本方案介绍了一种模拟椎间盘早期退变的促炎性、退行性牛椎间盘器官培养新型实验模型。
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方法文章
一种模拟椎间盘退变早期阶段的促炎性退行性器官培养模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
有症状的椎间盘（IVD）退变（IDD）是一种重大的社会经济负担，其特征是炎症和组织降解。由于目前缺乏针对病因的治疗方法，迫切需要创新的实验性器官培养模型，以研究疾病进展的相关机制、寻找治疗靶点，并减少对动物模型的需求。本文介绍了一种新颖的三维器官培养模型方案，可模拟IDD过程中存在的促炎性和分解代谢微环境。
首先，分离牛尾部椎间盘，进行清理后置于组织培养基中培养。每天在自行设计的生物反应器中施加2小时的动态生理性或病理性负荷。椎间盘被分为对照组（高葡萄糖培养基、生理性负荷、磷酸盐缓冲液注射）和病理组（低葡萄糖培养基、病理性负荷、肿瘤坏死因子-α注射），持续处理四天。随后对收集的椎间盘髓核细胞进行基因表达分析，并对条件化器官培养基进行酶联免疫吸附测定。
我们的数据显示，与对照组相比，病理组在加载后炎症标志物的表达升高，椎间盘高度降低。该方案可可靠地模拟椎间盘（IVD）的炎症与退变过程，并可进一步拓展以扩大其应用范围。
引言
下背痛（LBP）可影响所有年龄段的个体，是全球范围内导致残疾的主要原因之一1,2,3。与LBP相关的总成本每年超过1000亿美元4,5。有症状的椎间盘（IVD）退变（IDD）是一种以炎症和组织降解为特征的疾病，是导致LBP的主要原因6,7。具体而言，IDD表现为IVD细胞外基质（ECM）逐渐发生破坏，这一过程由多种因素诱导和触发，导致病理进程加速、神经系统障碍，并最终引发残疾。此外，IDD还与促炎性细胞因子的释放、脊柱生物力学改变、血管生成以及神经长入有关，这些因素共同增强了疼痛感知，导致慢性下背痛（活动性椎间盘病）6,8。迄今为止，针对IDD患者的治疗选择包括椎间盘切除术及相邻椎体融合术、IVD假体植入，或非手术方法，如使用非甾体抗炎药、阿片类药物和肌肉松弛剂9。目前现有的手术和非手术标准治疗方案均只能部分有效，且未能解决根本的生物学问题
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方案
实验使用从当地屠宰场获得的牛尾进行。本研究中所使用的生物材料来源于食物链，在瑞士和欧洲法律中无需伦理审批。
1. 牛椎间盘的解剖
- 用自来水彻底冲洗整个尾部，以去除表面的污垢和毛发。
注意：若尾椎远端保持完整，每条尾部最多可获取9个椎间盘（尾椎1-9），具体数量取决于所需椎间盘的尺寸。考虑到直径在15-20 mm之间，本研究中每条尾部取5个椎间盘，共使用12条牛尾。 - 将整个尾部浸入盛有1%聚维酮碘溶液的容器中，浸泡10分钟。用无菌纱布短暂擦干尾部，并将其放置在无菌铺巾上。
注意：在解剖椎间盘过程中，需用浸有林格氏液的纱布润湿尾部，以防脱水。将尾部（或剩余节段）用湿纱布包裹后储存，直至整个解剖过程完成。 - 使用手术刀（No. 20）尽可能彻底地去除尾椎上的软组织，以便识别椎间盘。使用去骨钳去除椎体的棘突和横突。
注意：选择符合所需直径的椎间盘。本研究中使用的椎间盘直径范围为15-20 mm。 - 使用骨钳在每个椎体中部横向切断，以获得独立的运动节段。将运动节段放入含有浸润林格氏液纱布的培养皿中。
- 通过触诊及轻柔移动运动节段来定位椎间盘和椎体。使用带锯在椎间盘的生长板处进行两次平行切割，分别位于椎间盘两侧。通过触摸并寻找邻近椎间盘（柔软）的骨性终板部分（坚硬）的凸起部位，确定生长板的位置，并从椎间盘向椎体方向保留约0.5-1 mm的安全距离。切....
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结果
在低葡萄糖培养基中进行退变性负荷培养并联合TNF-α注射后，与生理性对照组相比，培养4天后髓核细胞中促炎标志物白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的基因表达显著升高（图2）。相反，我们未观察到髓核细胞中促炎基因白细胞介素1β（IL-1β）和TNF-α的显著变化（数据未显示）。此外，退变性培养条件并未改变纤维环细胞中IL-6和IL-8的基因表达水平。
图 2：髓核（NP）组织与纤维环（AF）组织中的基因表达水平。 在生理或病理培.......
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讨论
本文提供了一种模拟椎间盘退变和炎症的详细方案。该方案可用于深入研究导致椎间盘破坏性效应的炎症通路。此外，该方案有助于确定参与疾病进展的潜在治疗靶点。
我们最近的研究表明，人重组TNF-α可在牛和人NP细胞中均诱导炎症反应21，这与其他研究领域的研究结果一致，证实TNF-α可用于椎间盘（IVD）细胞的炎症模拟22,23。在本研究中，采用每椎间盘100 ng TNF-α的剂量诱导炎症。该剂量在与退变性负荷和营养受限条件联合应用时，可有效诱导炎症标志物的表达15,20。在最近一项以TNF-α作为椎间盘退变唯一启动因素的研究中，已确定100 ng TNF-α/cm3椎间盘体积为诱导椎间盘内炎症和退行性改变的有效剂量阈值21。建议将用于诱导炎症.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由AO基金会和AOSpine国际组织资助。Babak Saravi获得了德国脊柱基金会和德国骨关节炎基金会的奖学金支持。Gernot Lang获得了德国弗赖堡大学医学院Berta-Ottenstein临床科学家高级项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-溴-3-氯丙烷（BCP） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| 带锯 | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | 型号 30/833 | |
| 聚维酮碘 | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| 牛IL-8 DIY ELISA试剂盒 | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS预混液 | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM高糖培养基 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM低糖培养基 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| 青霉素/链霉素（P/S） | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| 蛋白酶K替代酶（Pronase） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac喷射灌洗系统 | Zimmer, IN, USA | ||
| TissueLyser II组织研磨仪 | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| 链霉亲和素-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO反转录试剂 | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan通用主混合液 | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-α，重组人蛋白 | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent总RNA提取试剂 | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA缓冲液 | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| 基因 bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 引物反向 (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 探针 (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| 基因 bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| 基因 bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 引物反向 (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 探针 (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| 基因 bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 引物反向 (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 探针 (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA AGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
参考文献
- Vos, T., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
- Hoy, D., et al.
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重印与许可
