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方法文章

可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化

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DOI：

10.3791/62097

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2021年3月21日

 ,  , 
1Small Animal Clinical Sciences, Western College of Veterinary Medicine, University of Saskatchewan

本文内容

摘要

经臭氧与细菌内毒素联合暴露的小鼠表现出广泛的细胞死亡，包括中性粒细胞的死亡。我们观察到细胞发生多种适应性变化，例如细胞骨架片状伪足结构的破坏、支气管肺泡灌洗液中复合体V ATP合酶β亚基和血管抑素的表达升高、肺部免疫反应受到抑制以及中性粒细胞募集延迟。

摘要

肺部持续面临无菌性（如颗粒物或反应性毒素）和感染性（如细菌、病毒或真菌）炎症因素带来的直接与间接损伤。过度的宿主反应可能导致呼吸功能受损及急性肺损伤，其特征是由于病理性宿主免疫反应、凝血反应及组织重塑反应引发的肺部中性粒细胞募集。为深入理解宿主的炎症与修复机制，亟需采用敏感的显微技术，以可视化并定量分析小鼠肺部细胞在低剂量（0.05 ppm）臭氧（一种强效环境污染物）联合细菌脂多糖（TLR4激动剂）刺激下的适应性变化。本文描述了一套全面的荧光显微分析方法，涵盖多种肺部及全身组织区室，包括支气管肺泡灌洗液、肺血管灌注液、左肺冷冻切片以及胸骨骨髓灌注液。我们展示了肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、肺实质组织以及骨髓细胞的损伤情况，并揭示这些变化与迟发性（长达36–72小时）免疫反应相关，该反应在所分析的各组织区室中表现为明确的趋化因子梯度。此外，我们还呈现了肺细胞外基质与细胞骨架（肌动蛋白、微管蛋白）的相互作用、线粒体与活性氧物质、抗凝血纤溶酶原、其抗血管生成肽片段血管抑素、线粒体ATP合酶复合体V的α和β亚基等指标。当这些替代性标志物与适当的 体外 基于细胞的检测方法和 体内 活体成像技术，例如活体显微镜，可为理解肺部对新型免疫调节剂的反应提供重要信息。

引言

急性肺损伤（ALI）是肺部对感染性或其他有害刺激产生的一种关键病理性反应，其特征是凝血系统、纤溶系统和先天免疫系统同时被激活1。中性粒细胞通过Toll样受体（TLR）家族迅速感知微生物及细胞内损伤的分子模式2,3,4。中性粒细胞释放预先形成的细胞因子和细胞毒性颗粒内容物，可能造成附带的组织损伤。继发的肺泡损伤伴随继发性细胞死亡，导致三磷酸腺苷（ATP）等分子的释放5，从而引发免疫失调的恶性循环。

关于急性肺损伤（ALI）机制的一个未解难题是肺泡膜内损伤如何被启动。电子传递链复合物V，即F1F0 ATP合酶，是一种线粒体蛋白，在炎症状态下可普遍表达于细胞（包括内皮细胞、白细胞、上皮细胞）的质膜上。细胞骨架由肌动蛋白和微管蛋白组成，分别携带多种调节细胞形态与功能以及线粒体相关的蛋白质。我们近期研究发现，内源性分子血管抑素（angiostatin）通过阻断ATP合酶，可抑制中性粒细胞的募集、活化以及脂多糖（LPS）诱导的肺部炎症6。因此，在肺部炎症过程中，生化机制（ATP合酶）和免疫机制（TLR4）可能共同调控肺泡屏障功能。

暴露于臭氧（O3）——一种环境污染物——会损害肺功能，增加对肺部感染的易感性，即使是短期低浓度的O3暴露，也会提高患有基础心肺疾病个体的死亡风险7,8,9,10,11,12,13,14。因此，暴露于生理相关浓度的O3为研究急性肺损伤（ALI）中炎症的基本机制提供了一个有意义的模型7,8。我们实验室近期建立了一种小鼠低剂量O3诱导的ALI模型15。在完成低浓度O3的剂量与时间反应实验后，我们发现暴露于0.05 ppm O3持续2小时可诱导急性肺损伤，其特征表现为肺组织ATP合酶复合物V亚基β（ATPβ）和血管抑素的表达，与脂多糖（LPS）模型相似。活体肺成像显示肺泡肌动蛋白微丝结构紊乱，提示肺组织损伤，同时在暴露于0.05 ppm O3 2小时后，肺泡隔内活性氧（ROS）水平降低（提示基础细胞信号传导被阻断）以及线粒体膜电位下降（提示急性细胞死亡）15，这些变化与肺部18FDG摄取的异质性分布16、中性粒细胞募集及细胞因子释放（尤其是IL-16和SDF-1α）相关。我们近期研究的核心结论是，当O3暴露浓度低于人类每日8小时暴露限值（0.063 ppm）时，其毒性呈指数级升高。重要的是，目前尚不清楚这些亚临床水平的O3暴露是否能够调节由细菌内毒素介导的TLR4相关机制17。因此，我们研究了O3与LPS双重暴露模型，并观察了免疫与非免疫细胞的适应性变化。

我们描述了一种全面的荧光显微镜分析方法，用于检测肺部及全身多个系统部位，包括支气管肺泡灌洗液（即BAL），用于取样肺泡腔；肺血管灌注液（即LVP），用于取样肺血管系统，以及在内皮屏障受损时取样肺泡隔间质；左肺冷冻切片，用于观察灌洗后残留在肺组织中的实质驻留白细胞及黏附的白细胞；外周血，代表循环中的白细胞；以及胸骨和股骨骨髓灌注液，分别用于取样炎症过程中造血细胞动员的近端和远端位点。

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方案

本研究方案经萨斯喀彻温大学动物研究伦理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会关于人道使用动物的指南。实验所用为6至8周龄雄性C57BL/6J小鼠。注意：若动物在预定实验终点前出现严重嗜睡、呼吸困难或其他严重痛苦迹象，应立即实施安乐死。

注意：准备以下物品：27-18 G 钝化针头（根据小鼠气管直径选择）、与钝针匹配的适当尺寸 PE 套管（为每只小鼠制作一个 PE 套管）、套管、2 把尖头剪刀、2 把钝头镊子（小型）、1 把尖头镊子（小型）、3 个 1 mL 注射器、已标记的微量离心管（用于收集支气管肺泡灌洗液、血液、血管和骨髓灌注液）以及已标记的样品瓶（用于组织固定）、组织收集用样本袋/冻存管、屠夫用棉线卷（剪成适当长度的结扎线）。实验中使用的所有化学试剂均在材料表中列出。

1. 臭氧和LPS暴露诱导小鼠肺损伤

  1. 臭氧暴露
    1. 制备定制的 O3 诱导箱。按顺序添加小鼠饲料、水瓶、丰富化玩具和清洁垫料，模拟小鼠的饲养环境。
      注意：这些步骤将确保小鼠在定制的诱导箱中饲养时能够自由获取食物和水，有助于减轻不必要的应激。
    2. 切换 O3 校准器/信号发生器 "开启" （放置于入口端）以提前稳定紫外灯（照射前约15分钟），并连接至在线O3 监视器
      注意：O3 监测仪读数应为平均0.05 ppm，该数值是在恒定的舱内空气温度（72 ±3 °F）和相对湿度（50±15%）条件下，从出口处采样测得。
    3. 对于 O3 暴露时，将小鼠轻轻放入定制的诱导箱中，并持续暴露于0.05 ppm O3 2小时。
  2. 麻醉与鼻内LPS给药
    1. 分别配制10 mg/mL的氯胺酮和赛拉嗪储备液。
    2. 配制混合液：将20份氯胺酮与1份赛拉嗪混合。若小鼠体重为X克，则向其腹腔注射(X/200) mL的氯胺酮/赛拉嗪混合液。为一只小鼠配制1 mL混合液，其中包含1000 µL浓度为10 mg/mL的氯胺酮储备液和50 µL赛拉嗪储备液。在微量离心管中通过反复吹打充分混匀。
      注意：氯胺酮和赛拉嗪储备液可提前一周配制。
    3. 用低剂量腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（1 mg/kg）混合液麻醉小鼠（例如，对一只25 g的小鼠注射0.125 mL该混合液）。
    4. 配制1 mg/mL的LPS生理盐水溶液，并将50 µL该溶液加入移液管中。
    5. 将小鼠竖直握住，背部（dorsal）朝向掌心，并用同一只手固定其耳朵。随后，加入50 µL的LPS溶液18 轻轻置于小鼠鼻孔外侧（即每侧鼻孔25 µL，或单侧鼻孔50 µL；只要操作迅速，具体方式不影响实验），让小鼠吸入LPS溶液。
    6. 向对照小鼠灌注50 µL无菌生理盐水。
      注意：滴注体积不得超过100 µL，否则可能致命。体积过小（即 <50 µL）时，存在仅沉积于鼻腔的风险。
    7. 给予LPS后，将小鼠轻轻放置于垫料堆上，可使其仰卧或俯卧，头部略微向下倾斜。
      注意：这种体位可延长溶液在鼻腔内的滞留时间19.
    8. 在暴露后0、2、4、24、36和72小时，通过腹腔注射以完全剂量的氯胺酮（200 mg/kg）/赛拉嗪（4 mg/kg）混合液对小鼠进行麻醉（即每50 mL混合液对应X g小鼠体重，X为小鼠体重的克数；例如，25 g小鼠注射0.50 mL）。
    9. 观察小鼠直至其失去意识且翻正反射消失（即仰卧时不再翻转身体）。此时，通过监测呼吸（胸廓节律性起伏）和心率来评估麻醉深度，1-2分钟后呼吸和心率应明显下降。
    10. 接下来，检查足底反射，即捏住后肢任意一个脚趾，观察肢体是否因反射而回缩。如果小鼠有反应，则根据需要追加0.1 mL或更多的麻醉剂注射。
      ​注意：为达到深度麻醉，需注意某些品系或肥胖小鼠通常具有较大的分布容积，若未给予足够时间使麻醉充分起效（可能需要约10分钟或更长时间），容易发生过量给药。相应地，某些品系小鼠可能对麻醉具有抵抗性，因而需要追加给药。这些经验源于对不同品系和年龄小鼠的大量实际观察与操作经验。部分预实验也在O后立即进行3 以及LPS暴露（即在2小时时间点），我们还纳入了这些实验中一些极早期的BAL细胞分析，以突出O联合暴露的即时效应3以及LPS暴露。

2. 样品采集

  1. 将小鼠置于手术托盘上。随后，轻轻在双眼上涂抹润滑眼膏以防止体液流失，并用70%乙醇喷雾对小鼠进行消毒。
    1. 用剪刀在上下皮肤膜上做小切口，以暴露气管和胸腔。
    2. 在胸骨下方稍作切割，暴露心脏。
  2. 心脏穿刺
    1. 将连接肝素化注射器的25G针头插入右心室，通过心脏穿刺采集血液。
      ​注意：若从暴露心脏到进行心脏穿刺的时间少于1分钟，通常只需轻微回抽注射器活塞即可采血。采集约0.4–0.5 mL后，可能需要暂停数秒再继续采集剩余血液，以便心脏将残余血量泵入右心室。血液采集结束时，心脏停止搏动。
    2. 采集血液并储存于微量离心管中，以备后续处理。
  3. 气管切开术
    1. 使用镊子或钝头镊子仔细清除覆盖在气管区域的组织。尽量用手套操作而非手术器械，以避免出血。若出现大量渗血，则存在污染支气管肺泡灌洗（BAL）样本的风险。必要时可使用棉签，但不推荐；Kimwipe 纸巾是更佳的替代选择。
    2. 现在，切开肋骨以暴露肺部。同样要注意 谨慎的 避免切割胸骨、肋间动脉或升主动脉；在通过肋骨 cage 时应进行较小的切口
    3. 在气管切口下方穿过一根棉线结扎线，并暂时保持此状态。
    4. 在远端1/3处的合适位置剪断气管rd 部分，朝向肺部，以便插入28 G气管插管。
    5. 将一根28 G的PE导管（长度至少3-5 mm，远端修剪以方便插入）插入气管。注意观察气管分叉前的末端，插入后回拉约1 mm，以避免仅采集单个肺叶的样本。
    6. 牢固地用棉线结扎以固定套管，切勿压扁套管。
  4. 支气管肺泡灌洗（BAL）
    1. 在1 mL注射器中加入0.5 mL PBS。
    2. 现在借助1 mL注射器，缓慢向套管中注入0.5 mL PBS。
    3. 注入 PBS 后，只要不遇到吸力阻力，应持续抽吸出注射器中的液体。
      注意：若在抽吸支气管肺泡灌洗液时遇到阻力，表明肺泡或支气管组织可能已塌陷。此时，应将套管略微回撤，使套管脱离组织壁。
    4. 将吸出的液体收集到标记好的微量离心管中，并置于冰上。
    5. 以相同方式再进行两次灌洗，收集至同一离心管中（即总共 0.5 × 3 = 1.5 mL 灌洗液）。
    6. 测量收集的支气管肺泡灌洗液（BAL）体积。灌洗回收率应接近90%。
  5. 肺血管灌注液（LVP）
    1. 在胸段与腹段交界处之间的位置切断降主动脉，以避免通过右心室灌注时灌注液反流至肺部。
    2. 用吸水纸吸干靠近切断的主动脉端的腔内血液。
    3. 接下来，通过右心室注入0.5 mL室温肝素化生理盐水灌注肺脏。
    4. 在冰上放置的微量离心管中收集降主动脉断端腔内的血管灌流液，并测量其体积。
    5. 用棉线结扎右支气管在距其自气管分出处的近端位置。
  6. 原位左肺固定
    1. 将1 mL注射器连接至气管插管，该插管长度足以通过先前的气管切口插入。
    2. 将注射器活塞回抽至0.6 mL刻度处。
    3. 然后，用室温的2%多聚甲醛将另一支注射器完全充满（直至末端）。确保推动活塞时能顺利推出，且不会从套管中回吸空气。
    4. 现在，用透明胶带将注射器固定在一个直立的容器上，该容器高度标记至20 cm。
    5. 轻柔地抽出活塞，使固定液流向气管。若套管中存在少量气泡，可将活塞轻轻置于注射器顶端，数秒后液体即开始流动。
    6. 让左肺在原位膨胀至其总容量, 5分钟，从20厘米高度形成20厘米水柱。
    7. 在此操作过程中，务必保护右肺叶，避免其接触多聚甲醛，否则将影响后续实验。
    8. 将折叠的实验室纸巾放置好，以吸收可能接触到右肺叶的多聚甲醛。
      ​警告：多聚甲醛具有高毒性，切勿吸入或接触身体任何暴露部位。操作时需格外小心。
    9. 在多聚甲醛灌注期间，对腹部进行消毒。
    10. 将右肺叶从气管处剪下，确保去除任何缝线，并立即将肺叶放入已标记的冻存管中，迅速投入液氮中，用于后续分子/生化细胞因子分析、RT-PCR或肺组织匀浆的Western blot分析。
    11. 小心修剪左肺，去除任何结缔组织或胸膜，并将其浸入4 °C的2%多聚甲醛中固定24小时。
    12. 按照标准包埋方案将固定肺组织包埋于石蜡中。
      注意：切勿过度加热肺组织样本。
    13. 从骨盆（髋）骨处切开腹部并剥离皮肤。
    14. 在盛有生理盐水并置于冰上的培养皿中，将左侧和右侧股骨从骨盆部分分离出来。
  7. 胸骨和股骨骨髓穿刺液采集
    1. 使用实验室用纸巾将组织和肌肉从骨骼上清理干净。
    2. 将腹侧肋骨和胸骨收集到盛有生理盐水并置于冰上的培养皿中。
    3. 剪除胸骨和股骨的远端和近端尖端。
    4. 用装有合适针头（24至28 G）的1 mL注射器，以0.5 mL生理盐水对骨骼灌注4次，将每根骨骼的灌注液分别收集至预装滤器并置于冰上的带标签试管中。
      注意：针头规格因动物体型而异。冲洗后，股骨应呈现透明状。
    5. 样本采集完毕后，将小鼠装入塑料袋中，并置于动物尸体冰箱内冷冻，以备按照机构动物设施的指南进行妥善处理。

3. 样品处理

  1. 总白细胞计数（TLC）和差异白细胞计数（DLC）
    1. 将外周血、支气管肺泡灌洗液（BAL）、肺血管灌注液和骨髓（胸骨和股骨）样本在500 g条件下离心10分钟。
    2. 收集上清液，迅速冷冻后于-80 °C保存，待后续分析使用。
    3. 用至少200 µL的PBS重悬细胞。
    4. 使用血细胞计数板对BAL、血液、肺血管灌注液和骨髓细胞进行TLC计数。
    5. 取另一份9 µL的BAL样本，加入1 µL的钙黄绿素绿与红荧光染料乙锭同型二聚体-1混合液，用于定量活细胞（绿色，因细胞内酯酶活性）以及膜完整性受损的BAL细胞（红色）。
    6. 加入2%乙酸以裂解红细胞，血液TLC按1:10比例加入，肺血管灌注液TLC按1:2比例加入。
      注意：若细胞浓度超过1×106个细胞/mL（骨髓样本尤其重要），需用PBS稀释调整细胞浓度。
    7. 离心细胞后制备细胞涂片（cytospin），并按以下说明进行染色，用于DLC分析。每份样本至少计数100个细胞以完成差异白细胞分类计数。
      备注：通常可在一张载玻片上制备两个细胞涂片。空气干燥10–15分钟后，即可进行染色步骤。
    8. 将每组三只预实验小鼠收集的BAL样本分别分成两份，每份制备一个细胞涂片，分别用于肌动蛋白/微管蛋白及具有活性氧化磷酸化的线粒体（还原型Mitotracker）染色。另取三只小鼠的BAL样本，同样每份分成两个涂片，分别用于NK1.1/Gr1/CX3CR1和ATPβ/Ki-67/CD61/血管抑素染色。再取三只小鼠的BAL样本，分成两个涂片，分别用于ATPα/Ly6G和CX3CR1/Siglec-F染色。
  2. 支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺血管灌注液（LVP）总蛋白定量
    1. 为评估臭氧（O3）和脂多糖（LPS）暴露对肺部两个腔室（即肺泡间隔（间质）腔室和肺血管灌注液（血管）腔室）血管屏障功能或相对胶体渗透压的干扰情况，需测定所收集液体中的总蛋白含量。
    2. 采用标准的去垢剂耐受性比色法，分析解冻后的上清液部分的总蛋白浓度。
    3. 支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺血管灌注液（LVP）趋化因子分析
      1. 接下来，使用基于33重磁珠的免疫检测试剂盒分析BAL和肺血管灌注液（LVP）上清中的趋化因子，以了解联合暴露后气道/间质与血管之间趋化因子梯度的方向性。
      2. 检测以下趋化因子组合：CXCL13（B淋巴细胞趋化因子）、CCL27（IL-11受体α位点趋化因子，ILC）、CXCL5（上皮源性中性粒细胞活化肽78，ENA-78）、CCL-11（嗜酸性粒细胞趋化因子-1）、嗜酸性粒细胞趋化因子-2（CCL-24）、CX3CL1（fractalkine）、GM-CSF（CSF-2）、CCL1、IFNγ（干扰素γ）、IL-10（白细胞介素-10）、IL-16（白细胞介素-16）、IL-1β（白细胞介素-1β）、IL-2（白细胞介素-2）、IL-4（白细胞介素-4）、IL-6（白细胞介素-6）、CXCL-10（干扰素γ诱导蛋白10，IP-10）、CXCL11（干扰素γ诱导蛋白9，IP-9）、KC（角质形成细胞趋化因子）、MCP-1（单核细胞趋化蛋白-1）、MCP-3（单核细胞趋化蛋白-3）、MCP-5（单核细胞趋化蛋白-5）、MDC（巨噬细胞来源趋化因子，CCL22）、MIP-1α（巨噬细胞炎症蛋白-1α）、MIP-1β（巨噬细胞炎症蛋白-1β）、MIP-2（巨噬细胞炎症蛋白-2）、MIP-3α（巨噬细胞炎症蛋白-3α）、MIP-3β（巨噬细胞炎症蛋白-3β）、RANTES（活化T细胞正常表达和分泌蛋白，CCL5）、CXCL-16、CXCL-12/SDF-1α（基质细胞衍生因子1）、TARC（胸腺和活化调节趋化因子，TARC）、TECK（胸腺表达趋化因子，CCL25）和TNFα（肿瘤坏死因子α）。

4. 细胞离心涂片染色和肺组织学

  1. 细胞涂片生化染色
    1. 使用疏水笔在细胞涂片周围画圈，以在操作过程中限制孵育试剂的扩散。
    2. 在 PBS 中重水化细胞涂片 5 分钟。
    3. 将细胞涂片样本在 2% 多聚甲醛中固定 10 分钟，随后用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
    4. 用预冷的 70% 丙酮透化 7 分钟，再用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
    5. 对肌动蛋白和微管蛋白或还原型 Mitotracker 进行染色（分别加入 2 µg/50 µL 的 Alexa 488 标记鬼笔环肽（绿色）和 2 µg/µL 的 Alexa 555 标记小鼠抗-α 微管蛋白抗体或还原型 Mitotracker（红色）混合液），孵育 15 分钟。
      ​注意：使用小鼠 IgG1 同型对照抗体，在另一张细胞涂片上进行实验，以验证微管蛋白染色方案。从步骤 4.1.1 至 4.1.8 执行相同操作，但使用同型对照。
    6. 轻轻倾斜玻片以去除染液。将玻片与 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）孵育 5–10 分钟以染色细胞核。
    7. 用 PBS 洗涤细胞涂片三次，每次 5 分钟，加盖抗荧光淬灭封片剂，于室温避光保存过夜后再进行成像。
    8. 在配备科研级相机的宽场直立显微镜下采集图像。成像时确保不同荧光通道的相机曝光时间保持一致。
  2. 细胞涂片免疫荧光染色：
    1. 使用疏水笔在细胞涂片周围画圈以限制孵育试剂的扩散。在 PBS 中重水化细胞涂片 5 分钟。
    2. 将细胞涂片样本在 2% 多聚甲醛中孵育 10 分钟进行固定，随后用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
    3. 用 0.1% 冷 Triton X-100 透化 2 分钟，再用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
    4. 接着，通过将细胞涂片与 Fc 封闭抗体原液按 1:50 稀释后孵育 15 分钟进行 Fc 封闭（以确保一抗小鼠抗体不会非特异性地与小鼠 Fc 受体交叉反应）。
    5. 倾斜玻片去除 Fc 封闭液，更换为 1% BSA，并将细胞涂片与三种目标一抗混合液（具体组合参见 表 1）孵育 30 分钟。
      注意：务必平行运行同型对照抗体实验（使用小鼠 IgG1 和大鼠 IgG2b kappa 一抗混合液替代目标抗体，执行步骤 4.2.1 至 4.2.9，并使用相应的二抗），详见我们近期的研究20。
    6. 用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。将细胞涂片与适当设计的二抗混合液孵育（详情请参见 表 1）。
    7. 轻轻倾斜玻片去除染液，加入 DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）孵育 5–10 分钟以染色细胞核。再用 PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
    8. 加盖抗荧光淬灭封片剂，于室温避光保存过夜后再进行成像。
    9. 在配备科研级相机的宽场直立显微镜下采集图像。成像时确保所有荧光染料通道的相机曝光时间设置一致。
  3. 苏木精-伊红（H&E）组织学染色
    1. 对所有组别的肺冷冻切片进行改良的 H&E 染色3。
  4. 图像分析
    1. 在 Fiji ImageJ 开源软件（https://imagej.net/Fiji/Downloads）中处理和分析图像数据（.tiff 文件）。
    2. 在 分析 选项卡下的 设置测量值 中，勾选需要记录的参数（面积、周长、积分密度、形态描述符、Feret 直径、圆形度、显示标签）。
    3. 使用 ROI 管理器，在合并图像面板中利用 "自由手选区" 工具手动勾勒约 50–200 个细胞。使用 Ctrl+T 命令保存感兴趣区域（ROI），并将每个细胞的 ROI 复制到所有荧光通道中。
    4. 接着按下 Ctrl+M，测量所有荧光通道的预设参数（例如：405 nm（DAPI 或 ATPβ，蓝色）、488 nm（肌动蛋白、NK1.1 或 Ki-67，绿色）、568 nm（微管蛋白、Gr1 或 CD61，红色）和 633 nm（CX3CR1 或血管抑素，品红色））。
    5. 将结果另存为 .csv 文件，并赋予能反映分析内容的适当文件名。将 .csv 文件中的结果复制到电子表格中，根据染色设计，将目标分子的荧光强度（FI）（即结果文件中的“原始积分密度”列）除以 DAPI 或 CD61 的 FI 值。这些比值称为 "DAPI 或 CD61 标准化的 FI 比值"。
    6. 随后绘制这些标准化比值、圆形度、细胞周长和 Feret 直径，以评估联合 O3 与 LPS 暴露后细胞大小的变化。
    7. 使用适当的统计软件检验数据的正态性，并检验零假设（详见下文统计分析部分）。
  5. 统计分析
    1. 结果以均值 ± 标准误（SEM）表示。每组至少使用三只小鼠。
    2. 在趋化因子数据分析中，根据 Benjamini 和 Hochberg 校正法对单因素方差分析（one-way ANOVA）的 p 值进行假发现率调整。
    3. 由于图像参数、细胞数量、Feret 直径、周长以及 DAPI 或 CD61 标准化的荧光强度比值数据不符合正态分布，采用 Mann-Whitney U 检验（用于两组比较）或 Kruskal-Wallis 检验（用于多组比较）进行分析。
    4. 对于其余成像实验，采用单因素方差分析，随后进行 Sidak 多重比较校正。p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

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结果

联合O3 LPS暴露在72小时引起全身性炎症和骨髓动员： 不同区室中的细胞计数显示，联合O处理后，外周血和股骨骨髓的总细胞数发生显著变化3 以及LPS暴露。尽管联合O3 且LPS暴露未引起BAL总量的任何变化（图1A）或 LVP（图1B) 细胞计数，24小时时以多形核细胞为主要细胞类型图1F，补充图1），暴露后24小时、36小时和72小时。请注意，在24小时支气管肺泡灌洗液（BAL）细胞涂片图像中，多形核细胞无Siglec-f和CX3CR1染色。图1F). BAL 细胞离心涂片的三重 DAPI/CD11b/Gr1 染色显示，0 h 时存在大量 CD11b 和 Gr1 阳性的单核细胞，即...

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讨论

本研究中所展示的方法突显了多区室分析在研究肺部炎症过程中多种细胞事件中的实用性。我们已在表2中总结了相关发现。我们以及多个实验室已广泛研究了小鼠对鼻内滴注脂多糖（LPS）的反应，该反应以肺中性粒细胞的快速募集为特征，其峰值出现在6–24小时之间，随后进入缓解阶段。最近，我们发现亚临床浓度的臭氧（O3，0.05 ppm，持续2小时）单独即可在C57BL/6NJ亚系中诱导显著的肺损伤15，其特征为中性粒细胞在肺血管区室中的分布，而支气管肺泡灌洗液（BAL）中则观察到受损的巨噬细胞和细胞碎片，表明O3具有促炎潜力。在该模型中，由于O3诱导的肺泡上皮损伤以及肺泡巨噬细胞随之发生的吞噬作用，我们在肺泡区室中未观察到中性粒细胞。在O3模型中，我们不仅观察到细胞外DNA和碎片的存在，还发现BAL中的巨噬细胞形态异常，且与高水平的IL-16相关——IL-16是一种通常由凋亡中性粒细胞释放的警报素。因此，了解这些亚临床水平的O3是否会影响原本健壮的C57BL/6J亚...

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披露

作者无任何利益冲突或需要披露的事项。

致谢

本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）总统资助计划以及加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心的启动资金资助。加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心由萨斯喀彻温省创新基金（Innovation Saskatchewan）资助。荧光成像在WCVM影像中心完成，该中心由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助。杰西卡·布罗科斯（Jessica Brocos，理学硕士生）和曼普丽特·考尔（Manpreet Kaur，理学硕士生）由加拿大西尔维娅·费多鲁克核创新中心的启动资金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
33-重生物plex趋化因子检测试剂盒Biorad12002231
63X油镜（NA 1.4-0.6）显微镜物镜LeicaHCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）InvitrogenA11045
Alexa 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）InvitrogenA11002
Alexa 488标记的鬼笔环肽InvitrogenA12370
Alexa 555标记的小鼠抗α微管蛋白单克隆抗体DM1AMillipore05-829X-555
Alexa 568标记的山羊抗仓鼠IgG（H+L）InvitrogenA21112
Alexa 568标记的山羊抗大鼠IgG（H+L）InvitrogenA11077
Alexa 633标记的山羊抗兔IgG（H+L）InvitrogenA21070
Armenian hamster抗CD61（克隆2C9.G2）IgG1 kappaBD Pharmingen553343
C57BL/6 J小鼠Jackson Laboratories64
共聚焦激光扫描显微镜LeicaLeica TCS SP5
DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）InvitrogenD1306分装为2 µl储存液，保存于-20°C
倒置荧光宽场显微镜OlympusOlympus IX83
氯胺酮（Narketan）Vetoquinol100 mg/ml稀释10倍，配制成10 mg/ml储存液
活/死细胞毒性检测试剂盒（钙黄绿素/溴化乙锭同型二聚体-1）InvitrogenL3224
小鼠抗ATP5A1 IgG2b（克隆7H10BD4F9）Invitrogen459240
小鼠抗ATP5β IgG2b（克隆3D5AB1）InvitrogenA-21351
小鼠抗NK1.1 IgG2a kappa（克隆PK136）Invitrogen16-5941-82
Pierce 660 nm蛋白质定量试剂盒Thermoscientific22660
兔抗血管抑素（小鼠aa 98-116）IgGAbcamab2904
兔抗CX3CR1 IgG（RRID 467880）Invitrogen14-6093-81
大鼠抗Ki-67（克隆SolA15）IgG2a kappaInvitrogen14-5698-82
大鼠抗Ly6G IgG2a kappa（克隆1A8）Invitrogen16-9668-82
大鼠抗Ly6G/Ly6C（Gr1）IgG2b kappa（克隆RB6-8C5）Invitrogen53-5931-82
大鼠抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断抗体（克隆2.4G2）BD Pharmingen553142
还原型MitoTracker OrangeInvitrogenM7511
赛拉嗪（Rompun）Bayer20 mg/ml稀释2倍，配制成10 mg/ml储存液

参考文献

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臭氧暴露脂多糖诱导损伤小鼠肺模型荧光显微镜支气管肺泡灌洗中性粒细胞募集趋化因子梯度肺泡巨噬细胞活体显微成像
可视化臭氧与脂多糖联合诱导的小鼠急性肺损伤过程中的肺细胞适应性变化
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