本方案详细描述了病毒感染的鼻上皮细胞与天然免疫细胞活化之间早期相互作用的研究方法。可根据免疫细胞亚群在病毒感染后的活化状态对其进行区分，并进一步研究其对早期抗病毒反应的影响。
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方法文章
无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
病毒性感染期间，鼻腔上皮层与先天免疫细胞之间的早期相互作用仍是一个研究不足的领域。随着研究的深入，先天免疫信号在病毒感染中的重要性显著增加，表现出高水平先天T细胞活化的呼吸道感染患者通常具有更好的疾病预后。因此，解析这些早期的先天免疫相互作用，有助于阐明其背后的调控机制，并可能促进开发潜在的治疗靶点和策略，以抑制甚至阻止病毒感染的早期进展。本实验方案详细描述了一种多功能模型，可用于研究病毒感染的气道上皮细胞所分泌因子对先天免疫细胞的早期串扰、相互作用及活化过程。以H3N2流感病毒（A/Aichi/2/1968）作为代表性病毒模型，通过流式细胞术分析共培养的外周血单个核细胞（PBMCs）的先天免疫细胞活化情况，以探究上皮细胞在病毒感染后释放的可溶性因子所激活的细胞亚群。结果展示了用于区分不同细胞亚群的设门策略，并揭示了活化PBMC亚群在与对照组和感染组上皮细胞相互作用时的明显差异。随后可进一步分析这些活化的细胞亚群，以确定其功能以及细胞特异性的分子变化。此类串扰研究的发现可能揭示对关键先天免疫细胞群活化至关重要的因子，这些因子在控制和抑制病毒感染进展方面具有积极作用。此外，这些因子可广泛应用于不同的病毒性疾病，尤其是新发病毒，在病毒初次在易感人群中传播时减轻其影响。
引言
呼吸道病毒可能是造成严重医疗负担和经济影响的最广泛病原体之一。从周期性暴发的新型流行毒株（例如 H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19）到每年季节性流感毒株，病毒始终对公共卫生构成持续威胁。尽管疫苗构成了应对这些全球公共卫生挑战的主要手段，但值得警惕的是，这些防控措施本质上仅属于被动应对1,2。此外，新型传染性毒株出现与成功研发相应疫苗之间不可避免地存在时间延迟3，导致在这一期间内可用于遏制病毒传播的措施极为有限。
这些延迟还会在经济和社会层面给社会带来进一步的代价。仅季节性流感每年就在美国造成约80亿美元的间接成本、32亿美元的医疗成本以及3.63万例死亡4。这尚未包括为资助疫苗研发所需投入的研究经费。每年全球化进程不断加快，加剧了流行病暴发对社会更为严重的影响，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现及其迅速传播所引发的全球性动荡便是例证5,6,7。
近期研究表明，活化先天性T细胞数量较....
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方案
注意：本方案中所用培养基的配方请参见表1。
注意：在12孔Transwell上培养的人鼻上皮细胞（hNECs）形成的细胞层厚度更佳，有利于可溶性因子在流感病毒感染时快速到达基底室。因此建议在共培养实验中使用12孔规格的Transwell。
1. 3T3 饲养层的建立
- 从冻存菌种建立培养
- 从冻存菌种中取出一管 NIH/3T3 成纤维细胞，迅速融化。将冻存管中的内容物加入 2 mL 完全杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）中，并重悬细胞。
- 在室温常压（rtp）下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用完全 DMEM 重悬细胞。
- 使用台盼蓝染色法计数细胞。取 10 µL 重悬的细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，充分混匀后取 10 µL 混合液加入血细胞计数板进行细胞计数。
- 以 1 × 104 个细胞/cm2 的密度将细胞接种至合适的培养皿中（例如 T75 培养瓶）。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的环境中培养 3 天。
- 丝裂霉素 C 处理
- 培养 3 天后，确保细胞融合度为 60%–80%，吸除培养基，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞....
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结果
尽管传统T细胞构成了适应性免疫应答抗病毒感染以促进病毒清除的主要细胞库，但先天性T细胞群体则在更广泛的范围内发挥作用，可在后期有效抑制病毒载量并促进清除。因此，本方案专门建立了稳定的研究条件，用于研究流感病毒感染后先天性T细胞的激活及其功能细胞群，而无需来自同一供体的上皮细胞和免疫细胞样本。该方案也可应用于其他病毒，但可能仅限于具有顶端释放特性的病毒，即病毒不应进入基底层与外周血单个核细胞（PBMC）室接触。
根据图1中的代表性结果，本方案有助于从原代细胞悬液出发，在3T3饲养层上获得人神经上皮干细胞（hNESPC）群体。图1展示了hNESPC在3T3饲养层上生长过程中的典型进展示例。这些细胞可用于气液界面（ALI）培养体系中的分化，以获得具有功能性纤毛细胞和杯状细胞的多层人鼻上皮细胞（hNEC）（
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讨论
针对病毒的先天免疫反应在抗病毒管理中是一个研究尚不充分的领域。气道上皮细胞与先天免疫细胞协同作用，不仅在感染期间抑制病毒复制，还在病毒载量未得到有效控制时，成为适应性免疫反应过度激活的关键决定因素12,13,17然而，目前仍缺乏可用于研究上皮细胞与先天免疫系统相互作用、并阐明先天免疫细胞活化以产生适当抗病毒反应的相关人类模型，这仍是一个挑战。因此，这种气液界面共培养模型是一种多功能技术，可用于评估鼻上皮层与免疫细胞之间的多种相互作用。该模型结合了体外分化的原代人鼻上皮细胞（hNECs）、通过流式细胞术分析外周血单个核细胞（PBMC）的活化状态以及病毒感染实验，其中许多关键步骤均已明确界定，以确保本实验方案的成功实施。此外，也可对涉及的气道部分进行进一步改造，以适用于体外研究-来自上呼吸道和下呼吸道的分化细胞均可使用，为该方案增添了进一步的灵活性。
然而，在研究病毒感染中上皮细胞与.......
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披露
所有作者均声明无利益冲突。
致谢
我们感谢新加坡国立大学耳鼻喉科系和微生物学与免疫学系的研究人员在原代人鼻上皮细胞培养及病毒培养相关工作中的帮助。我们还要感谢新加坡国家大学医院耳鼻喉科的外科医生及手术团队，他们在提供本研究所需的细胞和血液样本方面给予了协助。
本研究由新加坡国家医学研究理事会资助，项目编号为 NMRC/CIRG/1458/2016（负责人：De Yun Wang）和 MOH-OFYIRG19may-0007（负责人：Kai Sen Tan）。Kai Sen Tan 获得了欧洲过敏与临床免疫学会（EAACI）2019 年研究奖学金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0，无RNase | Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 mL SafeLock 管 | Eppendorf | 0030120086 | 1.5mL 离心管 |
| 10 mL K3EDTA 真空采血管 | BD | 366643 | 10mL 血液采集管 |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12孔板 | Corning | 3513 | |
| 12孔Transwell插件 | Corning | 3460 | 膜插件 |
| 1x FACS裂解液 | BD | 349202 | |
| 2.0 mL SafeLock 管 | Eppendorf | 0030120094 | 2 mL 离心管 |
| 24孔板 | Corning | 3524 | |
| 24孔Transwell插件 | Corning | 3470 | |
| 含亚甲蓝的3%乙酸 | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸 | Sigma | T-074 | |
| 含15%甲醇作为稳定剂的37%甲醛溶液（H2O） | Sigma | 533998 | |
| 5810R 离心机 | Eppendorf | 5811000320 | |
| 5 mL 聚丙烯管（流式管） | BD | 352058 | |
| 70 µm 细胞筛 | Corning | 431751 | |
| A-4-62 转子 | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | 细胞解离试剂 |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | 液体覆盖层 |
| Bio-Plex Manager 6.2 标准软件 | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | 多重分析管理软件 |
| 蝶形针 21 G | BD | 367287 | |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | |
| 结晶紫 | Merck | C6158 | |
| Cytofix/Cytoperm 溶液 | BD | 554722 | 固定和通透溶液 |
| Dispase II | Sigma | D4693 | 中性蛋白酶 |
| DMEM/高葡萄糖 | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | |
| DMEM/F-12营养混合物 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP 混合液 | Promega | U1515 | dNTP 混合液 |
| EMEM（含L-谷氨酰胺） | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM 跨膜电阻测量仪 | WPI, Sarasota, FL, USA | 300523 | |
| FACS 裂解液 | BD | 349202 | 1x 裂解液 |
| Falcon 15 mL 管 | CellStar | 188271 | 15 mL 管 |
| Falcon 50 mL 管 | CellStar | 227261 | 50 mL 管 |
| Fast Start Essential DNA Probes Master | Roche | 6402682001 | qPCR 主混合液 |
| Ficoll Paque Premium | Research Instruments | 17544203 | 密度梯度介质 |
| H3N2（A/Aichi/2/1968） | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 正向引物序列 | Sigma | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3' | |
| H3N2 M1 反向引物序列 | Sigma | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3' | |
| H3N2 NS1 正向引物序列 | Sigma | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3' | |
| H3N2 NS1 反向引物序列 | Sigma | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3' | |
| 热灭活胎牛血清 | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | 人类供体 | NA | |
| 人表皮生长因子 | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| 氢化可的松 | STEMCELL Technologies | 7925 | 从鼻甲偏曲手术期间采集的鼻活检组织中获得 |
| 胰岛素 | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR 仪器 |
| Live/DEAD Blue 细胞染色试剂盒 *适用于紫外激发 | Thermofisher | L23105 | 活力染色剂 |
| MILLIPLEX MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠面板 II - 预混23重检测 | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | 免疫学多重检测 |
| 丝裂霉素C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x 缓冲液 | Promega | M1705 | RT-PCR 5x 缓冲液 |
| M-MLV 逆转录酶 | Promega | M1706 | 逆转录酶 |
| N-2 补充剂 | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| Perm/Wash 缓冲液 | BD | 554723 | 通透洗涤缓冲液 |
| PneumaCult-ALI 10x 补充剂 | STEMCELL Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI 基础培养基 | STEMCELL Technologies | 5001 | |
| PneumaCult-ALI 维持补充剂（100x） | STEMCELL Technologies | 5001 | |
| 随机引物 | Promega | C1181 | 随机引物 |
| 重组Rnasin RNase抑制剂 | Promega | N2511 | RNase抑制剂 |
| RNA裂解缓冲液 | Qiagen | Part of 52904 | |
| RPMI 1640（含L-谷氨酰胺） | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 电极 | WPI, Sarasota, FL, USA | STX2 | 电极 |
| T25 培养瓶 | Corning | 430639 | |
| T75 培养瓶 | Corning | 430641U | |
| TPCK 胰蛋白酶 | Sigma | T1426 | |
| 台盼蓝 | Hyclone | SV30084.01 | |
| 病毒RNA提取试剂盒 | Qiagen | 52904 | 病毒RNA提取试剂盒 |
| V型96孔板 | Corning | 3894 |
参考文献
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
- Gerdil, C.
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