 将沉淀的 vmNPCs/vmAPCs/vmAstros 重悬于细胞冷冻培养基（参见材料表）体积中，如下所示（步骤 3.3.1. - 3.3.3.）。
    1. 对于 vmNPC:每 10 cm2 培养区域使用 700 μL，放入 1 个冻存管中。
    2. 对于 vmAPC:每 60 cm2 培养面积使用 700 μL，放入 1 个冻存管（大约 T175 培养瓶的 1/3）中。
    3. 对于 vmAstros:重悬于 2 mL 培养基中并计算 vmAstros 的数量。重新离心并重悬于细胞冷冻培养基中（参见 材料表），每个冻存管的编号适合未来应用。假设由于冻融导致大约 15% 的细胞损失，对新解冻的 vmAstros 进行计数并接种 15% 的超额细胞数，以补偿冻融过程中的细胞死亡。因此，这相当于每厘米 74,750vmAstros 2。在测定之前，将解冻的 vmAstros 在 ASTRO 培养基中维持 72 小时。
  4. 将冷冻管转移到细胞冷冻容器中（有关详细信息，请参见 材料表），并将冷冻容器转移到 -80 °C 冰箱中 24 小时。24 小时后，冻存管可转移至液氮 （-196 °C） 中长期储存。

4. vmAstro 表型的表征

  1. 免疫细胞化学
    1. 将 100-200 个 13 mm 玻璃盖玻片放入玻璃培养皿中，放在一层滤纸上，并在干燥的高压灭菌器中消毒。
    2. 使用无菌镊子将盖玻片转移到 4 孔或 24 孔板的孔中。在盖玻片上加入 1x 基质溶液（例如，Geltrex）作为 50 μL 液滴，并在 37 °C 下孵育 1 小时。
    3. 传代或解冻 vmAstros，在 ASTRO 培养基中重悬并进行计数。以 50 μL 液滴中每个盖玻片 25-100,000 个细胞的密度接种 vmAstros。
    4. 从盖玻片中取出基质，并立即将 vmAstros 添加到一滴培养基中。在 37 °C 下放置 30 分钟，然后用额外的 250 μL ASTRO 培养基淹没孔。
      注意:如果进行免疫细胞化学以仅检查星形胶质细胞和中脑标志物的表达，则可以在接种后 24 小时固定 vmAstros。
    5. 通过在 D-PBS 中以 1:9 的比例稀释 36% 甲醛溶液来制备 4% 甲醛溶液。
    6. 用 D-PBS 洗涤 vmAstros 1x。立即向孔中加入 4% 甲醛，并在室温下放置 10 分钟。
    7. 去除甲醛并用 D-PBS 替换。储存在 4 °C 或进行免疫细胞化学。
    8. 用 D-PBS 在孔中洗涤盖玻片 3 次。在室温下，在 10% 山羊血清、1% BSA 的 0.1% PBTx （D-PBS + 1:1000 Triton-X） 中透化和封闭 1 小时。
    9. 在 1% 山羊血清中加入一抗（材料表），在 0.1% PBTx （D-PBS + 1:1000 Triton-X） 中加入 0.1% BSA，并在 4°C 下在摇床上孵育过夜。
    10. 第二天，去除一抗并用 D-PBS 洗涤盖玻片 3 次。
    11. 在 1% 山羊血清中加入适当的二抗（材料表），在 0.1% PBTx 中加入 0.1% BSA，并在室温下孵育 1-2 小时，并使其在摇杆上避光。用 D-PBS 洗涤盖玻片 3 次。
    12. 加入 DAPI 溶液（0.1 μg/mL DAPI 的 D-PBS 溶液）并在室温下孵育 10 分钟。用 D-PBS 洗涤盖玻片 3 次。
    13. 要安装盖玻片，将 5 μL Mowiol/DABCO 封固剂液滴 [12% Mowiol （w/v）、12% 甘油 （w/v） 溶于 0.2 M Tris （pH 8.5） 中过夜搅拌，含 25 mg/mL 1,4-二氮杂双环[2.2.2] 辛烷 （DABCO）] 到玻璃显微镜载玻片中。使用镊子小心地从孔中取出盖玻片;将盖玻片的边缘轻拍在纸巾上以去除多余的液体，然后将 vmAstros 面朝下放在 Mowiol/DABCO 液滴上。
    14. 对每个盖玻片重复此作，并在显微镜检查前晾干 8 小时。
  2. 响应细胞因子治疗的 vmAstros 分泌 IL-6 的 ELISA 测量
    注:在用 BMP4 和 LIF 成熟 10 天后，应将 vmAstros 传代、计数并接种在 0.25x 基质包被的组织培养塑料器皿上（详见 第 2.2 节制备基底膜基质和涂布组织培养塑料），密度为每厘米 65,000 vmAstros2 在 ASTRO 媒体中。应在细胞因子处理前 72 小时从 vmAstros 中去除 BMP4 和 LIF，因为这些因子的活性信号传导会干扰细胞因子治疗的疗效。或者，可以解冻冷冻保存的 vmAstros 并用于检测。
    1. 在测定当天，在非氧化还原培养基 （DMEM/F-12 + glutamax + N2） 中轻轻洗涤 vmAstros 3 次。
    2. 使用未处理的对照和细胞因子处理良好的对照进行比较。添加所选浓度的细胞因子。图 2J - L 中的数据是在非氧化还原培养基中以每 10 cm2 细胞培养面积 1 mL 的 3 ng/mL9 IL-1α 生成的。
    3. 在 37 °C/5% CO2 培养箱中更换 vmAstros 24 小时。24 小时后，将培养基收集到无菌微量离心管中。
    4. 如果不立即进行 ELISA，请将微量离心管浸入液氮中快速冷冻培养基样品，并储存在 -80 °C 以备将来分析。
      注:以下方案专门针对材料表中详述的 IL-6 ELISA 试剂盒进行了优化。在新 ELISA 试剂盒中以冻干粉形式交付的抗体和标准品必须在首次使用前重新配制，并分装以备将来使用。试剂盒随附的数据表详细说明了复溶所需的试剂和体积。捕获抗体必须在 PBS 中复溶（不含载体蛋白）。
    5. 以 96 孔板形式进行 ELISA，并根据使用的孔计算试剂的体积。在 ELISA 当天，通过在 PBS 中以 1:120 的比例稀释原液来制备捕获抗体。通过每孔加载 50 μL 捕获抗体来包被板。用胶条盖住板，并在室温下孵育过夜。
    6. 第二天，用 D-PBS-Tween（含 0.05% Tween-20 的 D-PBS）洗涤板 3 次，每孔 100 μL。吸干。
    7. 通过每孔加载 150 μL D-PBS/1% BSA 来封闭板。在室温下孵育至少 1 小时。按照说明洗涤板。
    8. 在冰上解冻样品（这可能需要 1-2 小时）。通过加载 10 μL 样品和 40 μL D-PBS/1% BSA 以 1:5 稀释样品。上样前对每个样品进行涡旋。
      注:进行 IL-6 ELISA 时需要稀释样品，应优化稀释度。
    9. 通过在 D-PBS/1% BSA 中以 1:180 的比例稀释原液来制备顶级标准品 （1,000 ρg/mL）。通过对顶级标准品进行连续稀释来制备 7 个标准品。在每次稀释之间涡旋。
    10. 向孔中加入 50 μL 标准品/样品。使用 D-PBS/1% BSA 作为空白。在轨道振荡器上在室温下孵育 2 小时，以适当混合稀释的样品。按照说明洗涤板。
    11. 通过在 D-PBS/1% BSA 中以 1:60 的比例稀释原液来制备检测抗体。每孔上样 50 μL 检测抗体。盖上板并在 RT 下孵育 2 小时。按照说明洗涤板。
    12. 通过在 D-PBS/1% BSA 中以 1:40 的比例稀释原液，制备与辣根过氧化物酶 （Strep-HRP） 偶联的链霉亲和素。每孔加载 50 μL Strep-HRP，并在室温下避光孵育 20 分钟。按照说明洗涤板。
    13. 通过每孔加载 50 μL TMB 底物溶液来引发显色反应。在室温下避光孵育 20 分钟（或直到标准品和样品呈蓝色）。
      注意:TMB 储存在 4 °C 下，但应在室温下使用。
    14. 通过每孔添加 25 μL 终止液 （1 M H2SO4） 终止反应，并注意颜色从蓝色变为黄色。
    15. 使用酶标仪在 450 nm 吸光度下读取板。将波长校正设置为 540 nm 吸光度，以最大限度地提高准确性。根据生成的标准曲线计算样品中的蛋白质浓度。

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结果

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鉴别方法和进展
在这里，我们介绍了用于生成 vmAstros 的方法以及用于其后续表型表征的协议的详细信息。生成 vmAstros 的方法由几个不同的分化阶段组成，可以通过显微镜监测并识别不同的形态特征（图 1A-F）。无饲养层 hiPSC 培养物（图 1B）暴露于特定因子中，以诱导它们向神经谱系 （LDN193189， SB431542） 分化，特别是腹侧中脑 （CHIR99021， SHH-C24ii）。这导致产生 vmNPC 的培养物，其形态学上与 hiPSC 不同 - vmNPC 不如 hiPSC 圆，并且 vmNPC 具有细长的多边形或三角形，这是神经祖细胞的典型特征（图 1B，C）。形态学差异从第 7-10 天开始就很明显了。当 vmNPC 传代时，类似于 hiPSC，我们的目标是将它们维持为小细胞簇而不是单...

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讨论

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这种从 hiPSC 生成 vmAstros 的方法非常高效，生成 vmAstros 的纯培养物，并且对于从不同 hiPSC 系生成 vmAstros 具有可重复性。该协议是围绕胚胎中正确模式发育中脑和产生星形胶质细胞所需的发育事件的概括而开发的，包括三个定义的阶段:1） 神经腹侧中脑诱导以产生 vmNPCs，2） vmAPCs 的产生和扩增，最后 3） vmAstros 的成熟。

在我们之前发表的工作中，我们强调了优化用于产生 vmNPC 的每个 hiPSC 系的 CHIR99021 和 SHH（C24ii） 浓度的重要性，以确保腹侧中脑标志物的最佳表达30,31;200 ng/mL SHH （C24ii） 和 0.8 μM CHIR99021 在多个 hiPSC 细胞系上产生一致的可重现结果。然而，300 ng/mL SHH （C24ii） 和 0.6 μM CHIR99021 对特定的 hiPS...

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披露

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作者没有什么可披露的。

致谢

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这项工作由英国帕金森氏症项目资助 （G-1402） 和学生资助。作者非常感谢 Wolfson 生物成像设施对这项工作的支持和帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>试剂
0.2M Tris-Cl （pH 8.5）n/an/a 由Tris 碱和盐酸
0.5M EDTA、PH 8热飞世尔 15575-0201：1000 溶于 D-PBS 中，最终浓度为 0.5 mM 
1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷 （DABCO）SigmaD27802- 25 mg/mL，溶于 Mowiol 封固液
13 mm 盖玻片VWR631-0149
2-巯基乙醇 （50 mM）ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010具有 1x NEAA，但我们添加的终浓度为 2x （0.2 mM）
抗坏血酸SigmaA5960200 mM 储备液，1：1000 至 200 和微量;M final
B27 补充剂ThermoFisher17504-04450x 原液
BSASigma5470
细胞冷冻培养基SigmaC2874冷冻剂 CS10
细胞冷冻容器Nalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem13860.8 mM 原液，1：1000 稀释至 0.8 &微量;M final
冻存管 SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL，最终浓度为 1：10,000 至 100ng/mL（在 PBS 中）
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS（不含 Mg 或 Ca的 D-PBS）ThermoFisher14190144pH 7.2
E8 Flex 培养基试剂盒ThermoFisherA2858501
甲醛（36% 溶液）Sigma47608
GeltrexThermoFisherA1413302冷的 DMEM/F12
GlutamaxThermoFisher350500382 mM 原液（N2B27 中为 1：200，ASTRO 培养基中为 1：100 至 20 &微量;M final） 
甘油SigmaG5516
人 BDNF Peprotech450-0220 和微型;g/mL 储备液，最终浓度为 1：1000 至 20 ng/mL
人 BMP4Peprotech120-0520 &微量;g/mL 储备液，最终浓度为 1：1000 至 20 ng/mL
人 EGFPeprotechAF-100-1520 &微量;g/mL 储备液，最终浓度为 1：1000 至 20 ng/mL
人 GDNFPeprotech450-1020 &微量;g/mL 储备液，1：1000 至 20 ng/mL 最终
人胰岛素溶液Sigma I927810 mg/mL 储备液，1：2000 至 5 &微量;最终
人 LIFPeprotech300-0520 &微量 g/mLg/mL 储备液，1：1000 至 20 ng/mL 最终
IL-6 ELISA 试剂盒BiotechneDY206
异丙醇Sigma I9516-4L用于填充
LDN193189SigmaSML0559100 µ 的 Mr Frosty 低温储存容器;M 储备液，1：10,000 稀释至 10 nM 最终
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 添加剂ThermoFisher17502048100x 储备
NEAAThermoFisher1114003510 mM 储备液，1：100 至 0.1 mM 最终浓度 
Neurobasal 培养基ThermoFisher21103049
正常山羊血清Vector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x 原液，1：100 至 1x 最终
SB431542Tocris161410 mM 原液，1：1000 稀释至 10 &微量;M final
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µg/mL 储备液，1：1000 至 200 ng/mL 最终
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
吐温-20Sigma P7949
玻连蛋白ThermoFisherA147001：50 溶于 D-PBS
<强>免疫细胞化学抗体 公司目录号宿主物种
抗 S100bSigmaSAB4200671小鼠抗体;1：200
抗 FOXA2SCBTNB600501小鼠抗体;1：50
抗 LMX1AProSci7087兔抗体;1：300
抗 LMX1AMilliporeAB10533兔抗体;抗
LMX1BProteintech18278-1-AP
Proteintech20785-1-AP抗体1：300
1：400
抗体;1：100
抗 MSI1抗体 Abcamab52865兔;1：400
Alexa Fluor 488 山羊抗兔抗体 ThermoFisherA32731山羊;1：500
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠ThermoFisherA32723山羊;1：500
Alexa Fluor 568 山羊抗兔ThermoFisherA11036山羊;1：500
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠ThermoFisherA11031山羊;1：500
制成冰浓度 液 兔的 1：2000 抗体;抗 GLAST 兔的 1：300;抗 GFAP Dako Z0334 兔的 抗体;抗 CD49f Proteintech 27189-1-AP 兔的

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