在合并臭氧和LPS诱导穆林急性肺损伤期间可视化肺细胞适应

摘要

臭氧和细菌内毒素暴露的小鼠的结合显示广泛传播的细胞死亡，包括嗜中性粒细胞死亡。我们观察到细胞适应，如细胞骨质跛脚膜的中断，复杂V ATP合成酶亚单位β和血管他汀在支气管-阿尔韦奥拉厕所的细胞表达增加，抑制肺免疫反应和延迟中性粒细胞招募。

摘要

肺部不断面临无菌（颗粒或活性毒素）和传染性（细菌、病毒或真菌）炎症等直接和间接的侮辱。压倒性的宿主反应可能导致呼吸受损和急性肺损伤，其特点是肺中性粒细胞的招募，由于病理逻辑宿主免疫，凝固和组织重塑反应。敏感的微观方法，可视化和量化Murine肺细胞适应，以响应低剂量（0.05ppm）臭氧，一种强大的环境污染物，结合细菌脂聚糖，TLR4激动剂，是至关重要的，以了解宿主炎症和修复机制。我们描述了对各种肺和全身体室的全面荧光微观分析，即支气管-肺泡乳液、肺血管灌注液、左肺冷冻切除和骨骼骨髓灌注。我们显示肺巨噬细胞、嗜中性粒细胞、肺乳腺组织以及骨髓细胞的损伤，这些细胞与被分析隔间中以离散化学素梯度为标志的延迟（高达36-72 h）免疫反应相关。此外，我们呈现肺细胞外基质和细胞细胞细胞相互作用（行为素，图布林），线粒体和活性氧物种，抗凝血性质氨酸，其抗血管生成肽片段血管他汀，线粒体ATP合成酶复合V亚单位，α和β。这些代孕标记，当辅之以足够的 体外 细胞检测和 体内 动物成像技术，如静脉显微镜，可以提供重要信息，了解肺对新型免疫调节剂的反应。

引言

急性肺损伤 （ALI） 是肺部对传染性或其他有害刺激的重要病理反应，其特点是同时激活凝固性、纤维化和与生俱来的免疫系统¹。嗜中性粒细胞通过收费状受体（TLR）系列^2、3、4迅速感知微生物以及细胞内损伤模式。嗜中性粒细胞释放预先形成的细胞因子和细胞毒性颗粒含量，然后可能导致附带组织损伤。随之而来的藻类损伤与继发细胞死亡一起受损，导致腺苷三磷酸盐（ATP）5等分子的释放，从而引发免疫调节的恶性循环。

在理解ALI时，一个尚未解决的问题涉及如何在气孔膜内启动损伤的问题。电子运输复合物V，F1F0 ATP合成酶，是一种线粒体蛋白，已知在炎症期间在细胞（包括内皮、白细胞、上皮）血浆膜上随处可见。细胞细胞细胞，由作用素和图布林组成，分别具有许多细胞形状和功能调节以及线粒体蛋白质。我们最近表明，由内源性分子、血管他汀、沉默中性粒细胞招募、活化和脂糖（LPS）引起的肺部炎症⁶对ATP合成酶的阻断。因此，生化（ATP合成酶）和免疫（TLR4）机制都可能调节肺部炎症期间的肺气道屏障。

接触臭氧（O_3），环境污染物，损害肺功能，增加肺部感染的易感性，而短期低水平的_O3暴露增加那些有基础心肺疾病7，8，9，10，11，12，13，14的死亡率的风险。因此，接触与生理相关的O₃浓度为ALI研究炎症^7、8的基本机制提供了一个有意义的模型。我们的实验室最近建立了低剂量O₃诱导^ALI15的穆林模型。在对低O₃浓度进行剂量和时间反应后，我们观察到，暴露在0.05ppm O₃中2小时，诱发急性肺损伤，其特征是肺ATP合成酶复合V亚单位β（ATP®）和血管他汀表达，类似于LPS模型。静脉肺成像显示肺活体作用微细丝的杂乱无章，表明肺部损伤， 和消融的肺膜隔膜活性氧物种 （ROS） 水平 （表示基线细胞信号的废除） 和线粒体膜潜力 （表示急性细胞死亡） 后 2 小时暴露到 0.05 ppm O₃^15，这与异质肺¹⁸FDG 保留^16，中性粒体招募和细胞因子释放有关， 最明显的是IL-16和自卫队-1+。我们最近的研究传达的信息是，当O₃暴露在浓度低于允许的0.063ppm（每天）超过8小时（每天）的允许限值时，会产生指数级的高毒性。重要的是，对于这些亚临床O₃暴露能否调节TLR4介质机制，如细菌内毒素^17，目前还不清楚。因此，我们研究了双击O₃和LPS暴露模型，并观察了免疫和非免疫细胞适应。

我们描述了对各种肺部和全身体室的全面荧光微观分析，即支气管-肺泡熔岩液（即， BAL）对肺血管空间（即LVP）进行采样，在内皮屏障、左肺冷冻时，对肺血管和肺间膜进行采样，以观察熔岩肺组织中残留的常驻肺细胞和粘附白细胞，代表循环白细胞的外周血液和胸骨和股骨骨髓分别在炎症期间采样造血细胞动员的近部和离位位。

方案

这项研究的设计得到了萨斯喀彻温大学动物研究伦理委员会的批准，并遵守了加拿大动物护理委员会关于人道动物使用的准则。购买六至八周大的雄性C57BL/6J小鼠。注:在预定终点之前，对出现严重嗜睡、呼吸窘迫或其他严重不适迹象的动物实施安乐死。

注意:准备以下:27-18 G 针状（将取决于小鼠气管直径），适当大小的PE管，以适应钝针（为每只小鼠制作一个PE管），管子， 2 把锋利的剪刀、2 个钝钳（小）、1 个锋利的钳子（小）、3 个 1 mL 注射器、贴有标签的微胶管（用于 BAL、血液、血管和骨髓灌注），并贴有小瓶（用于组织固定）、用于组织收集的样品袋/冷冻液、屠夫的棉线卷（切成足够大小的连结）。用于实验的所有化学品均在 材料表中注明。

1. 臭氧和LPS暴露诱导穆林肺损伤

1. 臭氧暴露
   1. 准备自定义 O₃ 感应框。加入鼠饲料，水瓶，浓缩玩具和干净的床上用品，以顺序和模仿老鼠的住房环境。
      注意:这些步骤将确保小鼠在定制感应箱中自由获得食物和水，并有助于减轻不必要的压力。
   2. 切换 O₃ 校准器/发电机"ON"（放置在入口端口），在手前稳定紫外线灯（曝光前约 15 分钟），并与在线 O₃ 监视器连接。
      注:O₃ 显示器应读取平均 0.05 ppm，从插座中以恒定的室温（72 ±3 °F）和相对湿度（50±15%）进行采样。
   3. 对于 O₃ 暴露，轻轻地将鼠标放在自定义感应框中，并持续将鼠标暴露在 0.05 ppm O₃ 中，持续 2 小时。
2. 麻醉和内在 LPS 管理
   1. 分别准备10毫克/mL的氯胺酮和西拉津库存。
   2. 混合20份氯胺酮和1份西拉津，准备鸡尾酒。如果小鼠称X克，将氯胺酮/西拉津鸡尾酒（X/200）mL注射到腹腔中。对于一只小鼠，准备1mL的鸡尾酒，包括10毫克/mL氯胺酮库存的1000微升和50微升的锡拉津库存。通过在微管中上下管道很好地混合。
      注:氯胺酮和锡拉津库存可以提前一周准备。
   3. 麻醉小鼠在光腹膜内 （IP） 氯胺酮 （50 毫克/千克） / xylazine （1 毫克/千克） 混合 （例如， 为 25 克小鼠， 注射 0.125 mL 的鸡尾酒）.
   4. 在盐水中准备 1 毫克/毫升的 LPS 溶液，并将 50 μL 的溶液填充在移液器中。
   5. 将鼠标直立在手掌上，用同一只手握住耳朵。现在，将LPS^溶液 的50μL轻轻地放在鼻孔外（即每个鼻孔25μL或一个鼻孔中50μL;只要程序快并不重要），让小鼠吸入LPS溶液。
   6. 用50μL的无菌盐水灌输对小鼠。
      注意:灌输不超过 100 μL，这可能是致命的。体积太少（即<50 μL），并且存在只有鼻腔沉积的风险。
   7. 在 LPS 管理之后，轻轻地将老鼠放在它们的肚子上或背上，它们的头部稍微向下倾斜。
      注意:此方向延长了鼻腔¹⁹中溶液的保留。
   8. 在 0， 2、4、24、36和72 h接触后，用全剂量氯胺酮（200毫克/千克）/xylazine（4毫克/千克）混合（即X/50 mL的鸡尾酒，其中X是25克小鼠的鼠标重量为克或0.50 mL）。
   9. 观察鼠标，直到它失去知觉和正确的反射（即，躺在仰卧位置时不会回头）。现在，通过监测呼吸（有节奏的胸部短途旅行）和心率来检查鼠标麻醉的深度，这些心率在1-2分钟后会明显下降。
   10. 接下来，检查踏板反射，即捏捏后肢数字，并观察肢体的缩放，作为反射。如果鼠标响应，根据需要额外进行 0.1 mL 注射或更多充值。
       注意:要实现深度麻醉，请记住，某些菌株或肥胖小鼠通常有较大的分布量，因此很容易过度服用，如果没有足够的时间，如果不允许全麻醉（这可能是大约10分钟或更长时间）。因此，一些菌株可以抵抗麻醉，因此需要更多的充值。这些知识是在对不同菌株和年龄的小鼠进行许多实际观察和经验后获得的。由于在 O₃和 LPS 暴露（即在 2 h 时间点）之后，还立即进行了一些试点实验，因此我们还从这些实验中包括了一些非常早期的 BAL 细胞分析，以突出 O₃^{和 LPS 联合暴露}的直接影响。

2. 样本收集

1. 将鼠标放在手术托盘上。现在，轻轻在两只眼睛上涂上润滑眼药膏，以避免液体流失，并使用70%的乙醇喷雾对小鼠进行消毒。
   1. 用剪刀在上部和下层皮肤膜上做小切口，露出气管和胸腔。
   2. 在胸骨下面切一下，露出心脏。
2. 心脏穿刺
   1. 将附着在肝化注射器上的25G针头放入右心室，通过心脏穿刺抽血。
      注:如果心脏被心脏穿刺的时间不到一分钟，血液通常用最少的柱塞抽取。收集约 0.4-0.5 mL 后，可能需要暂停几秒钟，然后再收集剩余的血液。这样做是为了让心脏泵到正确的心室任何剩余的体积。采血结束时，心脏停止抽水。
   2. 收集血液并储存在微管中以进行进一步处理。
3. 气管 切开 术
   1. 小心使用钳子/钝钳清除气管区域，从过度组织。使用戴手套的手比手术器械更多，以避免出血。如果大量血液渗出，则存在污染物 BAL 样本的风险。如有必要，使用棉签，虽然不是首选。金威普斯是更好的替代品。
   2. 现在，切开肋骨露出肺部。再次，要 小心 不要割断胸骨和腹动脉或上升主动脉:在通过肋骨笼前进时进行较小的切割）
   3. 将棉质连字放在气管剪下方，暂时离开。
   4. 将气管切成1/3部分的合适位置，指向肺部，以便获得28G气管管。
   5. 将 28 G PE 管（最小长度为 3-5 mm，并修剪完结以方便插入）插入气管。在分叉前注意气管的末端，然后拉回约一毫米，以避免只取样单叶。
   6. 牢固地，系上棉连结，将管子保持到位。不要把管网折叠。
4. 布朗乔-阿尔韦拉尔厕所（BAL）
   1. 在 1 mL 注射器中填充 0.5 mL 的 PBS。
   2. 现在在1mL注射器的帮助下，逐渐将0.5 mL的PBS注射到罐中。
   3. 注射 PBS 后，只要注射器不抵抗吸力，就吸气。
      注意:如果在吸气 BAL 液体时存在阻力，则表示气管或支气管组织崩溃。在这种情况下，用一个微小的拉回管子，以分离形成组织壁的管子。
   4. 将吸气液收集到贴有标签的微管中，放在冰上。
   5. 在同一小瓶中以类似方式再进行两次熔岩收集（即共 0.5 X 3 = 1.5 mL 熔岩）。
   6. 测量收集的 BAL 流体的体积。熔岩恢复应该接近 90% 。
5. 肺血管灌注剂 （LVP）
   1. 在胸腔和腹部两半之间的位置切下下胸动脉，避免在通过右心室灌注时肺部中任何香水的备份。
   2. 在切口末端附近打斑点腔，无血。
   3. 接下来，通过右心室注入0.5 mL室温肝盐水，给肺部注入。
   4. 从下行胸动脉切端的腔中收集血管灌注物，放入微浮管中，放在冰上测量其体积。
   5. 从气管（用棉线）靠近其分支的右支气管。
6. 原位左肺固定
   1. 将 1 mL 注射器连接到气管管管，其时间足够长，可通过以前的气管切口插入。
   2. 在注射器中抽回高达 0.6 mL 标记的空气。
   3. 然后，在室温下用2%的副甲醛填充剩余的注射器（一直到最后）。确保柱塞准备好弹出，而不会从管子吸回任何空气。
   4. 现在，将注射器与苏格兰胶带粘贴到直立容器中，高度可达 20 厘米。
   5. 轻轻地，将柱塞拉出，让固定流向气管。如果罐内有一些气泡，轻轻地将柱塞放在注射器顶部，几秒钟后液体将开始流动。
   6. 让左肺原位膨胀到总容量， 从20厘米高处5分钟形成20厘米的水柱。
   7. 在此过程中，请确保保护右肺叶不接触副甲醛，因为这将影响下游检测。
   8. 放置折叠的实验室组织，以吸收任何可能与右肺叶接触的副甲醛。
      注意:甲醛是剧毒的。因此，不要吸入或放置接触身体的任何暴露部分。处理时要格外小心。
   9. 在甲醛灌输期间，对腹部进行消毒。
   10. 切断气管上的右肺叶，确保去除任何线，并立即将叶放入贴有标签的低温叶中，将其放入液氮中，用于下游分子/生化细胞因子分析/RT-PCR/肺同质化的西斑分析。
   11. 小心修剪任何结缔组织或胸膜的左肺，并在4°C下将其浸入2%的副甲醛中24小时。
   12. 根据标准嵌入协议，将固定肺嵌入石蜡中。
       注意:不要过热肺部样本。
   13. 切开腹部，从骨盆（臀部）骨上去皮。
   14. 将左右股骨骨骼与骨盆部分分开，放在冰上盐水填充的培养皿中。
7. 斯特纳尔和股骨骨髓吸气收集
   1. 使用实验室组织清洁骨骼上的组织和肌肉。
   2. 将腹腔肋骨和胸骨收集到冰上充满盐水的培养皿中。
   3. 切断胸骨和股骨的解剖和近端。
   4. 用 0.5 mL 盐水将骨骼灌注 4 次，使用安装良好的针头（24 至 28 G）在 1 mL 注射器上，并将每个骨骼的分数收集到装有过滤器并放置在冰上的贴有标签的管中。
      注:针头量表因动物大小而异。冲洗后，股骨应显示为透明。
   5. 采集样品后，将鼠标装在塑料袋中，并按照机构动物设施的准则放入动物尸体冰柜进行适当处理。

3. 样品处理

1. 总 （TLC） 和差分 （DLC） 白细胞计数
   1. 离心外周血、BAL、肺血管灌注和骨髓（骨骼和股骨）样本在500克处10分钟。
   2. 收集超自然人，闪光冻结它们，并将它们存储在-80°C，直到进一步分析。
   3. 在至少 200 μL 的 PBS 中重建细胞。
   4. 通过在血细胞仪上计数BAL、血液、肺血管灌注和骨髓细胞来执行TLC。
   5. 染色另一个 9 μL 的 BAL 报价与 1 μL 混合的钙蛋白绿色和红色同位素 -1 量化活 （绿色） 细胞由于细胞内酯酶活性和任何损坏的 BAL 细胞 （红色） 由于失去血浆膜完整性.
   6. 在裂解 RBC 中加入 2% 醋酸，血液 TLC 的比例为 1:10，肺血管富硫酸盐 TLC 的比例为 1:2。
      注意:如果浓度超过每mL1x10⁶ 个细胞（对骨髓样本非常重要），则通过在PBS中稀释来调整细胞浓度。
   7. 将细胞离心，在幻灯片和污渍上准备细胞针，如下所述，用于 DLC。至少计算 100 个细胞，以进行微分白细胞细胞计数 （DLC）。
      注意:通常情况下，一个人可以在一张幻灯片上准备两个细胞针。在10-15分钟的空气干燥后，继续染色步骤。
   8. 将收集的 BAL 从每组三只试点小鼠中分离成两个细胞平，并使用活性氧化磷酸化（减少线粒体）染色用于活性氧化磷酸化（ 减少线粒体）。利用另外三只小鼠的 BAL 将每个小鼠分裂成两个细胞平，用于 NK1.1/Gr1/CX3CR1 和 ATP®/Ki-67/CD61/血管他汀染色滑梯。将 BAL 从另外三只小鼠中分离成两个细胞针，分别染色 ATP® /Ly6G 和 CX3CR1/西格莱克-F。
2. 布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 和肺血管香水 （LVP） 总蛋白质定量
   1. 为了量化两个肺室（即肺间）和肺血管灌注（血管）隔间中血管屏障或相对腹压的O₃ 和LPS诱发扰动，测量收集的液体中的总蛋白质含量。
   2. 使用标准洗涤剂耐色度测定分析分析解冻的超自然成分，以达到其总蛋白质浓度。
   3. 布朗乔韦拉尔厕所 （BAL） 和肺血管灌注 （LVP） 化学素分析
      1. 接下来，使用基于33个plex磁珠的免疫分析BAL和肺血管灌注（LVP）超级牛的化疗因子。这将告知在合并暴露后确定的气道/间歇物与血管化学梯度的方向。
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory蛋白质-3测试版），RANTES（激活时受监管， 正常T细胞表达和分泌（CCL5）、CXCL-16、CXCL-12/SDF-1alpha（频闪细胞衍生因子1）、TARC（胸腺素和活化调节化学素（TARC）、TECK（蒂穆斯-表达切莫金（CCL25）和TNF®（肿瘤坏死因子阿尔法）。

4. 细胞素染色和肺组织学

1. 细胞素生化染色
   1. 用疏水笔包围细胞针，以包含在手术过程中孵化的化学物质。
   2. 在 PBS 中补充细胞针 5 分钟。
   3. 将细胞平样品固定在2%的副甲醛中10分钟，用PBS洗3次，每次洗5分钟。
   4. 用冰冷的70%的王牌渗透7分钟，再用PBS洗3次，每次5分钟。
   5. 污渍为行为素和图布林或减少米托特拉克 （孵化与混合 2 μg/50 μL 的 Alexa 488 组合法洛丁显示在绿色， 和 2 μg/μL 的 Alexa 555 共生小鼠抗α塔布林或减少米托特拉克显示为红色， 15 分钟） 。
      注意:使用小鼠IgG1同型控制抗体，在一个单独的细胞平，以验证图布林染色协议。执行与解释的 4.1.1 到 4.1.8 相同的步骤，但对于等型控件。
   6. 通过轻轻地从幻灯片上翻倒混合物来去除污渍。用 DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯林多）孵化幻灯片 5-10 分钟以弄脏核。
   7. 用 PBS 清洗细胞针 3 次，每次 5 分钟，用防褪色安装介质盖住滑动，并在成像前在室温下在黑暗中存放过夜。
   8. 在配备科学相机的宽场直立显微镜下获取图像。确保成像幻灯片时为不同的荧光通道设置一致的相机曝光时间。
2. 细胞素免疫荧光染色:
   1. 用疏水笔包围细胞针，以包含在手术过程中孵化的化学物质。在 PBS 中补充细胞针 5 分钟。
   2. 修复细胞平样品，在2%的副甲醛中孵育10分钟，用PBS洗3次，每次5分钟。
   3. 用0.1%的冷三吨X-100渗透2分钟，用PBS洗3次，每次5分钟。
   4. 接下来，Fc 通过 1:50 稀释 Fc 块抗体库存来孵育细胞针，从而阻止 15 分钟（以确保主要鼠标抗体不会与鼠标 Fc 抗体非具体交叉反应）。
   5. 提示幻灯片以去除 Fc 块，并更改为 1% BSA，用于并孵育细胞针，混合 3 种主要感兴趣的抗体（参照 表 1 表示各种组合）30 分钟。
      注意:通过执行步骤4.2.1到4.2.9，用同型控制代替抗体，与我们最近研究20中讨论的相应二级抗体并行运行同型控制抗体（与混合小鼠IgG1和大鼠^IgG2bkappa原发抗体一起孵化）。
   6. 用PBS洗3次，每次5分钟。用适当设计的二次抗体混合物孵育细胞针（详情请参阅表 1）。
   7. 通过轻轻地从滑梯上翻倒混合物来去除污渍，用 DAPI（4+，6-迪亚米迪诺-2-苯林多）孵育 5-10 分钟以弄脏核。用PBS洗3次，每次5分钟。
   8. 盖片带有防褪色安装介质，在成像前在室温下在黑暗中存放过夜。
   9. 在配备科学相机的宽场直立显微镜下获取图像。确保成像幻灯片时为所有氟磷通道设置一致的相机曝光时间。
3. 血氧林和黄素（H&E）组织学
   1. 对所有组的肺冷冻部分进行修改后的 H&E 染色^3。
4. 图像分析
   1. 处理和分析斐济图像J开放软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）中的图像数据（.tiff）文件。
   2. 检查所需的参数（区域、周边、综合密度、形状描述符、Feret 直径、圆形、显示标签），以记录在 分析 选项卡和 设置测量下。
   3. 使用 投资回报率管理器，使用"徒手选择"工具手动勾勒出合并后的图像面板中大约 50-200 个单元。使用 Ctrl+T 命令保存感兴趣的区域 （ROI），并将每个单元的保存投资回报率复制到所有氟化通道。
   4. 下一步按 Ctrl+M 测量所有荧光通道的预设参数（例如， 405 nm （蓝色 DAPI 或 ATP®），488 nm（行为或NK1.1 或 Ki-67 绿色）、568 nm（图布林或 Gr1 或 CD61 红色）和 633 nm（CX3CR1 或品红色血管他汀）。
   5. 将结果保存为.csv文件，以代表您的分析的适当名称保存。将.csv文件的结果复制到电子表格中，并根据染色设计，将染色分子的荧光强度 （FI） （即结果文件中的原始集成密度列）除以 DAPI 或 CD61 FI 的荧光强度 （FI）。这些比率称为"DAPI 或 CD61 规范化 FI 比率"。
   6. 接下来，绘制这些规范化比率、圆形、细胞周界和 Feret 直径，以评估合并 O₃ 和 LPS 暴露后细胞大小的任何变化。
   7. 使用适当的统计软件检查收集数据的正常性并测试空假设（请参阅下面的统计分析部分）。
5. 统计分析
   1. 将结果表示为平均± SEM。每组至少使用三只小鼠。
   2. 对于化学素数据分析，根据本杰明尼和霍什伯格的更正调整单向 ANOVA p 值以获得虚假发现率。
   3. 通过曼-惠特尼 U 测试（用于比较两组）或 Kruskal Wallis 测试（用于比较多个组），分析图像参数、细胞、Feret 直径、周长、DAPI 或 CD61 规范化荧光强度比，因为这些数据通常不会分布。
   4. 对于其他成像实验，使用对方差的单向分析分析结果，然后是 Sidak 的多重比较。p 值<0.05 被认为显著。

结果

O₃和 LPS的合并暴露导致系统炎症和骨髓在 72 h 时的动员:不同隔间中的细胞计数显示外周血液发生显著变化，股骨骨髓总细胞计数取决于合并 O₃和 LPS 暴露。虽然结合O₃和LPS暴露并没有诱发任何变化的总BAL（图1A）或LVP（图1B）细胞计数，多态核细胞呈现为主要细胞类型在24（图1F，补充图1），36和72小时后暴露。请注意，在 24 h BAL 细胞素图像 （图 1F）的多态核细胞中不存在西格莱克-f 和 CX3CR1 染色。BAL细胞平的三重DAPI/CD11b/Gr1染色显示存在大型CD11b-和Gr1阳性单核细胞，这些细胞在0 h时是巨噬细胞，它改变为较小的多态核细...

讨论

本研究中提出的方法突出了多个隔间分析对于研究肺部炎症期间的多个细胞事件的有用性。我们已在第 二表中总结了研究结果。我们和许多实验室广泛研究了对鼻内LPS灌输的穆林反应，其特点是肺中性粒细胞的快速招募，其峰值在6-24小时之间，随后，分辨率开始生效。最近，我们已表明，仅亚临床O_3（ 在0.05ppm为2 h）就可诱发C57BL/6NJ亚株¹⁵的显著肺损伤，其特点是肺血管隔间中嗜中性粒细胞的分割，而BAL中观察到受损的巨噬细胞和碎屑，从而表明O₃的炎症潜力。在该模型中，我们观察到由于O₃ 诱导的肺上皮损伤和肺巨噬细胞引起的噬细胞形成，在肺室中没有嗜中性粒细胞。我们不仅在O₃ 模型中观察到细胞外DNA和碎片，BAL巨噬细胞体也具有畸形，与高IL-16水平相关，这是一种通常由垂死的嗜中性粒细胞释放的警报素。因此，重要的是要了解这些亚临床O₃ 水平是否可以影响免疫反应，否则强大的C57BL/6J亚应变，如超生理O₃ 级

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
33 重 Bioplex 趋化因子检测组合	Biorad	12002231
63X 油 （NA 1.4-0.6） 显微镜物镜	Leica	HCX PL APO CS （11506188）
Alexa 350 偶联山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A11045
Alexa 488 偶联山羊抗小鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A11002
Alexa 488 偶联鬼笔环肽	Invitrogen	A12370
Alexa 555 偶联小鼠抗 α; 微管蛋白克隆 DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 偶联山羊抗仓鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A21112
Alexa 568 偶联山羊抗大鼠 IgG （H+L）	Invitrogen	A11077
Alexa 633 偶联山羊抗兔 IgG （H+L）	Invitrogen	A21070
亚美尼亚仓鼠抗 CD61（克隆 2C9.G2） IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J 小鼠	Jackson Laboratories	64
共聚焦激光扫描显微镜	徕卡	徕卡 TCS SP5
DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）	Invitrogen	D1306	等分试样 2 &微量;l 库存并存储在 -20°C;C
倒置荧光宽视场显微镜	奥林	巴斯 IX83
氯胺酮（Narketan）	Vetoquinol	100 mg/ml	稀释 10 次，制成 10 mg/ml 原
（钙黄绿素）/死（乙锭同型二聚体-1）细胞毒性试剂盒	Invitrogen	L3224
小鼠抗 ATP5A1 IgG2b（克隆 7H10BD4F9）	Invitrogen	459240
小鼠抗 ATP5&β;IgG2b（克隆 3D5AB1）	Invitrogen	A-21351
小鼠抗 NK1.1 IgG2a kappa（克隆 PK136）	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm 蛋白测定	Thermoscientific	22660
兔抗血管抑素（小鼠 aa 98-116）IgG	Abcam	ab2904
兔抗 CX3CR1 IgG（RRID 467880）	Invitrogen	14-6093-81
大鼠抗 Ki-67（克隆 SolA15）IgG2a κ	Invitrogen	14-5698-82
大鼠抗 Ly6G IgG2a κ（克隆 1A8）	Invitrogen	16-9668-82
大鼠抗 Ly6G/Ly6C （Gr1） IgG2b κ（克隆 RB6-8C5）	Invitrogen	53-5931-82
大鼠抗小鼠 CD16/CD32 Fc 阻滞（克隆 2.4G2）	BD Pharmingen	553142
减少型线粒体追踪器橙子	Invitrogen	M7511
甲苯噻嗪 （Rompun）	Bayer	20 mg/ml	稀释 2 次，制成 10 mg/ml 原液