严重卵巢功能障碍患者的生育力保存

摘要

我们介绍了针对卵巢功能严重障碍患者进行无药物体外激活（IVA）卵巢卵泡的实验室操作步骤。该方法可增加每次卵巢超促排卵中可获取的卵母细胞数量，有助于此类患者的生育力保存。

摘要

卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理条件下会逐渐衰退，这些条件包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗，以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存对其未来妊娠至关重要。尽管卵母细胞冷冻保存是目前公认的生育力保存方法，但即使经过卵巢促排卵刺激，这些患者也只能保存有限数量的卵母细胞，因此需要多次重复刺激以获得足够数量的卵母细胞，从而确保未来的妊娠机会。为解决这一问题，我们近期开发了一种无需药物的体外激活（IVA）技术，该技术可促使卵巢卵泡的早期阶段发育至前窦卵泡阶段。这些前窦卵泡能够对独特的促性腺激素刺激方案产生反应，从而在每次卵巢刺激中获得更多的可采集卵母细胞用于冷冻保存。这种无药物IVA技术包括外科操作和卵巢刺激两个部分。我们在腹腔镜手术下从患者单侧或双侧卵巢中取出部分皮质组织，将卵巢皮质组织切成小块，以破坏Hippo信号通路并促进早期卵泡的发育。随后将这些组织小块原位移植回残留的卵巢组织中，并移植至双侧输卵管浆膜下。我们此前已发表过无药物IVA的外科手术步骤及后续卵巢刺激方案，但本文将详细介绍实施无药物IVA所必需的实验室操作方法。

引言

卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理状态下会逐渐衰退，这些状态包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗、以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存是保留其未来妊娠潜力的最佳选择之一。目前，生育力保存主要在肿瘤生殖医学领域有两种常用方法。卵母细胞冷冻保存是一种成熟的生育力保存技术，已有大量成功案例报道^1,2。另一方面，卵巢组织冷冻保存也已在癌症患者中用于生育力保存，但目前仍属于实验性策略^3,4。这两种方法均需要获取多个成熟卵母细胞才能实现妊娠。通常，早发性卵巢功能不全（POI）患者（即40岁之前出现闭经）以及卵巢储备功能低下的中年女性，对促排卵刺激的反应较差^5,6,7。此外，窦卵泡数量较少的年轻患者也表现出对卵巢刺激的低反应⁷。这些患者即使经过充分的卵巢高刺激，可获得的卵母细胞数量仍极为有限，因此需要多次昂贵的治疗过程，以确保获得足够数量的卵母细胞用于妊娠。

对于难以获得自身卵母细胞的早发性卵巢功能不全（POI）和卵巢反应低下（POR）患者，使用供卵者卵母细胞，结合丈夫精子进行体外受精（IVF）并实施胚胎移植（ET），是目前唯一的治疗选择^8,9,10。然而，供卵治疗存在伦理问题，并可能引发自身免疫反应及妊娠相关并发症^11,12,13,14。为解决上述问题，亟需建立利用患者自身卵母细胞进行不孕治疗的新方法。针对POI患者，我们已开发出体外激活（IVA）技术，可有效促进卵泡生长并获得成熟卵母细胞，已成功实现多次妊娠与分娩¹⁵。在IVA过程中，我们通过腹腔镜手术切除卵巢后，将卵巢皮质组织进行机械切割成碎片，随后使用Akt通路激活药物进行为期两天的体外培养以激活卵泡，再通过第二次腹腔镜手术，将组织移植回输卵管浆膜下人工创建的异位移植袋中¹⁵。该操作通过卵巢皮质碎片化促进原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡的生长，其机制涉及Hippo信号通路的中断¹⁶，随后通过两天的Akt信号通路激动剂培养进一步增强卵泡激活效果¹⁷。

与严重的原发性卵巢功能不全（POI）病例不同，卵巢反应低下（POR）且卵巢储备功能减退的患者通常存在多个次级卵泡。由于单独破坏Hippo信号通路已能有效促进次级卵泡的生长¹⁶，我们近期已证明，对于POR患者，采用无需药物的IVA技术（即仅通过卵巢皮质切割与原位移植，而不使用Akt激活药物）可成功实现妊娠并分娩。无需药物的IVA技术仅需一次手术即可刺激卵巢早期卵泡发育至前窦卵泡阶段，并增加可用于体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的获卵数量^15,18。与我们最初版本的IVA相比，无需药物的IVA具有多项优势：1）避免了体外培养过程中潜在的卵泡丢失；2）减少了二次手术的侵入性与成本；3）术后仅需短期卧床休息；4）由于采用原位移植，存在自然妊娠的可能性。我们近期发表了一篇视频文章，展示了无需药物IVA的手术操作流程¹⁹以及术后卵巢刺激的详细方案²⁰。本文中，我们介绍了实施无需药物IVA所需的实验室方法细节。

方案

所有参加无药物IVA治疗的卵巢储备功能减退POR患者均签署了书面知情同意书。本研究已获得国际健康福利大学伦理委员会的批准（编号：17-S-21）。临床试验注册号为UMIN000034464，并依照世界医学协会《医学伦理守则》（赫尔辛基宣言）进行。

1. 卵巢皮质提取

1. 在全身麻醉下，通过腹腔镜手术从一个或两个卵巢中取出部分卵巢皮质组织（10 × 10 mm，厚 2–3 mm），操作方法如先前所述^19,20。
2. 将采集的卵巢皮质组织置于含有 10 mL 改良HTF（mHTF）的无菌容器中，保持温度为 37 °C。

2. 卵巢皮质碎裂

注意：在解剖卵巢皮质之前，将 mHTF 预热至 37 °C。整个操作过程中须保持无菌条件。本实验所需所有工具均列于材料表中。

1. 将收集的卵巢皮质组织置于含有 5–10 mL mHTF 的塑料培养皿中，于 37 °C 条件下放置在加热板上，以维持组织温度为 37 °C（图 2A）。
2. 在开始下一步操作前，使用数码相机拍摄每块皮质组织，并标注患者姓名，以便关联患者的背景资料。
3. 将单个卵巢皮质组织放置于经 mHTF 润湿的无菌纱布上（图 2B）。
   注意：在此操作过程中，可使用一次性移液管向纱布上补充适量 mHTF，以防止皮质组织表面干燥。
4. 使用显微剪刀去除呈粉红色的残余髓质组织，使组织厚度达到 1–2 mm（图 2C 和 D）。
   注意：为避免早期卵泡丢失，不要将皮质条切成小于 1 mm 的厚度，因为早期阶段的卵泡位于卵巢皮质表面下 1–2 mm 范围内²¹。
5. 使用精细手术刀从每条卵巢皮质组织上切取 1 mm × 1 mm × 5 mm 的组织样本，并进行组织学分析，以确定是否存在残留卵泡，方法如前所述¹⁸（图 2E）。
   注意：用于组织学分析的组织样本应浸入 mHTF 中，并在 4 °C 保存直至固定（图 2F，见步骤 4）。
6. 使用精细手术刀将皮质组织切成 1 mm × 1 mm × 10 mm 的条状（图 2G）。
   注意：切割时向下按压手术刀比拖拉更易于操作。
7. 将这些组织条进一步切成 1 mm × 1 mm × 1 mm 的小立方体（图 2H）。
   注意：为避免培养基中渗透压发生变化，在进行组织自体移植前应适量添加 mHTF。

3. 卵巢皮质碎片自体移植

1. 打开IVA套管针的包装，将其放置在无菌敷布上。
2. 通过反复抽吸和排出mHTF，用mHTF冲洗IVA套管针内部。
3. 抽吸100–200 µL的mHTF，填充IVA套管针的尖端，以避免在装载过程中皮质立方体干燥（图3A）。
4. 使用精细镊子将皮质立方体装入IVA套管针的尖端（图3B-E）。
   注意：装载的皮质立方体数量取决于移植部位。通常可将20–30个立方体移植至原位残留卵巢，而10–15个立方体可移植至输卵管浆膜下袋状区域。
5. 装载皮质立方体后，在将IVA套管针移交给外科医生前，用手指握住含有皮质立方体的套管针尖端，以避免立方体温度下降。
   ​注意：腹腔镜手术下自体移植操作的详细步骤已有前期报道¹⁹。针对卵巢皮质立方体的移植，本研究合作者Kitazato Corporation开发了一种管状装置（IVA套管针）。

4. 卵巢皮质的组织学分析

注意：为了计数残留卵泡的数量，需按照先前所述方法进行组织学分析¹⁵。

1. 在样本固定前，使用组织标记染料标记皮质条的表面，以指示组织条中皮质一侧，便于后续组织学分析。
2. 使用Bouin溶液在4 °C下过夜固定组织条。
   注意：为检测闭锁卵泡，不建议使用多聚甲醛固定，以避免卵母细胞胞质收缩。
3. 将组织条进行脱水并包埋于石蜡中。
4. 对含有组织样本的石蜡块进行连续切片。
5. 使用苏木精和伊红对每张切片染色，以观察卵泡结构。
6. 按照先前描述的方法计数卵泡¹⁷。

结果

在IVA技术的首次发表中¹⁵，我们通过腹腔镜手术将卵巢皮质组织块逐一移植至移植部位（图1A）。由于使用了100–150个卵巢组织块，腹腔镜下的组织移植过程耗时3–4小时，且部分卵巢组织块在移植前即已丢失。由于IVA穿刺导管可一次性将20–30个组织块输送至移植部位（图1B），我们将手术时间缩短至1–2小时。此外，IVA穿刺导管还可避免卵巢皮质组织块在手术过程中的丢失。

图1：IVA套管的有效性。（A

讨论

在本论文中，我们展示了一种无药物IVA的详细实验室方案。无药物IVA是一种针对卵巢储备功能减退的难治性卵巢反应不良（POR）患者的新型不孕症治疗方法，旨在促进次级卵泡的生长，从而在卵巢刺激后获得更多的成熟卵母细胞，并提高成功妊娠的几率²⁰。在15例卵巢储备功能减退的POR患者中，该方法实现了1例自然妊娠，通过体外受精-胚胎移植技术获得了4例活产，另有1例持续妊娠¹⁹。

为制备用于移植的卵巢皮质组织，使用显微剪刀去除髓质组织，保留1-2 mm厚度的皮质。此前，我们已证实，在卵巢储备功能正常的患者中，原始卵泡、初级卵泡以及大部分次级卵泡均位于卵巢皮质表面下1 mm以内的区域²¹。在早发性卵巢功能不全（POI）患者中，我们发现次级卵泡位于皮质表面下超过1 mm但不超过2 mm的深度²¹。已知窦状卵泡主要位于髓质组织中²¹，但在POI患者的髓质组织中并未...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4.5 盎司标本容器	FALCON	354013	其他产品也可能适用
60 毫米培养皿	FALCON	351007	其他产品也可能适用
50 x 50 厘米无菌铺巾	HOGY Medical	SR-823	任何类型的无菌产品也可能适用
一次性移液管	FALCON	357575	其他产品也可能适用
精细剪刀，弯型	WPI	#14224-G	尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品
加热板	TOKAI HIT	TPiE-SP	在手术室中用于维持移植前含卵巢组织的培养皿温度
人血清白蛋白溶液	Irvine Scientific	9988	用于处理卵巢组织的培养基
IVA 套管针	KITAZATO	446030 IVA-6030E	专用于组织自体移植的套管针
KAI 医用一次性手术刀	WPI	#5 10-A	尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品
显微剪刀，弯型	WPI	#503364	尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品
改良 HTF 培养基-HEPES	Irvine Scientific	90126	用于处理卵巢组织的培养基
无菌纱布	Osaki Medical	15004	任何类型的无菌产品也可能适用
瑞士镊子，弯头尖端	KAI	#504505	尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品