使用指定清单实现农场猪向实验猪的过渡并开展响片训练——一项优化举措

摘要

通过引入标准化检查清单和使用点击器进行正向强化训练，可实现猪科研究的优化。本工作支持动物相关样本的采集以及日常护理工作的开展。

摘要

实施3R原则至关重要。为了优化实验猪的生活状况，我们重点关注动物进入实验前的阶段。在开发过程中，我们不断完善检查清单。通过使用该清单，可记录每头猪的个体进展，帮助饲养人员专注于必要的操作，以促进动物的社会化，并降低其应激和焦虑水平。在此阶段，猪只逐渐变得温顺，为后续开展响片训练做好准备，从而进一步减少实验期间的应激反应。这些猪只能够轻松配合基本结局指标的采集，无需镇静或固定。

该方案分为两个阶段。首先是过渡阶段，从猪进入研究机构时开始。此阶段的第一步是向猪提供零食，并逐步增加与饲养员的近距离接触。随后，饲养员开始训练猪适应头部和后躯的触碰，以模拟例如采血时对耳朵的操作或测量直肠温度时对后躯的操作。通过这一过程，在动物与饲养员之间建立起牢固的关系基础，从而迅速减轻猪在到达后所表现出的应激反应。第二阶段则开始进行正向强化训练，教会动物在不产生应激的情况下完成更复杂的任务。训练中引入点击器作为次级强化物。

时间、结构、教育以及充分的沟通似乎是成功实施本方案最重要的几个因素。除了拥有安静且顺从的猪只外，护理人员表示，他们很享受能够将注意力集中在每一只个体猪上，这增加了他们的整体工作满意度。护理人员具备高度的责任感，并关注每只猪的过渡进展和福利状况，这进一步加强了部门的关爱文化。

引言

1959年Russell和Burch提出的3R原则（替代、减少和优化），如今构成了实验动物使用伦理标准的基础。在从事临床前实验动物研究的生物医学研究机构中，必须高度重视优化原则的实施。 "优化是指对仍需使用的动物所承受的非人道操作，在其发生频率或严重程度上进行的任何降低"¹.

现代定义还指出，优化是指“通过利用最新的活体技术以及加深对福利状况对科学结果影响的理解，来推进动物福利研究"²。这意味着，当今的优化措施不仅对动物本身的福利至关重要，而且对研究质量也具有重要意义，因为科学结果将从中受益"³。

一个值得考虑的优化措施是对实验动物进行社会化和训练。可以训练它们完成某些特定任务，例如踏上秤台，或在采集血样时保持安静。某些物种可能天生比其他物种更易于训练，这影响了不同实验动物物种的训练传统。传统上，对犬只的训练已有数百年历史，例如用于狩猎目的。这些历史传统无疑使犬只在生物医学研究环境中的训练变得更加直接和可行。除非人灵长类动物外，实验用犬的训练也已被讨论和实施了相当长的时间^4,5。

这两种物种的共同之处在于它们在 rankings 中均位居前列 "社会动物学量表"该量表根据动物在人类社会中的地位和用途对其进行排序 ⁶排名靠前的研究机构也面临公众的高要求，即尽可能人道地对待实验动物，并限制其压力和焦虑水平。与狗和非人灵长类动物相比，啮齿类动物在社会动物学等级中处于较低位置，因此未获得同等的公众关注和关怀。历史上，它们的待遇相对较差，这可能也与其传播危及生命疾病的能力有关。然而，在过去几年中，啮齿类动物的训练已被引入临床前研究环境，由此带来的相关科学益处已引起广泛关注。有趣的是，大鼠和小鼠都相当容易训练，而训练本身也有助于减少 他们的 应激反应，从而增强科学结果的可靠性^7,8.

据我们所知，关于如何在实验动物环境中对猪进行社会化和训练的报道十分有限⁹。在社会动物学尺度上，猪位于犬类与啮齿类动物之间。我们通常将猪主要视为一种食物资源，但仍有相当数量的猪被用于生物医学研究。仅在欧盟，2015年至2017年间每年约有75,000头猪被用于科学目的¹⁰。该数字包括农场猪和小型猪。目前越来越重视通过训练来优化这些动物的生活质量，以此作为落实“3R原则”的一种措施。农场猪和小型猪均可以接受训练^11,12，但它们在社会化方面的起点有所不同。小型猪专为科研培育，并在生命早期即接受社会化，其品种特性为性情温顺。而农场猪则以食用为目的进行繁殖，通常完全未经过社会化。丹麦用于肉类生产的育肥猪通常以每群15至25头的高密度方式饲养，必须通过竞争在群体等级中确立自身地位，其性情也反映了这种竞争能力。它们常被饲养在配备部分漏缝地板的稳定设施中，以减少清粪工作量。为优化增重，通常通过自动化的饲料和饮水系统实行自由采食。因此，它们与农场工作人员的接触有限，一旦被人操作便会应激。当这些动物被转移至研究机构时，便带来一定挑战。在此类机构中，动物福利、饲养管理以及3R原则起着关键作用^13,14。从研究角度看，每一只个体动物都至关重要，以获得 尽可能最佳的研究结果。保障动物福利也有助于降低个体间在应激、焦虑和恐惧方面的差异。因此，必须重视动物从"群体动物"向"个体"的过渡。到达新环境后，猪将面临新的气味、新的食物、与饲养人员的日常接触，以及通常还会遇到新的圈舍同伴。对猪而言，这种转变可能极具应激性，因此实验动物科学界已公认，需要数天的适应期来帮助其适应新环境¹⁵。

通过合理安排适应期，我们建立了所谓的一种 "转换阶段" 使用结构化的分步检查清单。该检查清单可确保每头猪获得充足的护理人员接触，并学会在无应激状态下接受基本操作，以进行检查和样本采集。随后可在此基础上持续开展训练，采用基于正向强化的训练方法，针对每个具体研究项目对猪进行个性化训练。^16,17使用点击器在猪完成期望动作时发出信号，以提示给予食物奖励。将过渡阶段的步骤与对猪的额外点击器训练相结合，可使动物在研究机构中平稳适应。猪变得温顺且易于操作，并能轻松学会静止站立，以便进行血液样本采集等操作。通过采用此类操作规程，传统的操作技术（如动物镇静或使用套索）得以被替代。为确保所有猪均得到充分的操作训练，需填写检查清单。

目前普遍认为，动物确实会体验积极情绪，因此在与动物互动时，关注点不应仅仅局限于消除负面情绪¹⁸。饲养员与动物之间的训练环节就是一种积极情绪体验的实例。猪在训练中会获得食物奖励和关注，因此过程对其而言相当愉快。除了有助于减少实验设施中因操作引起的应激和恐惧相关行为外，对动物进行训练还为其提供了体验积极情绪的机会。增加积极体验可能抵消实验动物因实验操作所经历的部分负面体验，从而进一步提升动物福利^19,20。

尽管这些猪显然很享受训练过程，但训练过程同时也为饲养员提供了与每头猪建立更紧密关系的机会。作为动物饲养员，执行一些会给动物带来疼痛的操作（例如注射）是工作的一部分。然而，能够通过训练将这些操作转化为积极的体验，其本身便具有重要意义。这不仅提高了饲养员的工作投入度，而且在加强部门整体关爱文化方面发挥了关键作用^21,22,23。

猪只的饲养遵循本机构的动物福利政策，该政策参照了有关动物实验、饲养和管理的国家立法。本方案可适用于任何年龄的断奶猪。为制定过渡检查表（图1），共使用了40头雌性杂交农场猪（丹麦长白-约克夏-杜洛克），体重为35–80 kg（表1）。猪只根据其到达时间被分配到不同组别。这些猪只于2020年1月至9月期间饲养于大学的研究马厩设施中。所有农场猪均在传统母猪场繁殖，当体重达到约15 kg时转移至合作农场。在进入存活研究前至少两周，猪只被转运至大学的研究马厩设施。在最初两周内，完成从农场猪到实验动物的过渡。本方案包含无伤害性和促进福利的措施，因此可立即启动，作为适应期的一部分。

猪被单独饲养在面积为 3.4 - 6.8 m² 的圈栏中，地面为实心混凝土，通过自动供水系统供水。每头猪均设有独立食槽，且相邻圈栏之间的隔栏至少有一部分允许猪鼻部接触。当猪计划接受外科手术或植入设备时，需单独饲养，以防止同栏猪只舔舐、啃咬伤口或将植入物拉出。垫料材料为稻草，同时为动物提供干草以及各种活动玩具作为环境丰富化措施，例如绳索、球、桶和塑料制成的咀嚼棒（图 2）。

这些动物来自一个纳入国家家猪健康监测计划的猪群，这意味着它们会针对七种可能影响生产环境中猪只的病原体进行筛查²⁴。除因研究结果异常而需进行诊断采样的猪只外，研究用猪群还根据FELASA建议^25,26每半年进行一次随机检查。本项目中使用的部分猪只对猪繁殖与呼吸综合征呈血清学阳性；然而，这些猪均未表现出与感染相关的任何临床症状。所有采用聚合酶链式反应检测的样本结果均为阴性，进一步证实这些猪处于健康状态。

方案

用于验证该方案的猪属于经丹麦国家政府机构——动物实验委员会批准的研究项目。该委员会负责对丹麦所有动物实验进行伦理审查和批准，其职能类似于美国的实验动物管理与使用委员会（IACUC）。

1. 到达研究机构

1. 首先，在指定区域清洗猪只，以便进行全面的视觉检查。使用排除清单剔除有伤口、耳部咬伤、脓肿、跛行等情况的猪只，仅允许临床表现健康的动物进入设施。
2. 清洗后，根据颜色标记将猪只分组。颜色标记用于指示哪些猪在供应商处原本同栏饲养。这一点非常重要，因为猪只在接触新同伴时会争斗以建立等级秩序。将已熟悉的猪只保持在同一组内，可显著减少此类争斗行为。
3. 在到达当日的其余时间内，除下午喂食外，应避免干扰猪只，因为它们在运输后可能处于较大的应激状态。

2. 第一部分：过渡阶段（预计时间 4-6 天）

注意：在过渡阶段进行操作时，猪只停留在其原有的圈舍中。每次奖励环节使用半个苹果作为零食。每头猪的个体进展将根据《过渡阶段进展检查表》进行评分（图1 和 补充文件1）。

1. 到达后的连续两天内，开始引入零食。
   1. 每天两次，将少量零食（总计半个苹果）扔进围栏中，让猪自行寻找，操作者则安静地站在围栏外。除了让猪熟悉零食外，目的是使动物将零食与饲养员的出现建立积极的关联。
2. 从第三天起及之后的每一天，开始让猪熟悉"由饲养员进行接触"。在喂食期间进入围栏。
   1. 当猪进食时，坐在距离其手臂长度的位置（图3）。平静地伸出手触碰猪的背部，接触时间需超过两秒才算成功。如果猪离开食物后退，应缓慢收回手。
   2. 等待动物重新开始进食后再次尝试。如果猪再次离开食物后退，则停止触碰动作，但仍留在围栏内靠近食槽处（每次操作总时长为2-3分钟）。
3. 当猪在进食时能够接受背部被触碰，即可进入下一步操作。此时可在其背部前后方向移动手部。
   1. 如果猪允许，可进一步触碰其头部和耳朵。若猪在任何时刻表现出回避行为，应立即停止该动作，但仍需在围栏内停留至规定时间（每次操作总时长为2-3分钟）。耳朵部位尤为重要，因为后续可通过耳部静脉导管进行采血。
   2. 缓慢起身，以便触碰尾部区域，这是第二个关键区域。站立和走动对猪而言更具威胁性，因此此步骤需单独评分。当猪能够接受该区域被触碰并允许尾巴被操作时，即可进行直肠测温，以支持大多数研究方案的实施。
4. 为进一步加强饲养员与动物之间的情感联系，除喂食时间外，每天额外进行两次进入围栏的互动。在围栏内角落坐下，每次持续2-3分钟，期间向猪提供零食（每次一片）。初期可从伸直手臂的距离给予零食，随后逐渐缩短距离，使猪必须靠近才能获得奖励。
5. 过渡阶段的最后一步是能够在不依赖大量零食的情况下，顺利触碰猪身体的特定部位。进入围栏时，由另一名饲养员站在围栏外向猪提供一至两块零食作为辅助。当猪保持安静、允许如前所述的触碰行为，并且四蹄始终着地（不跳跃攀爬围栏）时，应及时给予奖励。

3. 第二部分：开始使用点击器训练

注意：过渡阶段结束后，动物即可开始响片训练。建议在指定区域进行训练，这有助于猪识别训练即将开始。每天进行多次短时训练优于单次长时间训练。

1. 每次将一头猪从圈舍带至指定的训练区域。如果训练区域对猪来说是陌生的，最初的训练应仅让猪自由探索约5-7分钟，并给予少量零食，不进行正式训练。
2. 在猪无法触及零食的位置，手持或放置点击器。当猪表现出兴趣时立即点击，并立刻给予零食。在猪保持兴趣期间快速重复此过程。若猪失去兴趣，则暂停点击与奖励，直到猪重新建立互动。该训练环节不应超过10分钟。
3. 猪通常能迅速理解点击声的含义，但必须强化点击声与零食之间的关联。连续进行数次训练以巩固这种关联。可通过仅发出一次点击声而不给予零食，密切观察猪的行为来测试其是否已建立关联。若猪立即四处张望、期待获得零食，则表明训练成功；否则需再进行数次额外训练。
4. 当猪已明确理解点击声的意义后，引入目标棒。目标棒是一端带有明显标记的杆状物。将带标记的一端置于与猪鼻高度相当的位置。猪出于好奇最终会触碰目标棒。在猪触碰目标棒的瞬间立即点击，并给予零食。
5. 立即再次出示目标棒，若猪再次触碰，则再次点击并给予零食。持续进行目标棒训练，直到猪明确理解触碰目标棒即可获得奖励。随后逐渐将目标棒移远，使猪需要移动更远距离才能触碰到。
6. 当猪能够在目标棒移动时跟随其移动后，可在训练区域中增加障碍物，提高训练难度，使猪必须更加专注地完成目标棒任务才能获得奖励。

结果

采用本方案第一部分所述的过渡阶段，可顺利将农场饲养的猪引入研究设施。保持猪只处于安静状态有利于日常操作，并可在无需麻醉或固定的情况下完成简单的操作和样本采集。

为了追踪猪只在过渡阶段的进展情况，制定了一份检查清单（清单1），用于标记每头猪达到过渡阶段各个既定步骤的时间点。猪只计划在到达后两周内进入研究项目，总天数被选为衡量过渡成功与否的指标。

根据清单1，对20头猪的过渡阶段进行了跟踪，以验证在两周内将农场猪转变为实验用猪是可行的（图4）。所有猪均在12天内完成了清单项目，表明所设定的时间范围是充分的。

根据初次使用经验对清单1进行了修改，制定出一份新的严格清单（清单2）。为进一步改进并标准化过渡流程，主要修订内容是增加了每日训练次数，并限制了每次训练的持续时间。比较两份清单的使用效果显示，使用清单2进行过渡的猪在过渡初期的进展与使用清单1相似，但在后续阶段达到目标的速度更快。清...

讨论

实施包含第一部分过渡阶段检查表和第二部分连续响片训练程序的方案已被证实是成功的。引入并使用详细的检查表为优化猪只进入研究设施时的适应过程提供了有效方法。结构化的过渡阶段进一步为猪只在纳入研究项目前的训练奠定了更坚实的基础。令人欣喜的是，护理人员对工作的投入程度有所提高，而猪只所经历的积极情绪也反映在它们日常行为中。

新猪只的引入以及向实验用猪的顺利过渡长期以来一直是关注的重点，但要引入变革却十分困难。为了全面了解相关工作及其益处，决定使用检查表来监测优先步骤的有效性。在检查表1中，所列步骤基于那些预期对过渡过程影响最大的操作。研究人员使用检查表1对20头猪的过渡过程进行了评分和评估。随后，根据实施过程中遇到的问题对该检查表进行了调整，这些问题主要涉及理解偏差和报告不一致。其中关键的一点是对每个步骤的解释，以及该步骤所包含的具体操作。因此，进一步完善了每一步骤的描述，并对检查表进行了修改，使其更加直观。为简化判断接触猪只时成功与失败之间的区别，删除了其中一个步骤。为了明确某一步骤是否已执行，除原有记录猪只是否完成动作（+）或拒绝执行动作（÷）的选项外，新增了一个复选框，用于标示该步骤...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
包裹胶带，电动，blå，7.5 cm	E-vet A/S, Ole Rømers Vej 26 A, DK-6100 Haderslev	203165B	粘性胶带，用于缠绕在木棒末端以制作目标棒。该胶带可更换，这一特性具有优势，因其会较快变脏。
苹果	Varius	未知	用作奖励食物
点击器（Clicker）	E-vet A/S, Ole Rømers Vej 26 A, DK-6100 Haderslev	TX2289	训练中使用的点击器