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利用点击化学法检测脂肪酰化蛋白质的炔基脂肪酸类似物优化整合方法

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DOI：

10.3791/62107

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2021年4月9日

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1Department of Biology, University of Waterloo

本文内容

摘要

脂肪酰化研究在细胞蛋白质相互作用及疾病中具有重要意义。本文介绍了一种改进的检测脂肪酰化蛋白质的点击化学实验方案，该方法可应用于多种细胞类型，并可与其他实验技术联用，包括脉冲追踪实验和质谱分析。

摘要

脂肪酰化是指将饱和脂肪酸共价添加到蛋白质底物上的过程，除了在癌症和神经退行性疾病中的意义外，它在调控多种细胞功能方面也具有重要作用。近年来脂肪酰化检测技术的发展实现了高效且无危害的脂肪酰化蛋白检测，尤其是通过使用生物正交标记的点击化学方法。然而，点击化学检测可能受到长链脂肪酸在细胞培养中溶解性差及其潜在毒性效应的限制。本文描述了一种优化递送的标记方法，该方法结合使用皂化脂肪酸、无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）以及去脂培养基，可提高难以检测的脂肪酰化蛋白的检出率。该效果在炔基硬脂酸类似物17-ODYA上表现最为显著，该类似物是目前点击化学检测酰化蛋白中最常用的脂肪酸类似物。这一改进可增强细胞对脂肪酸类似物的摄取，提高对酰化蛋白检测的灵敏度。此外，该方法可应用于多种细胞类型，并可与其他实验技术联用，例如脉冲追踪分析、细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记以及质谱分析，用于脂肪酰化蛋白的定量分析。

引言

脂肪酰化是指将脂肪酸共价添加到蛋白质上的过程，其在促进蛋白质-膜相互作用方面的作用已被广泛认知，同时也被证明可促进蛋白质-蛋白质相互作用、构象变化，并调控酶的催化位点1,2,3,4,5,6,7。脂肪酰化已被视为多种疾病中潜在的药物靶点，包括感染、癌症、炎症和神经退行性疾病，其中已有文献报道棕榈酰化过程出现异常8,9,10,11,12,13。这一进展主要得益于新型化学检测方法的发展，使得S-酰化蛋白质靶标的高通量鉴定成为可能。

脂肪酰化可包括多种涉及饱和与不饱和脂肪酸共价添加的修饰，但通常指N-豆蔻酰化和S-酰化。N-豆蔻酰化是指在新生多肽链翻译过程中，或在蛋白水解切割后新暴露的N端甘氨酸上，翻译后地将豆蔻酸添加至N端甘氨酸残基2,14。N-豆蔻酰化通过不可逆的酰胺键发生。另一方面，S-酰化通常指长链脂肪酸通过硫酯键可逆地添加至半胱氨酸残基。此类修饰最常见的形式是棕榈酸的掺入，因此通常称为S-棕榈酰化，或简称为棕榈酰化11,15。在许多方面，S-棕榈酰化类似于磷酸化。它具有动态性，受酶调控，并且正被证明具有高度的可操作性。

在过去十年之前，由于检测方法有限，脂肪酰化研究一直受到阻碍，这些方法需要使用放射性标记的脂肪酸。这带来了若干缺点，包括成本高昂、安全问题以及极长的检测时间。通常使用氚标记或碘标记的棕榈酸来检测S-酰化16。其中，氚标记棕榈酸需要通过放射自显影胶片进行长时间检测，耗时可达数周至数月。虽然[125I]碘代脂肪酸类似物缩短了检测时间，但其安全风险显著更高，并且要求对实验人员的甲状腺功能进行密切监测。此外，这些方法不具备定量能力，因此无法测量动态的棕榈酰化过程；同时，由于需要额外的个人防护装备和放射性监测，实验的准备和清理工作也十分耗时。最后，放射性标记不适合蛋白质组学研究，通常仅限于对特定目标蛋白进行低通量检测。随着越来越多的底物被发现，以及介导每种修饰的酶不可避免地被鉴定出来，显然需要新的检测方法17,18,19,20,21。几乎在同一时期，多种检测脂肪酰化蛋白的新方法相继出现。第一种方法利用了S-酰化中硫酯键的可逆性和反应活性。酰基-生物素交换（ABE）检测法通过化学方式将棕榈酸替换为生物素，随后使用链霉亲和素琼脂糖 beads 沉淀S-酰化蛋白，并通过Western blot直接检测22,23,24。接下来发展出了脂肪酸的生物正交标记技术，以及向标签或手柄进行化学选择性添加的方法，包括施陶丁格连接反应和点击化学（click chemistry）25,26,27,28,29,30,31,32,33。最后，类似于ABE方法，酰基-树脂辅助捕获（RAC）技术本质上是用巯基反应性 beads 替换S-酰化位点，以实现对S-酰化蛋白的捕获与检测34,35。总体而言，基于交换反应和点击化学的检测方法为酰化检测及下游分析中的亲和纯化提供了更高效、更灵敏的技术手段，并由此促成了数千种S-酰化蛋白的发现8,36。

点击化学（click chemistry）这一术语涵盖了一类化学反应，但最常指的是铜(I)催化的叠氮-炔烃[3+2]环加成反应机制，即炔基与叠氮基之间的反应27,28,37。特别是在脂肪酰化研究中，点击化学通过将生物正交的16碳炔基棕榈酸（15-十六碳炔酸；15-HDYA）或14碳炔基肉豆蔻酸（13-十四碳炔酸；13-TDYA）分别引入细胞，用于标记内源性酰化蛋白，从而实现对S-棕榈酰化或N-肉豆蔻酰化的检测28。在细胞裂解并免疫沉淀目标蛋白后，进行点击化学反应（炔烃与叠氮之间的共价连接），将亲和探针（通常为生物素）连接至酰化蛋白，以便通过蛋白质印迹法进行检测28,37。 alternatively，也可在全细胞裂解液中进行点击化学反应，随后通过亲和纯化富集脂肪酰化蛋白，并利用质谱进行鉴定。相较于放射性标记，使用叠氮-生物素的初始点击化学反应使检测的选择性和灵敏度提高了超过一百万倍2。点击化学的另一优势在于其可与其他经典标记方法联用，例如结合使用叠氮-高丙氨酸进行脉冲-追踪实验，以实现对蛋白质周转的定量分析38。此外，除生物素或其他生化探针（如FLAG或Myc标签）外，还可使用荧光探针，以研究蛋白质的亚细胞定位16,28,39。

尽管点击化学相对易于使用，但其检测效果可能受到长链游离脂肪酸在细胞培养中溶解度低以及潜在毒性的限制40。特别是，尽管在大多数蛋白质的S-酰化过程中优先选择棕榈酸盐，但由于商业可得性和相对较低的成本，许多研究使用了18碳硬脂酸（17-十八碳炔酸 - 17-ODYA）而非棕榈酸（15-HDYA）来检测S-酰化蛋白。然而，17-ODYA溶解性极差，在使用时需要特别注意。此外，点击化学所需的化学品在制备和储存方面可能需要一些精细的操作。本文所述方案介绍了一种标记方法，通过脂肪酸皂化、脂肪酸游离牛血清白蛋白（BSA）递送以及去脂胎牛血清（FBS）的使用，优化了递送过程，从而提高溶解度，并避免向细胞添加游离脂肪酸可能带来的毒性效应28。该方法适用于多种细胞类型，甚至已在活体动物中成功应用28。

方案

1. 细胞培养

  1. 为了配制用于细胞培养的 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），加入 10% 胎牛血清（FBS）、1× 青霉素-链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和 100 mM 丙酮酸钠（体积分数 1%）。
  2. 将约 5 × 105 个 HEK293T 细胞接种至 6 孔组织培养板的每孔中，在 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中培养 18 小时，使细胞融合度达到 75%–80%。
  3. 脂肪酸血清剥夺
    1. 配制标记培养基时，按上述步骤 1.1 配制 DMEM，但不添加 10% FBS，改用 5% 硫酸葡聚糖-活性炭处理的胎牛血清（DCC-FBS）替代。使用前预热至 37 °C。
    2. 在室温下用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔洗涤细胞，并更换为标记培养基。
      注意：HEK293T 细胞容易从组织培养板上脱落。洗涤细胞和更换培养基时需小心操作。在将培养板移入或移出培养箱的过程中，应尽可能减少震荡。
    3. 将细胞放回 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育约 45 分钟（最短有效时间为 15 分钟），最长可至 60 分钟，之后再进行脂肪酸代谢标记实验。

2. 脂肪酸类似物的制备与皂化

  1. 提前配制炔基脂肪酸的储备液：将以下浓度的炔基脂肪酸溶于DMSO中，并于-20 °C保存。根据需要在室温下解冻。为获得最佳性能，应在N2或Ar气氛下储存。
    炔基肉豆蔻酸（13-十四碳炔酸，13-TDYA）：25 mM
    炔基棕榈酸（15-十六碳炔酸，15-HDYA）：100 mM
    ​炔基硬脂酸（17-十八碳炔酸，17-ODYA）：100 mM
  2. 配制20%无脂肪酸牛血清白蛋白（FAFBSA）：在一次性50 mL离心管中称取2 g FAFBSA。
    1. 加入预热至37 °C的DMEM培养基定容至10 mL。
    2. 通过翻转混匀或涡旋振荡混合，并置于37 °C水浴中使FAFBSA完全溶解。
    3. 使用0.2 µm滤器过滤除菌。
    4. 分装成约1 mL每份，于-20 °C保存。根据需要解冻，并在使用前于水浴中加热至37 °C。
  3. 为提高脂肪酸及其类似物的溶解性，可在3 mL玻璃锥形反应小瓶中加入过量20%摩尔浓度的氢氧化钾（KOH）进行皂化处理。
    注：此类小瓶可使盐保持溶解状态，同时避免因高温导致FAFBSA凝固。使用玻璃容器还可防止脂肪酸粘附于塑料表面。
    1. 用移液器将至少2 µL炔基脂肪酸类似物直接加入3 mL锥形反应小瓶底部。每孔6孔板使用约2 µL脂质（见表1）。
      ​注：由于脂肪酸具有疏水性，建议在将目标体积移入反应小瓶前，先反复吸取数次以润湿移液器吸头尖端。
    2. 将1 M KOH稀释至相对于炔基脂肪酸标记物过量20%摩尔浓度的溶液（13-TDYA为30 mM，15-HDYA和17-ODYA为120 mM）。
    3. 将等体积的稀释后KOH溶液（1 µL : 1 µL 脂肪酸 : KOH）靠近反应小瓶底部边缘处加入，使KOH液滴与脂肪酸充分接触并混合。
    4. 盖紧瓶盖并轻轻敲击以混匀溶液。
      注：混合物可能迅速固化，尤其是随着脂肪酸烃链长度增加。注意不要吸取固体（即不得通过移液操作进行混合）。
    5. 在65 °C加热反应小瓶约5分钟，或直至脂肪酸完全溶解（溶液变澄清）。
      注：碳原子数较多且溶解度较低的脂肪酸（如硬脂酸，17-ODYA）可能需要更长时间才能在65 °C下完全与KOH反应。必要时可将温度升至70 °C。建议使用水浴，并注意防止液体过度蒸发。
    6. 当脂肪酸完全溶解且无可见固体残留时，加入预热的20% FAFBSA，使脂肪酸 : KOH : FAFBSA的体积比为1 : 1 : 50，从而获得终浓度为20倍的BSA结合型炔基脂肪酸溶液。
    7. 通过上下吹打混匀。溶液通常呈澄清透明，无可见固体。
      注：通常情况下，任何微小固体颗粒在37 °C孵育后均可溶解。
    8. 将脂肪酸与FAFBSA在37 °C孵育15分钟。
      注：此时皂化标记物的稳定性超过15分钟。

       
总培养基体积（mL）脂肪酸或脂肪酸类似物体积（µL）KOH 体积（µL）20% FAFBSA 体积（µL）BSA-结合皂化标记物总体积（µL）
444200208
222100104

表1：皂化脂肪酸标记比例。 根据所用培养基体积，用于脂肪酸标记皂化的脂肪酸、KOH 和 FAFBSA 的实验体积。

  1. 作为对照，使用未标记炔基的脂肪酸重复步骤 2.3。
  2. 将 20 倍浓缩的脂肪酸-BSA 偶联物以 1/20 体积直接加入饥饿培养基中（通常为 2 mL 培养基/细胞中加入 100 µL），使终浓度达到 1% BSA，炔基肉豆蔻酸为 25 µM，炔基棕榈酸和炔基硬脂酸为 100 µM。
    注意：为尽量减少对贴壁细胞的物理扰动，应将移液枪尖端靠近培养基表面形成液滴，而不是直接将液体注入培养基中。若使用酰化抑制剂，应在加入标记脂肪酸前至少 15 分钟添加。具体时间可能因细胞类型或所用抑制剂而异。建议此步骤也采用皂化处理28。
    1. 作为比较，可通过移液直接向饥饿培养基中加入 2 µL（或相当于皂化体积）未标记脂肪酸，以添加非皂化脂质。
    2. 将细胞放回培养箱，孵育 3–6 小时。
      注意：每种细胞类型或实验条件可能需要确定最佳标记时间。较长的孵育时间 可能导致脂肪酸通过 β-氧化降解和/或掺入其他脂质类别（如磷脂）中28。
  3. 在室温下用 1× PBS 轻柔洗涤细胞。
  4. 使用 500 µL 乙二胺四乙酸（EDTA）-free 改良型放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液（含 0.1% SDS、50 mM N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸（HEPES）pH 7.4、150 mM NaCl、1% 非变性去污剂、0.5% 脱氧胆酸钠、2 mM MgCl2，并新鲜添加 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 10 µg/µL 胃蛋白酶抑制剂 A（或 EDTA-free 完整蛋白酶抑制剂混合物））在 4 °C 条件下轻轻振荡裂解 15 分钟，收集细胞并进行裂解。
    1. 在 4 °C 条件下以 16,000 x g 离心 10 分钟。
    2. 将上清液收集至 1.7 mL 微量离心管中，并在 -20 °C 保存，直至准备进行点击反应。
      注意：本方案可在此处暂停。裂解液在 -20 °C 下可稳定保存长达 1 个月。但建议尽快进行点击反应。
  5. 根据制造商说明书（如去垢剂兼容性（DC）测定法）使用适当的蛋白浓度检测方法测定蛋白浓度。

3. 细胞裂解液的点击化学反应

  1. 准备点击化学所需的试剂。
    1. 将三（苄基三唑基甲基）胺（TBTA）溶于DMSO中，配制成2 mM的溶液。分装成小份，加入干燥剂，于-20 °C保存，可稳定保存2-3个月。最好在N2或Ar气氛下保存。
    2. 将CuSO4溶于ddH2O中，配制成50 mM的溶液。室温保存，最长可保存2个月。
    3. 将三羧乙基膦（TCEP）溶于ddH2O中，配制成250 mM的溶液。避光保存于4 °C，并在点击反应前新鲜稀释为50 mM的工作液。
    4. 在DMSO中配制2 mM的叠氮化物溶液。分装成小份，加入干燥剂，于-20 °C保存，最长可保存6个月。最好在N2或Ar气氛下保存。
      注意：观察发现，含有三个或更多聚乙二醇基团的产物与生物素结合效果最佳。
  2. 将50–100 µg蛋白裂解液加入1.7 mL微量离心管中，使用与上述相同的裂解缓冲液调整至相同体积。
    注意：反应体系应尽可能小（20–100 µL）。
    1. 向每个样品中加入十二烷基硫酸钠（SDS），使其终浓度为1%。
    2. 配制点击反应试剂的主混合液，使加入裂解液后各成分的终浓度为：100 µM TBTA（2 mM母液）、1 mM CuSO4（50 mM母液）、1 mM TCEP（50 mM母液）和100 µM叠氮探针（2 mM母液）。按比例混合母液（见表2）。
      注意：添加顺序很重要。每加入一种组分后需充分混匀。
    3. 将适量主混合液加入各裂解液样品中，通过移液器反复吹打混匀。
    4. 在37 °C水浴中避光孵育30分钟，期间偶尔振荡或混匀。
总反应体积 (µL)蛋白体积  (µL)TBTA (2 mM) 体积 (µL)CuSO4 (50 mM) 体积 (µL)TCEP (50 mM) 体积 (µL)叠氮探针 (2 mM) 体积 (µL)
50432.5112.5
100865225

表2：点击化学试剂与蛋白质的体积比例。 点击化学试剂的实验用量及其对应的储备液浓度，以及蛋白质样品的体积。

4. 免疫沉淀蛋白的点击化学反应

  1. 或者，也可以对免疫沉淀（IP）的蛋白质进行点击反应 开或关 珠子。
    注意：通常，执行点击 关闭 磁珠的使用可产生最低的背景信号，在检测新目标蛋白时效果最佳。
    1. 使用先前所述的磷酸钙DNA共沉淀法，转染表达目的蛋白的细胞，此处为野生型豆蔻酰化C端亨廷顿蛋白（HTT）与GFP的融合蛋白（myr-ctHTT-GFP），以及G2A突变型ctHTT-GFP。41.
      1. 接种 2.5 × 105 6孔组织培养板中每孔接种细胞，培养过夜至约70-80%汇合度。
      2. 通过将2.5 µg DNA溶于10 µL溶液中，并加入99.75 µL分子级H2O至1.7 mL 微量离心管中。然后加入15.25 µL CaCl2 逐滴加入DNA混合物中。
      3. 加入DNA/CaCl₂2 将混合物逐滴加入另一管中，该管含有125 µL 2x HEPES缓冲盐溶液（HBS，pH 7.0），同时混匀。
      4. 缓慢加入 DNA/CaCl₂2将 HBS 混合物加入细胞中。2–4 小时后更换培养基，继续培养过夜。随后按照步骤 1.3–2.8 进行标记。
    2. 在裂解缓冲液中制备等体积的500 µg蛋白。
    3. 使用兔抗GFP抗体与ctHTT-GFP在4 °C旋转孵育过夜，进行免疫沉淀。
    4. 向每管中加入15–20 µL用裂解缓冲液预平衡的蛋白G磁珠，4 °C下翻转反应3小时。
    5. 用裂解缓冲液洗涤磁珠，然后重悬于45 µL含1% SDS的50 mM HEPES缓冲液中。
    6. 在80 °C下加热磁珠15分钟，每5分钟左右倒置离心管或进行振荡。短暂离心后，立即将离心管放回80 °C继续孵育。
    7. 收集含有蛋白质的上清液，此时样品仍需保持温热。
      注意：如果暂不立即进行点击化学反应，可在本步骤暂停实验流程，将免疫沉淀样品保存在 -20 °C 或 -80 °C。
    8. 让43 µL上清液与7 µL点击化学试剂主混合液反应。
    9. 按照步骤 3.2.3 中所述进行反应。

5. SDS-PAGE 和蛋白质印迹

  1. 加入含有25 mM二硫苏糖醇（DTT）的1×上样缓冲液以终止反应并使蛋白质变性，95 °C加热5分钟。
    注意：DTT 的使用浓度最高可达 100 mM28不要将β-巯基乙醇用于S-酰化蛋白，因为它可能水解硫酯键，从而去除偶联的脂肪酸类似物。
  2. 短暂离心样品。
  3. 在聚丙烯酰胺凝胶上用SDS-PAGE分离蛋白质，每组设两个重复。
    注意：为通过KOH碱处理确认硫酯键的存在，需要使用两块凝胶。若使用荧光叠氮探针，可在凝胶内或转膜后通过指定的激发通道检测酰化。
  4. 转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（在甲醇中活化后用ddH₂O冲洗）2使用半干式转膜仪，25 V、1.0 A（恒流）条件下转膜30分钟，每次5分钟。
  5. 用ddH₂O短暂冲洗膜后2将一张复膜置于含0.1 M KOH的甲醇/水溶液（9:1 v/v）中浸泡，另一张置于含0.1 M Tris-HCl（pH 7.0）的甲醇/水溶液（9:1 v/v）中作为非碱性对照，室温下轻轻振荡孵育60分钟。
  6. 用ddH2O短暂漂洗膜，随后用PBS-T（1× PBS，0.1% Tween 20）洗涤6次，每次5分钟。
    注意：彻底清洗。
  7. 在5%脱脂奶粉封闭缓冲液（1x PBS，0.1% Tween20）中4℃封闭膜过夜。

6. 进行蛋白质印迹实验

  1. 如注明，将荧光标记的链霉亲和素（1:5000）和内参抗体抗GAPDH罗丹明（1:5000）加入5% BSA封闭缓冲液（0.01% SDS，1× PBS，0.1% Tween20）中，在室温下避光、轻摇孵育45–60分钟。
    1. 首先在5%脱脂奶粉封闭缓冲液中用一抗抗GFP抗体孵育免疫沉淀后的蛋白印迹膜，然后按照步骤6.1的方法在5% BSA缓冲液中使用相应的二抗进行孵育。
  2. 用PBS-T缓冲液（1× PBS，0.1% Tween20）洗涤膜4次，每次5分钟，成像前用ddH2O冲洗。

结果

通过蛋白质印迹法（western blot）检测脂肪酰化蛋白的信号强度，可以直观比较皂化与非皂化（non-sap）炔基脂肪酸在点击化学检测中的标记效率差异（图1）。随着酰基链长度的增加，观察到明显的影响。在使用炔基硬脂酸（alk-stear）标记的细胞中，将脂肪酸进行皂化处理并通过BSA递送用于代谢标记，显著增强了通过点击化学及荧光叠氮探针检测到的S-酰化蛋白信号（图1，右侧），表明细胞对炔基脂肪酸标记物的整体摄取显著提高。相反，在使用最短且溶解度最高的脂肪酸——炔基肉豆蔻酸（alk-myr；13-十四碳炔酸或13-TDYA）处理的细胞中，未观察到明显差异。使用炔基棕榈酸标记的细胞（图1，中图）显示出比炔基肉豆蔻酸更高的标记信号增强，但增强程度低于炔基硬脂酸。

重要的是，用 0.1 M KOH 处理 PVDF 膜可基本去除在炔基棕榈酸和炔基硬脂酸中孵育的细胞中的脂肪酸标记信号，证实大部分信号来源于酯键或硫酯键（图 1，中图和右图，底排）。与预期一致，炔基肉豆蔻酸的掺入信号大多耐碱（图 1，左图，底排），这是由于肉豆蔻酸通过酰胺键与蛋白质连接所致。

图2 展示了点击化学在检测免疫沉淀蛋白脂肪酰化修饰方面的多功能性与高灵敏度。HEK293T细胞被转染表达N端肉豆蔻酰化的C端亨廷顿蛋白（HTT）与GFP的融合蛋白（myr-ctHTT-GFP），并用炔基标记的肉豆蔻酸进行标记，具体方法如前所述18。免疫沉淀后，将ctHTT-GFP从磁珠上洗脱，并与细胞裂解液一同进行点击化学反应。不仅在免疫沉淀物中检测到野生型（WT）myr-ctHTT-GFP的肉豆蔻酰化修饰，且在裂解液中信号更强；而G2A突变则完全阻断了ctHTT-GFP的肉豆蔻酰化（图2）。

显示炔基脂肪酸标记结果、GAPDH对照及分析的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳图
图1：利用点击化学检测脂肪酰化蛋白。 HEK293T细胞按照方案2.1–2.7所述，直接孵育指定脂肪酸（非皂化，non-sap）或经皂化（sap）后与载体蛋白BSA共同孵育。将100 µg蛋白裂解液通过点击化学反应使炔基脂肪酸与荧光叠氮试剂连接，随后经SDS-PAGE分离并转移至PVDF膜。经0.1 M Tris pH 7.0或0.1 M KOH处理以断裂硫酯键后，使用荧光叠氮试剂检测脂肪酰化修饰。GAPDH作为上样对照，使用抗GAPDH罗丹明抗体（1:5,000）。Alk-myr = 13-TDYA，alk-pal = 15-HDYA，alk-ste = 17-ODYA。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示野生型和G2A样本的蛋白裂解液及免疫沉淀结果的SDS-PAGE凝胶分析。
图2：利用点击化学检测N-肉豆蔻酰化ctHTT-GFP。 HEK293T细胞转染了C端截短（ct）且可肉豆蔻酰化的HTT形式（myr-ctHTT-GFP），并用炔基肉豆蔻酸进行标记。同时包含一种关键甘氨酸被丙氨酸取代而无法肉豆蔻酰化的突变形式（G2A）。收集细胞并裂解后，使用山羊抗GFP抗体对ctHTT-GFP进行免疫沉淀。裂解液（左侧）以及从磁珠上洗脱下来的免疫沉淀产物均进行点击化学反应。使用链霉亲和素Alexa 680（SA680）检测肉豆蔻酰化修饰，使用兔抗GFP抗体联合抗兔Alexa 488抗体检测GFP表达。请点击此处查看该图的放大版本。

代谢标记过程示意图、点击反应、蛋白质定量、SDS-PAGE、Western印迹。
图3：实验方案的工作流程示意图。 本方案中主要实验步骤的工作流程概览。图中注明了若干可暂停实验的关键节点。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

将脂肪酸直接加入培养细胞中可能导致溶解度降低、脂质沉淀以及脂毒性40。因此，直接向细胞添加脂肪酸不仅可能导致细胞摄取效率低下和脂肪酸标记物的可利用性不足，还可能造成可用于后续分析的活细胞数量减少，并激活非靶向通路。然而，目前许多用于点击化学检测的代谢标记方案仍涉及直接添加脂肪酸 ，迄今为止大量使用点击化学检测的棕榈酰化蛋白质组研究很少对脂肪酸标记物进行皂化处理或与BSA孵育8,36。需要认识到，点击化学检测脂肪酰化蛋白的效率和灵敏度依赖于脂肪酸类似物在细胞内的充分摄取。因此，可以合理推测，在以往的蛋白质组学研究中，许多S-酰化蛋白可能因脂肪酸标记物在细胞内掺入不足而导致其可利用性较低，从而未被检测到，尤其是在使用长链脂肪酸17-ODYA时。17-ODYA（即炔基硬脂酸）由于其商业可得性及早期应用，已成为多项研究中广泛选用的标记物8,36。然而，本方案的结果表明，与较短链脂肪酸（如棕榈酸或肉豆蔻酸）相比，对17-ODYA进行皂化处理可最大程度地提高S-酰化蛋白的检测信号。因此，使用皂化处理后的标记物重复这些实验，可能发现此前被忽略的S-酰化底物蛋白。此外，尽管大多数棕榈酰转移酶偏好棕榈酸作为S-酰化的底物，但部分酶对其他链长的脂肪酸（如硬脂酸）具有偏好性15,38,44。同时，某些蛋白质甚至其特定位点也可能对某一类脂肪酸具有选择性偏好15,45。因此，使用17-ODYA的研究可能更倾向于检测到被硬脂酸S-酰化的蛋白，而非棕榈酸修饰的蛋白，同时也可能因检测灵敏度较低而低估了这些蛋白的存在。

点击化学中改进的代谢标记效率依赖于脂质皂化以及与FAFBSA孵育的步骤，同时还依赖于去脂胎牛血清（FBS）。在进行FAFBSA孵育前，必须使用KOH将所有脂肪酸完全皂化，直至无可见固体残留。该步骤可能较难操作，时机控制至关重要。当皂化的脂肪酸在65 °C下完全溶解后，应立即加入预热的BSA，因为继续加热会导致脂肪酸中的DMSO蒸发。此外，皂化标记物一旦开始冷却便会重新固化。因此，FAFBSA必须保持温热，并在盐完全溶解后迅速加入。玻璃反应小瓶及其形状在该步骤中至关重要：它们可使皂化的脂质保持足够温度以维持溶解状态，同时又不会过热而导致FAFBSA凝固。此步骤中还需通过移液充分混匀，以确保标记反应体系形成均一溶液。

点击化学所需的试剂需要妥善保存，通常需在含有干燥剂或置于氮气（N2）或氩气（Ar）环境中，于 -20 °C 至 -80 °C 条件下储存。若未检测到酰化信号或信号较弱，可能是由于试剂不稳定，尤其是存放时间较长的 TBTA 和叠氮化物储备液。此外，荧光标记的叠氮化物储备液需特别注意避光保存。另外，脂质剥夺方法和标记时间等变量可能需要根据所用细胞类型进行优化测试。例如，神经元细胞可能需要更长的标记时间，因为培养基更换和脂质剥夺操作较为困难（未发表数据）。

当用于长链脂肪酸时，该方案的优势最为显著。对于短链脂肪酸，信号强度的提升虽不那么明显，但仍可能对细胞具有保护作用。尽管建议的改进措施通常可提高蛋白质酰化修饰的检测效果，但点击化学仍被认为是一种以脂质为中心的方法1，仅限于检测动态的而非稳定S-酰化修饰的蛋白质1。其他需要注意的局限性包括：需要进行脂肪酸剥夺以促进标记，以及与S-酰化修饰的酰基-生物素交换（ABE）检测方法相比，其适用的细胞类型范围相对较窄16。尽管存在这些局限性，点击化学检测法仍比大多数酰基交换检测方法更快速，并且更适合用于检测那些无法耐受酰基交换检测中反复蛋白质沉淀步骤的蛋白质。此外，该方法还可与其他点击化学检测技术（如脉冲-追踪分析38）联合使用，实现同步标记。

利用该修饰方法进行点击化学的代谢标记，可结合多种蛋白质组学技术，总体上提高酰化蛋白（尤其是S-酰化蛋白）的检测灵敏度。如图所示，荧光检测可作为生物素标记的替代方法（图1）28。这种方法特别有利，因为细胞裂解液中不存在内源性荧光蛋白。此外，还可使用仅在点击化学反应后才被激活的荧光探针46。通过皂化处理并将脂肪酸结合到FAFBSA上，再用于点击化学标记，不仅可通过增加细胞内可用标记物的总量来改善目标蛋白的检测困难，还能避免将脂肪酸直接添加至培养基所带来的细胞毒性效应。该方法还可与质谱技术联用27，以增强低丰度蛋白的检测能力，尤其当结合最新的机器学习算法进展时，可避免重复测量，从而提高对低丰度蛋白的检测灵敏度，这与传统的数据依赖性采集模式（倾向于检测高丰度蛋白）形成对比47。此外，点击化学还可与细胞培养中稳定同位素标记氨基酸（SILAC）及脉冲-追踪实验方法相结合，实现对蛋白质S-酰化动态变化的定量分析27。最后，Hannoush研究组已将点击化学与邻近连接实验（PLA）相结合，实现了单细胞水平下棕榈酰化蛋白的可视化及其亚细胞分布的检测43,48。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC；项目号 RGPIN-2019-04617）资助。Lucia Liao 获得了滑铁卢大学生物系颁发的 Ram 和 Lekha Tumkur 纪念奖学金，以及安大略省 IODE 颁发的 Lucy Morrison 纪念助学金，同时还获得了滑铁卢大学研究生研究基金的资助，包括研究生研究奖学金（50503-11072）、科学研究生奖和研究生助教职位。作者谨向 Martin 实验室的所有成员致以感谢，感谢他们在准备本手稿过程中提供的支持，特别感谢 Stephanie Ryall、Harleen Gill 和 Sadia Khan，她们在早期协助建立了 Martin 实验室，为本研究的开展做好了准备。作者还感谢 Luc Berthiaume 博士慷慨提供 ctHTT-GFP 载体，以及 Shaun Sanders 博士在手稿撰写过程中提供的宝贵意见。 图3 使用 BioRender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
13-十四碳炔酸（炔基肉豆蔻酸）(25 mM)Click Chemistry Tools1164
15-十六碳炔酸（炔基棕榈酸）(100 mM)Click Chemistry Tools1165
17-十八碳炔酸（炔基硬脂酸）(100 mM)Cayman Chemical Company90270
30% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 29:1Biorad1610156
96孔板读板仪BioradN/A
AFDye 647 叠氮化物 PlusClick Chemistry Tools1482
过硫酸铵（APS）Biorad1610700
抗GAPDH hFAB 罗丹明抗体Biorad12004167
抗兔 Alexa 488 抗体InvitrogenA11034
抗微管蛋白 hFAB 罗丹明抗体Biorad12004166
生物素叠氮化物Click Chemistry Tools1265
双-Tris，超纯VWR715
氯化钙J.T. Baker1332-1
离心机 16,000×g，4°CThermo ScientificN/A
活性炭处理胎牛血清（DCC-FBS）One ShotLife TechnologiesA3382101
ChemiDoc 成像仪BioradN/A
硫酸铜（1 mM）VWRBDH9312
脱氧胆酸钠一水合物MP Biomedicals102906
兼容去垢剂的（DC）检测试剂盒BioradN/A
二甲基亚砜（DMSO）VWR0231-500 mL
DMEM，1×Wisent Inc319015CL
无水乙醇N/AN/A
脂肪酸游离型BSAMP Biomedicals219989950
Fast Blot Turbo 半干转印系统BioradN/A
胎牛血清（FBS）Thermo Fisher Scientific12483-020
FluoroTrans W PVDF（聚偏二氟乙烯）转印膜Pall Life SciencesBSP0161
HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸）VWR5011
37°C、5% CO2 的加湿培养箱VWRN/A
Igepal CA-630Alfa AesarJ61055
Image Lab 软件BioradN/A
L-谷氨酰胺补充液Wisent Inc609-065-EL
氯化镁Fisher ScientificBP214-500
甲醇VWRBDH1135
肉豆蔻酸（25 mM）VWRM0476-25G
棕榈酸（100 mM）VWRP0002-25G
青霉素-链霉素，10×Wisent Inc450201EL
抑肽酶A（合成）Enzo Life SciencesALX-260-085-M005
苯甲基磺酰氟（PMSF）Enzo Life SciencesALX-270-184-G005
磷酸盐缓冲液，10×，pH 7.4VWR75801-000
多克隆山羊抗GFP抗体（亲和纯化）EuseraEU4
FluoroTrans W PVDF（聚偏二氟乙烯）转印膜Pall Life SciencesBSP0161
氢氧化钾Ward's Science470302-100
兔多克隆抗GFP抗体EuseraEU1
氯化钠VWR0241-1KG
十二烷基硫酸钠（SDS）Fisher ScientificBP166-500
丙酮酸钠Wisent Inc600-110-EL
链霉亲和素Alexa Fluor 680偶联物Thermo Fisher ScientificS21378
三（苄基三唑基甲基）胺（TBTA）(100 µM)Click Chemistry Tools1061
三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）(1 mM)Soltec VenturesM115
Tris碱Fisher ScientificBP152-5
胰蛋白酶/EDTAWisent Inc325-043-CL
Tween 20 试剂级 1LVWR97062-332
WHEATON NextGen V 小瓶 3 mLVWR89085-424

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