睡眠剥夺是研究睡眠功能和调控机制的有力工具。本文介绍了一种利用睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus）对黑腹果蝇（Drosophila）进行睡眠剥夺的实验方案，以及评估剥夺后反弹睡眠程度的方法。
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本文内容
摘要
摘要
睡眠稳态，即睡眠丧失后观察到的睡眠增加现象，是用于在动物界中识别睡眠的决定性标准之一。因此，睡眠剥夺和睡眠限制是研究睡眠功能时常用的有力工具。然而，睡眠剥夺实验本身存在固有问题，因为剥夺刺激本身可能引起生理和行为上的变化。因此，成功的睡眠剥夺技术应能使动物保持清醒，并理想地在不引发大量非预期后果的前提下，产生显著的睡眠反弹。本文介绍一种针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的睡眠剥夺技术。睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus, SNAP）每10秒施加一次刺激以诱导负向趋地性。尽管该刺激具有可预测性，但SNAP仍能有效阻止睡眠驱动力较高的果蝇在夜间超过>95%的睡眠。重要的是，随后产生的稳态反应与手工剥夺所获得的结果非常相似。通过调整刺激的时间和间隔，可减少睡眠丧失程度，从而考察刺激本身对生理和行为的非特异性影响。SNAP还可用于睡眠限制实验以及觉醒阈值的评估。SNAP是一种强大的睡眠干扰技术，有助于更深入地理解睡眠功能。
引言
睡眠在动物中几乎普遍存在，但其功能仍不明确。睡眠稳态是指睡眠剥夺后睡眠的代偿性增加，是睡眠的一个定义性特征，已被用于描述多种动物的睡眠状态1,2,3,4,5。
果蝇的睡眠与人类睡眠具有许多相似之处，包括对睡眠丧失产生强烈的稳态反应4,5。大量关于果蝇睡眠的研究利用睡眠剥夺来推断睡眠功能，方法是通过观察长时间清醒所累积的不良后果，同时也用于理解睡眠调控机制，即确定控制睡眠稳态调节的神经生物学机制。因此，研究发现睡眠剥夺的果蝇在学习与记忆6,7,8,9,10,11....
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方案
1. 实验准备
- 在果蝇羽化后立即收集至小瓶中，并按性别分离雄性和雌性果蝇。
注意：睡眠实验通常使用雌性果蝇进行。务必收集未交配的雌蝇。已交配的雌蝇会产卵，卵孵化为幼虫，从而干扰数据分析。 - 将同一性别的果蝇以少于<20只的群体进行饲养。
注意：在社会环境丰富化条件下饲养果蝇（群体数量>50只）会调节睡眠驱动力6,13，可能干扰对反弹睡眠的测量。此外，在经历社会环境丰富化后，果蝇的睡眠量会在数天内逐渐下降6。因此，基础睡眠水平不稳定，使反弹睡眠的分析变得复杂。将果蝇维持在少于<20只的群体中可避免这一潜在混杂因素。 - 将果蝇置于可控光照和湿度的环境中饲养3–5天。
注意：果蝇的年龄和成熟度对其睡眠有显著影响。果蝇在出生后第一天睡眠量较高，并在3–5天龄时趋于稳定4。通常果蝇维持在12小时光照：12小时黑暗的循环周期中，相对湿度为50%。
2. 睡眠记录用导管的制备
注意：睡眠通过运动活动监测仪进行监测。一个监测仪可容纳32只果蝇，每只果蝇单独饲养在直径为5 mm的管....
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结果
野生型果蝇品系采用Canton S（Cs）。果蝇饲养于12小时光照：12小时黑暗的循环条件下，并在夜间连续12小时进行睡眠剥夺。对Cs果蝇在基线日（bs）、睡眠剥夺日（sd）以及随后两个恢复日（rec1和rec2）的睡眠谱进行观察（图2A）表明，在SNAP系统中果蝇确实实现了有效的睡眠剥夺，并在恢复期出现符合文献报道特征的日间睡眠反弹4,5。SNAP系统维持果蝇清醒的有效性还可通过睡眠剥夺期间果蝇表现出的高活动水平（300–350次/小时）得以证实（图2B）。事实上，监测睡眠剥夺期间果蝇的活动次数可作为评估剥夺方案有效性的一个有用指标，或间接反映睡眠驱动力的强弱。当睡眠剥夺效果不佳时，果蝇在剥夺期间的活动水平较低；而处于高睡眠驱动力状态的果蝇在每次刺激后会迅速入睡，在管内移动的距离也较少35.......
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讨论
2000年，两个研究团队独立地在Drosophila（果蝇）中描述了睡眠行为4,5。在这些开创性研究中，研究人员通过轻柔操作（即手工剥夺）使果蝇保持清醒，并发现其表现出显著的稳态反应以应对整夜的睡眠剥夺。重要的是，在任何睡眠剥夺实验中，都必须控制用于保持动物清醒的方法可能带来的混杂效应。手工剥夺研究为果蝇睡眠稳态的研究设立了基准，因其是一种对果蝇干扰最小的睡眠剥夺方法。SNAP技术能够高效地剥夺果蝇夜间睡眠，剥夺程度超过>98%，并且重要的是，其诱导的睡眠反弹与手工剥夺所获得的效果相当4,7。
自从确立果蝇睡眠定义的基础研究以来，已开发出多种高通量评估果蝇睡眠稳态的方法7,9,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 5R01NS051305-14 和 5R01NS076980-08 对 PJS 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 运动活动记录管 | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | 用于密封管子的石蜡 |
| 玻璃管 | Wale Apparatus | 244050 | 我们将直径为5 mm的Pyrex玻璃 管切割成65 mm长的管子 用于记录睡眠。也可直接购买已切割好的管子 。 |
| Nutri Fly Bloomington Formulation果蝇食物 | Genesee Scientific | 66-113 | 实验室可能使用自配的果蝇食物配方。记录睡眠时所用的食物必须与果蝇培养时所用的食物一致。 |
| 旋转式玻璃切割工具 | Dremel Multi Pro | 395 | 用于切割65 mm长的玻璃管 |
| 睡眠监测 | |||
| DAM系统及DAMFileScan软件 | Trikinetics | 用于从DAM监测器获取数据，并将采集的数据保存为适当格式的软件 | |
| 数据采集计算机 | Lenovo | Idea Centre AIO3 | 任何厂商的同等性能计算机均可替代 |
| 果蝇活动监测器 | Trikinetics | DAM2 | 用于记录果蝇的运动活动 |
| 环境监测器 | Trikinetics | DEnM | 非必需，但可方便地监测记录睡眠环境中的条件 |
| 光照控制器 | Trikinetics | LC4 | 可方便地控制SNAP装置开启和关闭的时间 |
| DAM数据采集用电源接口单元 | Trikinetics | PSIU-9 | 数据采集计算机记录Trikinetics运动活动数据所必需的设备 |
| RJ11连接器 | 7001-64PC | Multicomp | DAM监测器接受RJ11插头 |
| 分路器 | Trikinetics | SPLT5 | 用于连接最多5台DAM监测器 |
| 电话线缆 | Radioshack | 278-367 | 用于从DAM监测器获取数据的电话线 |
| 睡眠剥夺 | |||
| 电源 | Gw INSTEK | GPS-30300 | 为SNAP装置供电的电源 |
| 睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus） | Washington University School of Medicine机械车间 |
参考文献
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
- Zhdanova, I. V.....
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重印与许可
