本方案介绍了一种模拟椎间盘早期退变的促炎性、退行性牛椎间盘器官培养新型实验模型。
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方法文章
一种模拟椎间盘退变早期阶段的促炎性退行性器官培养模型
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
有症状的椎间盘（IVD）退变（IDD）是一种重大的社会经济负担，其特征是炎症和组织降解。由于目前缺乏针对病因的治疗方法，迫切需要创新的实验性器官培养模型，以研究疾病进展的相关机制、寻找治疗靶点，并减少对动物模型的需求。本文介绍了一种新颖的三维器官培养模型方案，可模拟IDD过程中存在的促炎性和分解代谢微环境。
首先，分离牛尾部椎间盘，进行清理后置于组织培养基中培养。每天在自行设计的生物反应器中施加2小时的动态生理性或病理性负荷。椎间盘被分为对照组（高葡萄糖培养基、生理性负荷、磷酸盐缓冲液注射）和病理组（低葡萄糖培养基、病理性负荷、肿瘤坏死因子-α注射），持续处理四天。随后对收集的椎间盘髓核细胞进行基因表达分析，并对条件化器官培养基进行酶联免疫吸附测定。
我们的数据显示，与对照组相比，病理组在加载后炎症标志物的表达升高，椎间盘高度降低。该方案可可靠地模拟椎间盘（IVD）的炎症与退变过程，并可进一步拓展以扩大其应用范围。
引言
下背痛（LBP）可影响所有年龄段的个体，是全球范围内导致残疾的主要原因之一1,2,3。与LBP相关的总成本每年超过1000亿美元4,5。有症状的椎间盘（IVD）退变（IDD）是一种以炎症和组织降解为特征的疾病，是导致LBP的主要原因6,7。具体而言，IDD表现为IVD细胞外基质（ECM）逐渐发生破坏，这一过程由多种因素诱导和触发，导致病理进程加速、神经系统障碍，并最终引发残疾。此外，IDD还与促炎性细胞因子的释放、脊柱生物力学改变、血管生成以及神经长入有关，这些因素共同增强了疼痛感知，导致慢性下背痛（活动性椎间盘病）6,8。迄今为止，针对IDD患者的治疗选择包括椎间盘切除术及相邻椎体融合术、IVD假体植入，或非手术方法，如使用非甾体抗炎药、阿片类药物和肌肉松弛剂9。目前现有的手术和非手术标准治疗方案均只能部分有效，且未能解决根本的生物学问题9,10。退行性椎间盘疾病的早期阶段以初始的炎症性组织反应为特征，尤其是肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达的增加11。这些早期椎间盘变化主要发生在细胞水平，尚未破坏椎间盘结构，以往可通过在促炎条件下模拟营养缺乏来复制此类变化12。因此，精确模拟体内环境以研究这些退变机制并寻找合适的治疗靶点至关重要。此外，在模拟分子特性的同时，椎间盘所处的力学负荷环境在其病理和生理变化中也起着关键作用。因此，将这两种方法结合起来，将使我们更进一步地模拟IVD在体内的复杂微环境。据我们所知，目前尚无研究同时考虑动态负荷、促炎环境以及营养条件对椎间盘的影响。
尽管大型动物模型可用于研究潜在的相关体内相互作用，但其成本高昂且工作量大。此外，由于在科研中使用动物模型长期以来存在争议，减少回答重要科研问题所需的动物数量具有重要意义。最后，目前尚无理想的动物模型能够模拟椎间盘退变（IDD）在椎间盘（IVD）研究中的病理过程13,14。因此，有必要建立一种经济高效且可靠的替代方法，例如器官培养模型，以模拟IDD及其相关的炎症和退行性病变过程。近期，应用本实验方案建立促炎性和退行性器官培养模型以模拟早期椎间盘退变疾病，使我们能够在IDD器官培养体系中研究抗炎药物的作用效果15。
本文介绍了如何获取牛椎间盘，并通过在低营养培养基条件下，向椎间盘内直接注射肿瘤坏死因子-α（TNF-α）并结合生物反应器中的退变性负荷，诱导早期椎间盘退变（IDD）状态。图1展示了实验模型，并显示了用于模拟退变性和生理性负荷条件的生物反应器。
图1：实验装置示意图。A：牛尾；B：分离出的牛椎间盘；C：将椎间盘转移至含培养基的孔板中；D：在生物反应器中进行力学加载模拟；E：椎间盘内注射技术；F：注射PBS/台盼蓝染料后的椎间盘，用于显示染料分布情况。IDD：椎间盘退变（intervertebral disc degeneration）。请点击此处查看该图的高清版本。
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方案
实验使用从当地屠宰场获得的牛尾进行。本研究中所使用的生物材料来源于食物链，在瑞士和欧洲法律中无需伦理审批。
1. 牛椎间盘的解剖
- 用自来水彻底冲洗整个尾部，以去除表面的污垢和毛发。
注意：若尾椎远端保持完整，每条尾部最多可获取9个椎间盘（尾椎1-9），具体数量取决于所需椎间盘的尺寸。考虑到直径在15-20 mm之间，本研究中每条尾部取5个椎间盘，共使用12条牛尾。 - 将整个尾部浸入盛有1%聚维酮碘溶液的容器中，浸泡10分钟。用无菌纱布短暂擦干尾部，并将其放置在无菌铺巾上。
注意：在解剖椎间盘过程中，需用浸有林格氏液的纱布润湿尾部，以防脱水。将尾部（或剩余节段）用湿纱布包裹后储存，直至整个解剖过程完成。 - 使用手术刀（No. 20）尽可能彻底地去除尾椎上的软组织，以便识别椎间盘。使用去骨钳去除椎体的棘突和横突。
注意：选择符合所需直径的椎间盘。本研究中使用的椎间盘直径范围为15-20 mm。 - 使用骨钳在每个椎体中部横向切断，以获得独立的运动节段。将运动节段放入含有浸润林格氏液纱布的培养皿中。
- 通过触诊及轻柔移动运动节段来定位椎间盘和椎体。使用带锯在椎间盘的生长板处进行两次平行切割，分别位于椎间盘两侧。通过触摸并寻找邻近椎间盘（柔软）的骨性终板部分（坚硬）的凸起部位，确定生长板的位置，并从椎间盘向椎体方向保留约0.5-1 mm的安全距离。切割椎体时，须确保带锯刀片以林格氏液冷却。
- 将椎间盘转移至洁净的培养皿中，皿内放置用林格氏液浸润的洁净纱布。
注意：纱布应保持湿润但不过于潮湿，以防椎间盘肿胀。 - 使用手术刀片刮除椎体（红色/粉红色骨组织）和生长板（白色软骨），保留终板完整（黄粉色）。为后续加载实验，使两个表面平整且相互平行。将刮除后的椎间盘转移至新的培养皿中，皿内放置用林格氏液浸润的纱布。
注意：操作时应佩戴金属网防护手套，以保护持握椎间盘和刮除过程中的手部安全。 - 使用卡尺测量椎间盘的高度和直径。使用喷射灌洗系统，以林格氏液清洗椎体骨组织中的血凝块。
- 将椎间盘转移至50 mL塑料管中，每管放置一个椎间盘。每个椎间盘加入25 mL磷酸盐缓冲液（PBS）+ 10%青霉素/链霉素（P/S），在室温下置于旋转摇床上震荡15分钟。
- 吸除上清液，每个椎间盘加入10 mL PBS + 1% P/S，震荡清洗2分钟。
2. 椎间盘体外培养与加载
- 将椎间盘转移至IVD培养室，加入IVD培养基（DMEM高糖培养基（4.5 g/L葡萄糖，用于生理组）或低糖DMEM（2 g/L葡萄糖，用于病理组）+ 1%青霉素-链霉素（P/S）+ 2%胎牛血清 + 1% ITS（含5 µg/mL胰岛素、6 µg/mL转铁蛋白和5 ng/mL亚硒酸）+ 50 µg/mL抗坏血酸-2-磷酸 + 1%非必需氨基酸 + 50 µg/mL抗菌剂 用于原代细胞），然后置于37 °C、85%湿度、5% CO2的培养箱中培养。
- 根据实验分组，在生物反应器系统中培养椎间盘4天16。在病理组中，维持退变性加载条件：0.32–0.5 MPa，5 Hz，每日2小时。在生理对照组中，采用加载方案：0.02–0.2 MPa，0.2 Hz，每日2小时。
注意：在加载过程中，将IVD置于含有5 mL IVD培养基的培养室中。培养基体积取决于生物反应器加载室的大小。在非加载期间，将IVD转移至六孔板中，每孔加入7 mL IVD培养基，使其自由膨胀恢复。 - 为分析实验期间椎间盘高度的变化，在IVD解剖后（基线）使用游标卡尺测量椎间盘高度，之后在每次自由膨胀期结束后及动态加载后每日测量一次，持续整个实验周期。
3. 椎间盘内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）注射
- 在第1天完成第一个动态加载循环后，立即将椎间盘（IVDs）垂直放置于培养皿中，并用镊子固定椎间盘。
- 使用30号胰岛素针头，将重组TNF-α（每枚椎间盘注射100 ng，溶于70 µL PBS中）注入病理组椎间盘的髓核组织17。注射速度约为每分钟70 µL，缓慢注入。
- 注射后，将注射器针头在椎间盘内回撤一半距离，然后回抽注射器活塞以形成负压，防止注入的溶液反流，之后再将针头和注射器完全从椎间盘中取出。
注意：可通过注射含台盼蓝染料的PBS进行预实验，以评估加载及过夜培养后注入溶液的分布情况。
4. 基因表达
- 第4天收获椎间盘（IVD）。使用活检打孔器收集髓核（NP）组织（椎间盘中央的凝胶状部分），使用手术刀片（No.20）收集外层纤维环（AF）组织。
注意：对于第0天的基线参考，请在解剖后立即收集 组织用于RNA提取。 - 根据实验设计，使用适量的NP或AF组织进行基因表达分析。
注意：在本实验中，约使用150 mg组织。RNA提取液与组织质量的比例应至少为每100–150 mg组织使用2 mL，以确保高效提取。 - 使用消化液（含0.2%蛋白酶的DMEM，过滤除菌）消化NP或AF组织，并在37 °C下磁力搅拌孵育1小时18。
- 使用液氮快速冷冻组织样本，并研磨成细粉。将研磨后的组织粉末均分至两个2 mL离心管中，每管加入1 mL含硫氰酸胍和苯酚的单相溶液（RNA提取液）。
- 在含有RNA提取液和研磨后组织粉末的2 mL离心管中进行匀浆。使用8 mm不锈钢研磨珠和组织研磨仪，在30 Hz条件下匀浆5次，每次3分钟。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，将上清液转移至新离心管中。上清液可在-80 °C保存至少一个月。
- 每1 mL RNA提取液中加入0.1 mL 1-溴-3-氯丙烷（BCP），剧烈振荡15秒。将所得混合物在室温下置于旋转摇床上静置15分钟，然后在4 °C下以12,000 × g离心15分钟。
注意：RNA仅存在于上层水相中。 - 将水相转移至新的离心管中，每1 mL初始匀浆所用的RNA提取液中加入0.25 mL异丙醇和0.25 mL高盐沉淀液以沉淀RNA。在室温下置于旋转摇床上静置15分钟，然后在4 °C下以12,000 × g离心8分钟。
注意：也可采用基于柱的RNA提取方法，该方法通常可获得更高纯度的RNA，但得率较低。 - 弃去上清液，每1 mL初始匀浆所用的RNA提取液中加入1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。在4 °C下以7,500 × g离心5分钟。
- 弃去乙醇洗涤液，将RNA沉淀在空气中短暂干燥3–5分钟。通过反复吹打移液枪头，将RNA溶解于20 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中，并在55–60 °C孵育10–15分钟。
- 测定230 nm、260 nm和280 nm处的吸光度（分别为A230、A260和A280）。A260为1.0时相当于40 µg/mL RNA。预期A260/A280比值为1.6–1.9，若存在污染，则A260/A280比值<1.6。
- 配制20 µL逆转录（RT）反应体系。反应体系包含逆转录酶混合物、核糖核酸酶抑制剂、辅助蛋白、引物、dNTPs、MgCl2、无RNase水以及0.4 μg RNA样本。
- 短暂离心RT反应管，使所有组分沉降至管底。
- 将样本放入热循环仪中，选择合适的RT程序。先在25 °C运行10分钟，随后在42 °C进行逆转录反应120分钟，再在85 °C灭活逆转录酶5分钟，最后降温至4 °C。
- 使用Tris(羟甲基)氨基甲烷（Tris）-乙二胺四乙酸（EDTA）（TE）缓冲液（含10 mM Tris和1 mM EDTA）稀释所得cDNA，使最终浓度为每100 µL cDNA溶液中含有0.4 µg用于RT的RNA。将cDNA样本保存于-20 °C。
- 使用10 µL反应体系进行实时聚合酶链式反应（PCR）。反应体系包含预混液（含DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、含dUTP的dNTPs、被动参比染料及优化缓冲成分）、正向引物45 µM、反向引物45 µM、探针12.5 µM（探针5'端连接报告荧光染料，3'端含小沟结合物和非荧光淬灭基团）、2 µL cDNA以及DEPC处理水。
- 使用内源性对照（RPLP0）进行相对定量，采用2-ΔΔCT方法19。
- 每个样本设置复孔，并以TE缓冲液替代cDNA设置无模板对照。按标准条件运行PCR（50 °C 2分钟，95 °C 10分钟，随后进行40个循环：95 °C 15秒，60 °C 1分钟）。
- 采用比较CT法对mRNA靶标进行相对定量。相对于基线样本归一化的mRNA量计算为2-ΔΔCT，其中ΔΔCT为样本的ΔCT（CT目标基因 - CT内源性对照）与基线样本的ΔCT（CT目标基因 - CT内源性对照）之间的差值。
5. 椎间盘培养基中蛋白质含量的定量分析
- 收集IVD样本的条件培养基，以测定培养基中的蛋白质含量。根据目标蛋白的说明书进行酶联免疫吸附测定（ELISA）。
- 使用抗牛IL-8 ELISA试剂盒，按照制造商说明书定量检测牛白细胞介素-8（IL-8）。
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结果
在低葡萄糖培养基中进行退变性负荷培养并联合TNF-α注射后，与生理性对照组相比，培养4天后髓核细胞中促炎标志物白细胞介素6（IL-6）和白细胞介素8（IL-8）的基因表达显著升高（图2）。相反，我们未观察到髓核细胞中促炎基因白细胞介素1β（IL-1β）和TNF-α的显著变化（数据未显示）。此外，退变性培养条件并未改变纤维环细胞中IL-6和IL-8的基因表达水平。
图 2：髓核（NP）组织与纤维环（AF）组织中的基因表达水平。 在生理或病理培...
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讨论
本文提供了一种模拟椎间盘退变和炎症的详细方案。该方案可用于深入研究导致椎间盘破坏性效应的炎症通路。此外，该方案有助于确定参与疾病进展的潜在治疗靶点。
我们最近的研究表明，人重组TNF-α可在牛和人NP细胞中均诱导炎症反应21，这与其他研究领域的研究结果一致，证实TNF-α可用于椎间盘（IVD）细胞的炎症模拟22,23。在本研究中，采用每椎间盘100 ng TNF-α的剂量诱导炎症。该剂量在与退变性负荷和营养受限条件联合应用时，可有效诱导炎症标志物的表达15,20。在最近一项以TNF-α作为椎间盘退变唯一启动因素的研究中，已确定100 ng TNF-α/cm3椎间盘体积为诱导椎间盘内炎症和退行性改变的有效剂量阈值21。建议将用于诱导炎症...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由AO基金会和AOSpine国际组织资助。Babak Saravi获得了德国脊柱基金会和德国骨关节炎基金会的奖学金支持。Gernot Lang获得了德国弗赖堡大学医学院Berta-Ottenstein临床科学家高级项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-溴-3-氯丙烷（BCP） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | B9673 | |
| 抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8960 | |
| 带锯 | Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany | 型号 30/833 | |
| 聚维酮碘 | Munndipharma, Frankfurt, Germany | ||
| 牛IL-8 DIY ELISA试剂盒 | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | DIY1028B-003 | |
| Corning ITS预混液 | Corning Inc., New York, USA | 354350 | |
| DMEM高糖培养基 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 10741574 | |
| DMEM低糖培养基 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11564446 | |
| 分子生物学级乙醇 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 09-0851 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | A4766801 | |
| 非必需氨基酸溶液 | Gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11140050 | |
| 青霉素/链霉素（P/S） | gibco by life technologies, Carlsbad, USA | 11548876 | |
| 磷酸盐缓冲液片剂 | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P4417 | |
| 蛋白酶K替代酶（Pronase） | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10165921001 | |
| Primocin | InvivoGen, Sandiego, USA | ant-pm-05 | |
| Pulsavac喷射灌洗系统 | Zimmer, IN, USA | ||
| TissueLyser II组织研磨仪 | Quiagen, Venlo, Netherlands | 85300 | |
| 链霉亲和素-HRP | Kingfisher Biotech, St. Paul, USA | AR0068-001 | |
| Superscript VILO反转录试剂 | Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA | 10704274 | |
| cDNA合成试剂盒 | Applied Biosystems by life technologies | 10400745 | |
| TaqMan通用主混合液 | Applied Biosystems by life technologies | ||
| TNF-α，重组人蛋白 | R&D systems, Minnesota, USA | 210-TA-005 | |
| TRI Reagent总RNA提取试剂 | Molecular Research Center, Cincinnati, USA | TR 118 | |
| Tris-EDTA缓冲液 | sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 93283 | |
| 基因 bIL-6 | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 引物反向 (5′–3′) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 探针 (5′FAM/3′TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT |
| 基因 bIL8 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03211906_m1 | |
| 基因 bTNF-alpha | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 引物反向 (5′–3′) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 探针 (5′FAM/3′TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G |
| 基因 bIL1beta | Applied Biosystems by life technologies | 定制探针 | 引物正向 (5′–3′) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 引物反向 (5′–3′) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 探针 (5′FAM/3′TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA AGG TCA TCA GCC TCA A |
| RPLP0 | Applied Biosystems by life technologies | Bt03218086_m1 |
参考文献
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