我们介绍了针对卵巢功能严重障碍患者进行无药物体外激活（IVA）卵巢卵泡的实验室操作步骤。该方法可增加每次卵巢超促排卵中可获取的卵母细胞数量，有助于此类患者的生育力保存。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理条件下会逐渐衰退，这些条件包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗，以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存对其未来妊娠至关重要。尽管卵母细胞冷冻保存是目前公认的生育力保存方法，但即使经过卵巢促排卵刺激，这些患者也只能保存有限数量的卵母细胞，因此需要多次重复刺激以获得足够数量的卵母细胞，从而确保未来的妊娠机会。为解决这一问题，我们近期开发了一种无需药物的体外激活（IVA）技术，该技术可促使卵巢卵泡的早期阶段发育至前窦卵泡阶段。这些前窦卵泡能够对独特的促性腺激素刺激方案产生反应，从而在每次卵巢刺激中获得更多的可采集卵母细胞用于冷冻保存。这种无药物IVA技术包括外科操作和卵巢刺激两个部分。我们在腹腔镜手术下从患者单侧或双侧卵巢中取出部分皮质组织，将卵巢皮质组织切成小块，以破坏Hippo信号通路并促进早期卵泡的发育。随后将这些组织小块原位移植回残留的卵巢组织中，并移植至双侧输卵管浆膜下。我们此前已发表过无药物IVA的外科手术步骤及后续卵巢刺激方案，但本文将详细介绍实施无药物IVA所必需的实验室操作方法。
引言
卵巢功能在衰老过程中以及某些病理生理状态下会逐渐衰退，这些状态包括核型异常、自身免疫性疾病、化疗和放疗、以及卵巢手术。对于患有严重卵巢功能障碍的未婚女性而言，生育力保存是保留其未来妊娠潜力的最佳选择之一。目前，生育力保存主要在肿瘤生殖医学领域有两种常用方法。卵母细胞冷冻保存是一种成熟的生育力保存技术，已有大量成功案例报道1,2。另一方面，卵巢组织冷冻保存也已在癌症患者中用于生育力保存，但目前仍属于实验性策略3,4。这两种方法均需要获取多个成熟卵母细胞才能实现妊娠。通常，早发性卵巢功能不全（POI）患者（即40岁之前出现闭经）以及卵巢储备功能低下的中年女性，对促排卵刺激的反应较差5,6,7。此外，窦卵泡数量较少的年轻患者也表现出对卵巢刺激的低反应7。这些患者即使经过充分的卵巢高刺激，可获得的卵母细胞数量仍极为有限，因此需要多次昂贵的治疗过程，以确保获得足够数量的卵母细胞用于妊娠。
对于难以获得自身卵母细胞的早发性卵....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有参加无药物IVA治疗的卵巢储备功能减退POR患者均签署了书面知情同意书。本研究已获得国际健康福利大学伦理委员会的批准（编号：17-S-21）。临床试验注册号为UMIN000034464，并依照世界医学协会《医学伦理守则》（赫尔辛基宣言）进行。
1. 卵巢皮质提取
- 在全身麻醉下，通过腹腔镜手术从一个或两个卵巢中取出部分卵巢皮质组织（10 × 10 mm，厚 2–3 mm），操作方法如先前所述19,20。
- 将采集的卵巢皮质组织置于含有 10 mL 改良HTF（mHTF）的无菌容器中，保持温度为 37 °C。
2. 卵巢皮质碎裂
注意：在解剖卵巢皮质之前，将 mHTF 预热至 37 °C。整个操作过程中须保持无菌条件。本实验所需所有工具均列于材料表中。
- 将收集的卵巢皮质组织置于含有 5–10 mL mHTF 的塑料培养皿中，于 37 °C 条件下放置在加热板上，以维持组织温度为 37 °C（图 2A）。
- 在开始下一步操作前，使用数码相机拍摄每块皮质组织，并标注....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
在IVA技术的首次发表中15，我们通过腹腔镜手术将卵巢皮质组织块逐一移植至移植部位（图1A）。由于使用了100–150个卵巢组织块，腹腔镜下的组织移植过程耗时3–4小时。此外，部分卵巢组织块在移植前即已丢失。由于IVA套管针可一次性将20–30个组织块转移至移植部位（图1B），我们将手术时间缩短至1–2小时。此外，IVA套管针还可避免卵巢皮质组织块在手术过程中的丢失。
图 1：IVA 套管的有效性。.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在本论文中，我们展示了一种无药物IVA的详细实验室方案。无药物IVA是一种针对卵巢储备功能减退的难治性卵巢反应不良（POR）患者的新型不孕症治疗方法，旨在促进次级卵泡的生长，从而在卵巢刺激后获得更多的成熟卵母细胞，并提高成功妊娠的几率20。在15例卵巢储备功能减退的POR患者中，该方法实现了1例自然妊娠，通过体外受精-胚胎移植技术获得了4例活产，另有1例持续妊娠19。
为制备用于移植的卵巢皮质组织，使用显微剪刀去除髓质组织，保留1-2 mm厚度的皮质。此前，我们已证实，在卵巢储备功能正常的患者中，原始卵泡、初级卵泡以及大部分次级卵泡均位于卵巢皮质表面下1 mm以内的区域21。在早发性卵巢功能不全（POI）患者中，我们发现次级卵泡位于皮质表面下超过1 mm但不超过2 mm的深度21。已知窦状卵泡主要位于髓质组织中21，但在POI患者的髓质组织中并未.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者确认他们不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 Tatsuji Ihana、Sachiyo Kurimoto、Kazuko Takahasih、Yuki Yoshizawa、Maho Arashi、Kentaro Fujita、Erina Kudo、Yuka Kurimoto 和 Mayuko Wakatsuki 在无药物 IVA 操作中的支持，感谢美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院 Aaron J.W. Hsueh 教授对稿件的审阅与修改。同时感谢 Rebecca Truman 和 Gregory Truman 为视频添加英文旁白。本研究由日本促进科学基金（JSPS）科学研究 B 项目（19H03801）及挑战性探索研究项目（18K19624）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4.5 盎司标本容器 | FALCON | 354013 | 其他产品也可能适用 |
| 60 毫米培养皿 | FALCON | 351007 | 其他产品也可能适用 |
| 50 x 50 厘米无菌铺巾 | HOGY Medical | SR-823 | 任何类型的无菌产品也可能适用 |
| 一次性移液管 | FALCON | 357575 | 其他产品也可能适用 |
| 精细剪刀，弯型 | WPI | #14224-G | 尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品 |
| 加热板 | TOKAI HIT | TPiE-SP | 在手术室中用于维持移植前含卵巢组织的培养皿温度 |
| 人血清白蛋白溶液 | Irvine Scientific | 9988 | 用于处理卵巢组织的培养基 |
| IVA 套管针 | KITAZATO | 446030 IVA-6030E | 专用于组织自体移植的套管针 |
| KAI 医用一次性手术刀 | WPI | #5 10-A | 尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品 |
| 显微剪刀，弯型 | WPI | #503364 | 尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品 |
| 改良 HTF 培养基-HEPES | Irvine Scientific | 90126 | 用于处理卵巢组织的培养基 |
| 无菌纱布 | Osaki Medical | 15004 | 任何类型的无菌产品也可能适用 |
| 瑞士镊子，弯头尖端 | KAI | #504505 | 尽管其他产品也可能适用，但我们强烈推荐使用此产品 |
参考文献
- Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
- Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
