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方法文章

睡眠消除装置：一种高效的睡眠剥夺方法 果蝇

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DOI：

10.3791/62105

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2020年12月14日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

本文内容

摘要

睡眠剥夺是研究睡眠功能和调控机制的有力工具。本文介绍了一种利用睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus）对黑腹果蝇（Drosophila）进行睡眠剥夺的实验方案，以及评估剥夺后反弹睡眠程度的方法。

摘要

睡眠稳态，即睡眠丧失后观察到的睡眠增加现象，是用于在动物界中识别睡眠的决定性标准之一。因此，睡眠剥夺和睡眠限制是研究睡眠功能时常用的有力工具。然而，睡眠剥夺实验本身存在固有问题，因为剥夺刺激本身可能引起生理和行为上的变化。因此，成功的睡眠剥夺技术应能使动物保持清醒，并理想地在不引发大量非预期后果的前提下，产生显著的睡眠反弹。本文介绍一种针对黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的睡眠剥夺技术。睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus, SNAP）每10秒施加一次刺激以诱导负向趋地性。尽管该刺激具有可预测性，但SNAP仍能有效阻止睡眠驱动力较高的果蝇在夜间超过>95%的睡眠。重要的是，随后产生的稳态反应与手工剥夺所获得的结果非常相似。通过调整刺激的时间和间隔，可减少睡眠丧失程度，从而考察刺激本身对生理和行为的非特异性影响。SNAP还可用于睡眠限制实验以及觉醒阈值的评估。SNAP是一种强大的睡眠干扰技术，有助于更深入地理解睡眠功能。

引言

睡眠在动物中几乎普遍存在，但其功能仍不明确。睡眠稳态是指睡眠剥夺后睡眠的代偿性增加，是睡眠的一个定义性特征，已被用于描述多种动物的睡眠状态1,2,3,4,5。

果蝇的睡眠与人类睡眠具有许多相似之处，包括对睡眠丧失产生强烈的稳态反应4,5。大量关于果蝇睡眠的研究利用睡眠剥夺来推断睡眠功能，方法是通过观察长时间清醒所累积的不良后果，同时也用于理解睡眠调控机制，即确定控制睡眠稳态调节的神经生物学机制。因此，研究发现睡眠剥夺的果蝇在学习与记忆6,7,8,9,10,11,12、结构可塑性13,14,15、视觉注意力16、神经元损伤后的恢复能力17,18、交配与攻击行为19,20、细胞增殖21以及对氧化应激的反应22,23等方面均表现出功能损伤。此外，对控制反弹性睡眠的神经生物学机制的研究，已为构成睡眠稳态调节系统的神经回路提供了关键性认识8,9,23,24,25,26,27,28,29。最后，除了揭示健康动物中睡眠功能的基本机制外，睡眠剥夺研究还增进了对疾病状态下睡眠功能的理解30,31。

尽管睡眠剥夺无疑是一种强有力的工具，但在进行任何睡眠剥夺实验时，重要的是要区分由长时间清醒引起的表型与由用于保持动物清醒的刺激本身所诱导的表型。通过手动剥夺或轻柔处理方式进行的睡眠剥夺，通常被认为是最低干扰性的睡眠剥夺标准方法。本文中，我们描述了一种利用睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus, SNAP）对果蝇进行睡眠剥夺的实验方案。SNAP 是一种每10秒向果蝇施加一次机械刺激的装置，通过诱发负向趋地性使果蝇保持清醒（图1）。SNAP 能够高效地剥夺果蝇夜间睡眠的 >98%，即使在睡眠驱动力较强的果蝇中亦如此8,32。SNAP 已在震颤敏感型果蝇中校准，其对果蝇的扰动不会造成伤害；使用 SNAP 进行睡眠剥夺所引发的睡眠反弹与手动剥夺所获得的反弹程度相当7。因此，SNAP 是一种在控制唤醒刺激影响的同时，对果蝇实施稳定睡眠剥夺的有效方法。

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方案

1. 实验准备

  1. 在果蝇羽化后立即收集至小瓶中，并按性别分离雄性和雌性果蝇。
    注意：睡眠实验通常使用雌性果蝇进行。务必收集未交配的雌蝇。已交配的雌蝇会产卵，卵孵化为幼虫，从而干扰数据分析。
  2. 将同一性别的果蝇以少于<20只的群体进行饲养。
    注意：在社会环境丰富化条件下饲养果蝇（群体数量>50只）会调节睡眠驱动力6,13，可能干扰对反弹睡眠的测量。此外，在经历社会环境丰富化后，果蝇的睡眠量会在数天内逐渐下降6。因此，基础睡眠水平不稳定，使反弹睡眠的分析变得复杂。将果蝇维持在少于<20只的群体中可避免这一潜在混杂因素。
  3. 将果蝇置于可控光照和湿度的环境中饲养3–5天。
    ​注意：果蝇的年龄和成熟度对其睡眠有显著影响。果蝇在出生后第一天睡眠量较高，并在3–5天龄时趋于稳定4。通常果蝇维持在12小时光照：12小时黑暗的循环周期中，相对湿度为50%。

2. 睡眠记录用导管的制备

注意：睡眠通过运动活动监测仪进行监测。一个监测仪可容纳32只果蝇，每只果蝇单独饲养在直径为5 mm的管中。通常以16只或32只果蝇为一组分析基因型。

  1. 准备适量的一端装有果蝇食物的试管。
    注意：已知饮食和代谢会影响睡眠33,34，因此尤其重要的是将果蝇放置在与其培养时相同的食物上。
  2. 用石蜡密封试管的一端。
    注意：睡眠剥夺与反弹实验为期五天，若未妥善密封，食物可能会变干。在密封良好的试管中，食物可维持10天甚至更长时间。因此，确保试管两端密封严密至关重要。然而，果蝇也可能被湿润的食物粘住。因此，建议在实验开始前1至2天制备好试管。
  3. 使用吸虫器将清醒且行为正常的果蝇逐只转移至65 mm长的玻璃管中用于睡眠记录，并用泡沫塞封住管口。
    ​注意：在将果蝇放入记录睡眠的试管时，切勿再次使其接触CO2麻醉。吸虫器由橡胶管制成，一端覆盖纱布并插入1 mL移液器吸头中。

3. 记录睡眠

  1. 将果蝇装入管中并放入活动监测仪以监测睡眠。
    ​注意：SNAP 每约 10 秒以 -60° 至 +60° 的角度来回摆动一次。监测仪在 -60° 位置保持约 5.9 秒；承载监测仪的托盘从 -60° 移动到 +60° 需约 2.9 秒，从 +60° 返回 -60° 需约 1 秒。通过调节供给电机的电压，可按需改变循环周期。
    1. 务必确保将管子以正确方向放入活动监测仪中。在正确方向下，装有食物的一端位于 SNAP 的上方，以防止果蝇被推入食物中。此外，有食物的一端应朝向监测仪上带有睡眠记录插孔的一侧。这可确保活动监测仪在 SNAP 中方向正确，从而在有效进行睡眠剥夺的同时同步监测活动。
  2. 将活动监测仪放入记录室中以监测睡眠。
  3. 至少连续监测两天以评估基础睡眠水平。
    注意：果蝇装入活动监测仪的当天通常不计入分析，作为适应期，以便果蝇适应在管中饲养的环境。基础睡眠记录从果蝇装载后的次日早晨开始，至少持续两个完整的昼夜（48 小时）。
  4. 使用活动记录软件，以每分钟为一个时间区间，保存从某一天开灯时刻到前一天开灯时刻之间的果蝇运动活动计数（例如，从上午 8 点到次日上午 8 点）。
  5. 利用自定义宏程序，将连续 5 分钟无活动作为一次睡眠片段的判定阈值，从运动活动数据中估算睡眠时间35。
    ​注意：从运动活动计数中可计算多种睡眠指标，包括每小时睡眠分钟数（min/h）、24 小时内的总睡眠时间、白天和夜间睡眠片段的平均长度与最长持续时间36。

4. 睡眠剥夺与恢复

  1. 由于果蝇的睡眠剥夺时间可以长短不一（例如 12 小时、24 小时和 36 小时），恢复睡眠的评估也可在不同时间间隔进行（例如 6 小时、12 小时、24 小时和 48 小时），因此应根据实验需求确定恢复期的持续时间。可通过睡眠增益/损失图或在预设时间间隔（例如 6 小时）内分析恢复睡眠的百分比来可视化睡眠恢复情况。
  2. 若果蝇在两个基线日的睡眠状态稳定，则在第三天将活动监测仪放入 SNAP 装置中进行整夜睡眠剥夺。
    注意：果蝇在多种睡眠时长下均会表现出显著的睡眠反弹8,32,37,38，但必须确保睡眠状态稳定，才能可靠地评估反弹睡眠。当两个基线日之间的睡眠差异在 ±100 分钟以内时，视为睡眠稳定。
  3. 确保活动监测仪已用监测仪固定针牢固固定，监测线已插入电源，监测仪方向正确——食物端朝后，塑料屏障朝前（图 1）。
    注意：SNAP 装置设计为每 10 秒旋转一次凸轮（图 1）。当装置处于“"up"”位置时，塑料插入件会推动试管复位。每次循环开始前复位试管，对确保所有试管具有完整的运动范围至关重要。
  4. 在整夜睡眠剥夺结束后光照开启时，立即拔掉活动监测仪电源，并将监测仪从 SNAP 中取出。
    注意：必须在 12 小时整夜睡眠剥夺结束后光照开启时立即终止睡眠剥夺，并将果蝇立即转入恢复阶段。即使延迟 20–30 分钟转入恢复阶段，也可能影响反弹睡眠的程度。
  5. 将果蝇放入记录室中，在两天（48 小时）内不受干扰地监测其恢复睡眠。
    注意：若记录室同时用于其他实验，必须格外注意避免刺激正在恢复的果蝇。
  6. 计算睡眠损失量。对每只果蝇，计算其在睡眠剥夺期间每小时与对应基线小时之间的睡眠差值；将各小时差值相加，得到总睡眠损失量。
  7. 计算睡眠恢复量。对每只果蝇，计算其在恢复期间每小时与对应基线小时之间的睡眠差值；将各小时差值相加，得到总睡眠增益量。
    注意：果蝇是否真正经历了睡眠剥夺需通过实证判断。因此，实验者应检查睡眠损失百分比。若果蝇未损失足够量的睡眠，可将其从分析中排除。尽管其他睡眠剥夺方法可能需要此步骤，但使用 SNAP 时通常极少需要。更常见的情况是，在睡眠剥夺开始前，个别果蝇的睡眠状态不稳定。若睡眠不稳定，则无法计算稳态。我们接受在睡眠剥夺开始前计算的睡眠差异不超过 ±100 分钟的果蝇作为纳入分析的候选对象。偶尔，个别果蝇在 24 小时内的睡眠分布不均（例如，某些个体可能在白天完成其 60–70% 的睡眠配额，因此在夜间剥夺 12 小时时仅损失其 24 小时睡眠配额的一小部分）。这些果蝇可单独进行评估。
  8. 对每种基因型，分别计算在恢复期 12 小时、24 小时和 48 小时内恢复的平均睡眠百分比（相对于基线）。
  9. 根据睡眠数据，计算每种基因型在基线日和恢复日的平均及最大日间睡眠片段长度。
    注意：果蝇的反弹睡眠特征表现为恢复期间睡眠总量增加和睡眠深度增加。睡眠片段的连续性（consolidation）被用作衡量睡眠深度的指标，觉醒阈值也可用于评估睡眠深度。

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结果

野生型果蝇品系采用Canton S（Cs）。果蝇饲养于12小时光照：12小时黑暗的循环条件下，并在夜间连续12小时进行睡眠剥夺。对Cs果蝇在基线日（bs）、睡眠剥夺日（sd）以及随后两个恢复日（rec1和rec2）的睡眠谱进行观察（图2A）表明，在SNAP系统中果蝇确实实现了有效的睡眠剥夺，并在恢复期出现符合文献报道特征的日间睡眠反弹4,5。SNAP系统维持果蝇清醒的有效性还可通过睡眠剥夺期间果蝇表现出的高活动水平（300–350次/小时）得以证实（图2B）。事实上，监测睡眠剥夺期间果蝇的活动次数可作为评估剥夺方案有效性的一个有用指标，或间接反映睡眠驱动力的强弱。当睡眠剥夺效果不佳时，果蝇在剥夺期间的活动水平较低；而处于高睡眠驱动力状态的果蝇在每次刺激后会迅速入睡，在管内移动的距离也较少35...

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讨论

2000年，两个研究团队独立地在Drosophila（果蝇）中描述了睡眠行为4,5。在这些开创性研究中，研究人员通过轻柔操作（即手工剥夺）使果蝇保持清醒，并发现其表现出显著的稳态反应以应对整夜的睡眠剥夺。重要的是，在任何睡眠剥夺实验中，都必须控制用于保持动物清醒的方法可能带来的混杂效应。手工剥夺研究为果蝇睡眠稳态的研究设立了基准，因其是一种对果蝇干扰最小的睡眠剥夺方法。SNAP技术能够高效地剥夺果蝇夜间睡眠，剥夺程度超过>98%，并且重要的是，其诱导的睡眠反弹与手工剥夺所获得的效果相当4,7。

自从确立果蝇睡眠定义的基础研究以来，已开发出多种高通量评估果蝇睡眠稳态的方法7,9,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）基金 5R01NS051305-14 和 5R01NS076980-08 对 PJS 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
运动活动记录管
Fisher Tissue Prep WaxThermo Fisher13404-122用于密封管子的石蜡
玻璃管Wale Apparatus244050我们将直径为5 mm的Pyrex玻璃 管切割成65 mm长的管子 用于记录睡眠。也可直接购买已切割好的管子 。
Nutri Fly Bloomington Formulation果蝇食物Genesee Scientific66-113实验室可能使用自配的果蝇食物配方。记录睡眠时所用的食物必须与果蝇培养时所用的食物一致。
旋转式玻璃切割工具Dremel Multi Pro395用于切割65 mm长的玻璃管 
睡眠监测
DAM系统及DAMFileScan软件Trikinetics用于从DAM监测器获取数据，并将采集的数据保存为适当格式的软件
数据采集计算机LenovoIdea Centre AIO3任何厂商的同等性能计算机均可替代
果蝇活动监测器TrikineticsDAM2用于记录果蝇的运动活动
环境监测器TrikineticsDEnM非必需，但可方便地监测记录睡眠环境中的条件
光照控制器TrikineticsLC4可方便地控制SNAP装置开启和关闭的时间
DAM数据采集用电源接口单元TrikineticsPSIU-9数据采集计算机记录Trikinetics运动活动数据所必需的设备
RJ11连接器7001-64PCMulticompDAM监测器接受RJ11插头
分路器TrikineticsSPLT5用于连接最多5台DAM监测器
电话线缆Radioshack278-367用于从DAM监测器获取数据的电话线
睡眠剥夺
电源Gw INSTEKGPS-30300为SNAP装置供电的电源
睡眠消除装置（Sleep Nullifying Apparatus）Washington University School of Medicine机械车间

参考文献

  1. Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
  2. Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C. Characterization of sleep in Aplysia californica. Sleep. 37 (9), 1453-1463 (2014).
  3. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  4. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  5. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  6. Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
  7. Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
  8. Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
  9. Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
  10. Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
  11. Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197(2020).
  12. Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
  13. Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
  14. Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
  15. Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
  16. Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, Pt 24 (2018).
  17. Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
  18. Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
  19. Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
  20. Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643(2015).
  21. Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
  22. Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
  23. Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
  24. Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
  25. Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
  26. Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
  27. Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
  28. Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
  29. Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
  30. Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
  31. Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
  32. Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166(2020).
  33. Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
  34. Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
  35. Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
  36. Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
  37. Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
  38. Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
  39. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  40. Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454(2015).
  41. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27 (4), 628-639 (2004).
  42. Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
  43. Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
  44. Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890(2011).

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