需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化

2.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62115

⸱

2021年2月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了病毒感染的鼻上皮细胞与天然免疫细胞活化之间早期相互作用的研究方法。可根据免疫细胞亚群在病毒感染后的活化状态对其进行区分，并进一步研究其对早期抗病毒反应的影响。

摘要

病毒性感染期间，鼻腔上皮层与先天免疫细胞之间的早期相互作用仍是一个研究不足的领域。随着研究的深入，先天免疫信号在病毒感染中的重要性显著增加，表现出高水平先天T细胞活化的呼吸道感染患者通常具有更好的疾病预后。因此，解析这些早期的先天免疫相互作用，有助于阐明其背后的调控机制，并可能促进开发潜在的治疗靶点和策略，以抑制甚至阻止病毒感染的早期进展。本实验方案详细描述了一种多功能模型，可用于研究病毒感染的气道上皮细胞所分泌因子对先天免疫细胞的早期串扰、相互作用及活化过程。以H3N2流感病毒（A/Aichi/2/1968）作为代表性病毒模型，通过流式细胞术分析共培养的外周血单个核细胞（PBMCs）的先天免疫细胞活化情况，以探究上皮细胞在病毒感染后释放的可溶性因子所激活的细胞亚群。结果展示了用于区分不同细胞亚群的设门策略，并揭示了活化PBMC亚群在与对照组和感染组上皮细胞相互作用时的明显差异。随后可进一步分析这些活化的细胞亚群，以确定其功能以及细胞特异性的分子变化。此类串扰研究的发现可能揭示对关键先天免疫细胞群活化至关重要的因子，这些因子在控制和抑制病毒感染进展方面具有积极作用。此外，这些因子可广泛应用于不同的病毒性疾病，尤其是新发病毒，在病毒初次在易感人群中传播时减轻其影响。

引言

呼吸道病毒可能是造成严重医疗负担和经济影响的最广泛病原体之一。从周期性暴发的新型流行毒株（例如 H1N1、H5N1、H3N2、MERS、COVID-19）到每年季节性流感毒株，病毒始终对公共卫生构成持续威胁。尽管疫苗构成了应对这些全球公共卫生挑战的主要手段，但值得警惕的是，这些防控措施本质上仅属于被动应对1,2。此外，新型传染性毒株出现与成功研发相应疫苗之间不可避免地存在时间延迟3，导致在这一期间内可用于遏制病毒传播的措施极为有限。

这些延迟还会在经济和社会层面给社会带来进一步的代价。仅季节性流感每年就在美国造成约80亿美元的间接成本、32亿美元的医疗成本以及3.63万例死亡4。这尚未包括为资助疫苗研发所需投入的研究经费。每年全球化进程不断加快，加剧了流行病暴发对社会更为严重的影响，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的出现及其迅速传播所引发的全球性动荡便是例证5,6,7。

近期研究表明，活化先天性T细胞数量较多的感染患者通常具有更好的疾病预后8,9,10。此外，先天性T细胞群体可分为多个亚群：黏膜相关不变T（MAIT）细胞、Vδ1 γδ T细胞、Vδ2 γδ T细胞以及自然杀伤T（NKT）细胞。这些先天性T细胞亚群在其群体内部也表现出异质性，增加了参与先天免疫应答的细胞群体之间相互作用的复杂性11。因此，揭示激活这些先天性T细胞的机制以及明确先天性T细胞的具体亚群，可能为研究抑制这些病毒对人类宿主感染效应提供新的方向，尤其是在疫苗研发期间。

流感病毒感染的上皮细胞会产生能够快速激活固有T细胞的因子12,13,14。基于这一发现，本研究建立了一种无接触的气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）共培养模型，旨在模拟感染早期鼻腔上皮层与外周血单个核细胞（PBMCs）之间由感染上皮层释放的可溶性因子介导的早期化学相互作用。由于鼻腔上皮层（培养于膜插件上）与PBMCs（位于下方腔室中）之间存在物理分隔，且上皮层保持完整，因此可防止病毒对PBMCs的直接感染，从而能够深入研究上皮来源的可溶性因子对PBMCs的影响。由此鉴定出的因子可进一步探索其在诱导适当固有T细胞亚群方面的治疗潜力，以期预防流感病毒感染。因此，本文详细描述了利用共培养体系研究上皮来源可溶性因子激活固有T细胞的方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：本方案中所用培养基的配方请参见表1。
注意：在12孔Transwell上培养的人鼻上皮细胞（hNECs）形成的细胞层厚度更佳，有利于可溶性因子在流感病毒感染时快速到达基底室。因此建议在共培养实验中使用12孔规格的Transwell。 

1. 3T3 饲养层的建立

  1. 从冻存菌种建立培养
    1. 从冻存菌种中取出一管 NIH/3T3 成纤维细胞，迅速融化。将冻存管中的内容物加入 2 mL 完全杜尔贝科最低必需培养基（DMEM）中，并重悬细胞。
    2. 在室温常压（rtp）下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。用完全 DMEM 重悬细胞。
    3. 使用台盼蓝染色法计数细胞。取 10 µL 重悬的细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，充分混匀后取 10 µL 混合液加入血细胞计数板进行细胞计数。
    4. 以 1 × 104 个细胞/cm2 的密度将细胞接种至合适的培养皿中（例如 T75 培养瓶）。将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 的环境中培养 3 天。
  2. 丝裂霉素 C 处理
    1. 培养 3 天后，确保细胞融合度为 60%–80%，吸除培养基，并用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。
      ​注意：3T3 饲养层细胞不应达到完全融合状态，否则丝裂霉素 C 处理将无效。
    2. 向培养瓶中加入含丝裂霉素 C 的完全 DMEM，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 3.5 小时。移除含丝裂霉素 C 的培养基，并用 1× PBS 洗涤细胞两次。
  3. 在 6 孔板中接种 3T3 细胞
    1. 向培养瓶中加入 3 mL 1× 胰蛋白酶-EDTA，消化 3–5 分钟以使细胞脱落。将消化后的细胞收集至新的 15 mL 离心管中。在室温常压（rtp）下以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，用完全 DMEM 重悬细胞。
    2. 使用台盼蓝染色法计数细胞。以每孔 7.5 × 105–2.5 × 106 个细胞的密度将细胞接种至 6 孔板中。将 6 孔板置于 37 °C、5% CO2 的环境中过夜培养。
      ​注意：若 3T3 饲养层细胞状态良好，则视为已准备就绪。此时可将人鼻上皮干细胞/祖细胞（hNESPCs）接种至该饲养层上进行扩增培养。
    3. 向培养瓶中加入完全 DMEM，于 37 °C、5% CO2 条件下过夜培养，使 3T3 细胞从丝裂霉素 C 处理中恢复。

2. 人鼻上皮细胞（hNEC）培养的建立

注意：临床样本应取自无上呼吸道感染症状的患者。

  1. 将鼻腔组织处理成单细胞悬液
    1. 用含有100 µL/mL抗生素-抗真菌素混合物的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（dPBS）（不含Mg2+和Ca2+）清洗鼻腔组织。将组织切成小片段，并在4 °C下以10 mg/mL中性蛋白酶振荡处理过夜。
    2. 以200 × g离心5分钟，离心后弃去上清液。将沉淀物在1–2 mL的1×胰蛋白酶-EDTA中于37 °C孵育15分钟，然后加入相当于管中液体体积10%的胎牛血清以终止反应。
    3. 通过移液将消化后的组织机械解离为单细胞聚集体，随后将所得悬液通过70 µm细胞筛网过滤。将细胞重悬于完全DMEM培养基中。
      ​注意：此步骤之后，细胞悬液为终末分化细胞与干细胞的混合物，后者被称为人鼻上皮干细胞/祖细胞（hNESPCs）。后续步骤的目标是从多种细胞群体的混合物中筛选并富集hNESPC群体。
  2. 将单细胞悬液接种至3T3饲养层以筛选hNESPCs
    1. 将第2.1.3步所得细胞悬液离心（300 × g，5分钟，室温），弃去上清液。将细胞重悬于3–5 mL的培养基3中。
      ​注意：培养基3的配方旨在促进hNESPCs的选择性生长。
    2. 通过台盼蓝染色法计数细胞。每孔加入2 mL培养基3，将1 × 106个细胞接种至已准备好的含3T3饲养层的6孔板中（接种前需移除原培养基）。将共培养体系置于37 °C、5% CO2环境中孵育。
      ​注意：接种后请避免震荡培养板，以免影响hNESPCs的贴壁。
    3. 每2–4天更换一次培养基3（2 mL），完全移除旧培养基并替换为新鲜培养基3。
      ​注意：更换培养基是为了补充营养物质，并防止过酸环境对hNESPCs生长产生不利影响。每次换液的间隔取决于培养基酸化（变黄）的速度。若培养基迅速变酸，则应缩短换液间隔。
    4. 7–10天后，观察发现hNESPCs已达到适合转移至膜插件的汇合度。参见图1，了解hNESPCs在三个不同时间点（2天、5天和10天）的代表性形态。
  3. 将hNESPCs转移至膜插件
    ​注意：由于经过丝裂霉素C处理，3T3饲养层将在hNESPC扩增期间逐渐降解。这将导致其与孔板表面的黏附力减弱，可通过移液冲洗使其脱落，仅留下健康的hNESPCs。
    1. 移除培养基，向每孔加入500 µL的1× dPBS。用微量移液器冲洗细胞3次以去除3T3细胞，随后弃去1× dPBS。在显微镜下观察，圆形的hNESPCs仍保留，而梭形的3T3饲养层细胞则被冲走。
    2. 每孔加入500 µL细胞解离试剂，于37 °C、5% CO2环境中孵育5–10分钟，或直至hNESPCs从孔板表面脱落。
    3. 收集hNESPC悬液，离心（300 × g，5分钟，室温），弃去上清液。
    4. 将沉淀重悬于培养基3中。通过台盼蓝染色法计数细胞。每张膜插件（24孔板）接种3 × 104个细胞于150 µL培养基3中，或每张膜插件（12孔板）接种1 × 105个细胞于300 µL培养基3中（图2）。将细胞置于37 °C、5% CO2环境中孵育。
    5. 每2天更换一次顶端和基底腔室的培养基（培养基3）。将移液器尖端穿过膜插件的支撑臂之间，进入基底腔室，移除旧培养基，再以相同方式重新加入新鲜培养基。虽然顶端腔室易于接近，但操作时需注意不要扰动正在生长的hNESPC层。
      ​注意：接种后至少2天内不要扰动顶端腔室中的培养基，因为细胞需要时间贴附于膜上。
  4. 将hNESPCs分化为hNECs
    1. 当hNESPCs达到100%汇合度（约在接种至膜插件后3–7天），开始气液界面（ALI）培养。将基底侧培养基更换为分化培养基，并移除顶端腔室中的培养基。此后每2–3天换液时，仅向基底腔室添加培养基，不再向顶端腔室加液，如图3及步骤2.3.5所示。
      注意：更换为分化培养基是为了促进hNESPCs在气液界面条件下向hNECs分化。hNESPCs大约需要3–4周才能完全成熟为hNECs，此时细胞已形成多层结构，各层包含不同类型的细胞。在400倍放大下应可观察到纤毛（可通过其摆动运动识别，表现为显微镜视野出现振动现象）。此时细胞已准备好用于共培养实验。参见图4了解完全分化后hNEC层的横截面结构。
    2. 获得成熟hNECs后，在共培养实验前一周内，每隔2–3天用1× dPBS对顶端腔室中的细胞进行3次清洗。将清洗步骤与基底侧培养基更换同步进行，具体操作如下：
      1. 向膜插件的顶端腔室中加入50 µL（24孔板）或150 µL（12孔板）的1× dPBS，于37 °C孵育10分钟。孵育10分钟后移除dPBS，以清除分化过程中积累的黏液和死亡细胞。
        ​注意：根据实验性质，可使用碳酸氢钠溶液彻底清除黏液层。然而，在共培养实验中进行病毒感染时，应保留黏液层，仅通过dPBS清洗去除多余黏液。此操作旨在模拟存在于鼻上皮上的生理黏液层，该黏液层将与入侵的病毒感染发生相互作用。

3. 跨上皮电阻（TEER）测量

注意：确认上皮完整性对于确保获得完整且健康的上皮层至关重要。通过使用伏特-欧姆计对4个随机孔进行跨上皮电阻（TEER）测量，以确定上皮层是否完整。

  1. 使用70%乙醇冲洗电极，并在使用前用紫外线照射15分钟以确保无菌。灭菌后用1× dPBS冲洗。
  2. 向膜插件的顶室中加入100 µL（24孔板）或300 µL（12孔板）的1× dPBS。将培养板在37 °C孵育10分钟，然后移除dPBS。
  3. 对于每个待测孔，准备一个未使用的孔，其中加入1 mL（24孔板）或3 mL（12孔板）预热至37 °C的分化培养基。将膜插件放入准备好的孔中，并向顶室加入200 µL（24孔板）或600 µL（12孔板）预热的分化培养基。在37 °C下平衡15分钟（根据所加病毒类型的孵育温度调整，例如流感病毒为35 °C）。
    注意：请以相同方式准备一个空白对照（空膜插件），用于计算TEER。
  4. 同时将一支含预热分化培养基的15 mL离心管也在相同温度下平衡15分钟。将电极置于该15 mL离心管中，并打开伏欧计。
    注意：此时读数应为0电阻，因为电极处于同一培养基中。若读数不为0，则继续在15 mL离心管中平衡电极，直至读数为0。
  5. 从空白对照开始，将电极置于每个孔中，使一个电极浸入顶室培养基，另一个电极浸入基底室培养基。仅当读数在至少5分钟内保持稳定时，记录该数值。
  6. 每次测量后，用PBS清洗电极再进行下一次测量。对每个测试孔，在膜的不同位置进行三次样本测量。为计算每个样本的净TEER值，需从每次测量值中减去空白膜插件提供的背景电阻。
  7. 使用以下公式计算每个孔的总TEER值：
    上皮完整性（Ωcm2）= 净TEER（欧姆） × 膜面积（cm2）
    注意：用于病毒感染实验的人鼻上皮细胞（hNECs）的TEER值应>1000 Ωcm2 13,15,16。

4. 外周血单核细胞和NK细胞的分离

注意：血液样本应取自健康志愿者，并在分离当天使用。

  1. 使用10 mL采血管，从每位供体采集30–40 mL全血。
  2. 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），并按以下步骤从血沉棕黄层（buffy coat）中获取PBMCs（另见材料表）。
    1. 在稀释前，先将采血管中的约10 mL血液在真空采血管中充分混匀，然后加入等体积的平衡盐溶液（PBS）进行稀释。
    2. 向50 mL离心管底部加入15 mL密度梯度介质。
      ​注意：密度梯度介质与稀释后血液的体积比应为2:3–3.5。
    3. 将35 mL稀释后的血液用移液枪（设定为最低排液速度）沿45°倾斜的离心管内壁缓慢滴加至密度梯度介质上方，使血液沿管壁流下，避免扰动下方的密度梯度介质层。
    4. 以500 × g、18–20 °C离心30分钟（刹车：关闭）。小心移除并弃去上层血浆层，避免扰动下层。
    5. 将血沉棕黄层转移至新的离心管中，注意不要混入红细胞层、密度梯度介质层或血沉棕黄层。当血沉棕黄层被收集至新的50 mL离心管后，用1× PBS补足体积至50 mL。
    6. 以800 × g、18–20 °C离心8分钟（刹车：关闭），用移液枪吸除上清液。用50 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，再以120 × g、18–20 °C离心10分钟以去除血小板。
    7. 用移液枪吸弃上清液，避免扰动细胞沉淀。
      ​注意：由于细胞沉淀可能较松散，不建议通过倾倒方式弃去上清液。
    8. 用完全RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基重悬细胞沉淀。取10 µL重悬的细胞悬液与10 µL含亚甲蓝的3%乙酸溶液混合，充分混匀后取10 µL混合液加入血细胞计数板进行细胞计数。
  3. 用完全RPMI培养基将PBMCs稀释至浓度为2 × 106/mL（适用于24孔板）或4 × 106/mL（适用于12孔板）。

5. hNEC 病毒感染及向 hNEC:PBMC 共培养体系的转化

注意：本方案中以 H3N2（A/Aichi/2/1968）作为感染的代表性毒株，感染复数（MOI）的代表性数值为 0.1。

  1. 第0天（hNECs感染）
    注意：使用来自同一供体的hNECs培养物中的一个孔，作为实验中每个孔的代表性细胞计数依据。
    1. 在代表性孔中，向膜插件的顶端室加入150 µL 1×胰蛋白酶-EDTA，向基底室加入350 µL 1×胰蛋白酶-EDTA，37 °C孵育10分钟，或直至细胞从膜上脱落。
    2. 通过移液上下吹打使膜上的细胞脱落，并将悬液收集至1.5 mL离心管中。加入200 µL完全DMEM以终止胰蛋白酶活性。通过台盼蓝染色计数，获得每孔的细胞数量。
    3. 根据每孔细胞数量计算病毒所需的感染复数（MOI），并在冰上用完全RPMI培养基相应稀释病毒储备液。
      注意：每孔1.26 × 106个hNECs时MOI为0.1 = 每孔30 µL（24孔板）或100 µL（12孔板）中含有1.26 × 105个H3N2病毒颗粒
    4. 对于用于感染实验的其余孔，在膜插件的顶端室中加入50 µL（24孔板）或150 µL（12孔板）1×dPBS，37 °C孵育10分钟，随后移除1×dPBS。
    5. 通过将膜插件转移至已加入完全RPMI培养基的新培养板中（每孔350 µL（24孔板）或700 µL（12孔板）），更换膜插件的基底培养基为完全RPMI培养基。
      注意：当hNESPCs完全分化为hNECs后，它们对不同培养基具有耐受性/允许性，最长可达72小时；更换为RPMI培养基后，细胞形态与结构无明显变化12。RPMI用于支持PBMC群体的生长与维持。
    6. 将制备好的病毒接种物30 µL（24孔板）或100 µL（12孔板）加入膜插件的顶端室中，在35 °C、5% CO2环境中孵育1小时，随后移除顶端室中的病毒接种物。
    7. 将膜插件的基底培养基更换为新鲜的完全RPMI培养基，在35 °C、5% CO2环境中继续孵育24小时。
  2. 第1天（建立hNECs + PBMCs共培养体系）
    1. 将所需数量的PBMCs悬浮于150 µL（24孔板）或300 µL（12孔板）完全RPMI培养基中，直接加入第0天未感染或已感染的hNECs各孔的基底室中（24孔板每孔1.5 × 106个，12孔板每孔3 × 106个）。37 °C孵育24/48小时。
      注意：共培养体系建立后，基底室的最终体积为500 µL（24孔板）或1000 µL（12孔板）。
  3. 第2–3天（病毒感染后48/72小时收集PBMCs）
    1. 顶端上清液的收集（病毒感染后48/72小时）
      1. 向每个顶端室加入50 µL（24孔板）或150 µL（12孔板）1×dPBS，37 °C孵育10分钟。将1×dPBS收集至1.5 mL离心管中。取25 µL（24孔板）或50 µL（12孔板）上清液分装至新的1.5 mL离心管中用于蚀斑实验，立即将原液及分装样品在-80 °C保存。
    2. 从hNECs中收集细胞RNA（病毒感染后48/72小时）
      1. 将膜插件转移至洁净孔中，向顶端室加入300 µL（24孔板）或600 µL（12孔板）RNA裂解缓冲液，室温孵育5分钟。将裂解液收集至1.5 mL离心管中，-80 °C保存直至进行RNA提取与分子分析。
    3. PBMCs的收获（病毒感染后48/72小时）
      1. 使用无菌移液器吸头的宽端，轻轻刮擦孔壁表面，使可能黏附于孔壁的活化PBMCs脱落。将含有PBMCs的基底培养基收集至2 mL离心管中。
      2. 用300 µL 1×dPBS冲洗孔壁2次，将洗涤液一并收集至同一2 mL离心管中。将2 mL离心管以500 × g离心5分钟（室温），小心收集上清液至新的2 mL离心管中，避免扰动细胞沉淀。将上清液于-80 °C保存用于细胞因子与趋化因子分析；将细胞沉淀重悬于200 µL 1×dPBS中。

6. 流式细胞术

注意：本实验步骤直接接续上一部分，使用步骤 5.3.3.2 中获得的 PBMC 细胞悬液。在本节后续操作中应尽量避免光照。表面染色标记物的示例组合见表 2。

  1. 表面染色
    1. 将重悬的PBMC细胞沉淀转移至96孔V型底板中。离心裂解液 800 × g 3 分钟后，移除上清液。
    2. 孵育所有PBMC（除非常规指定的以外） "未染色"用100 µL活力染料在室温下染色15分钟。加入150 µL磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液补至200 µL。离心裂解液 800 × g 3 分钟后弃去上清液。
    3. 配制感兴趣的表面染色抗体组合，按适当稀释比例配制，每反应终体积为 50 µL（用 MACS 缓冲液补足至终体积）。使用多通道移液器将 50 µL 预先配制的抗体混合液加入细胞中，进行表面染色。4 °C 避光孵育 15 分钟。
    4. 加入 150 µL MACS 缓冲液洗涤。离心裂解液 800 × g 孵育3分钟，弃去上清液。如无需进行细胞内染色，可直接进入第6.3步的15分钟孵育。
  2. 细胞内染色（如需要）
    1. 每孔加入 100 µL 固定和透化溶液，4 °C 避光孵育 20 分钟。每孔补充 100 µL 1x MACS 缓冲液。
    2. 离心机（800 × g，3 分钟，25 °C），弃去上清液。加入 200 µL 1x 透化洗涤缓冲液，重复洗涤一次。离心（500 × g，3 分钟，25 °C），去除上清液。
    3. 使用1×破膜洗涤缓冲液将目标抗体组合稀释至终体积50 µL。置于冰上避光孵育30分钟。加入200 µL 1×破膜洗涤缓冲液。
    4. 离心细胞（800 × g，3 分钟，4 °C），弃去上清液。将细胞重悬于 100 µL 荧光激活细胞分选缓冲液中。
  3. 将200 µL裂解液加入每个孔中。在室温下孵育15分钟。将裂解物在800 × g 3 分钟后弃去上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于 200 µL MACS 缓冲液中。按照此前所述设置进行流式细胞术分析13，或避光保存于 4 °C。

7. 细胞因子和趋化因子水平的测定

  1. 根据制造商的方案18，使用免疫学多重检测法处理25 µL基础室上清液。
  2. 使用多重分析管理软件，通过标准曲线的五参数拟合算法计算每种分析物的浓度。

8. 病毒污染的评估

  1. 使用提取试剂盒对四组溶液进行病毒RNA提取：H3N2原液、用于感染的MOI 0.1稀释液、MOI 0.1的10倍系列稀释液，以及样品的基础培养基（分别来自病毒感染后48小时和72小时）12。
  2. 选择非结构基因（NS1）和基质蛋白基因（M1）作为聚合酶链式反应（PCR）的检测靶标（参见材料表中代表性实验所用的引物）。
  3. 进行逆转录PCR（RT-PCR）（42 °C，60分钟），将病毒RNA反转录为cDNA，随后进行定量PCR（qPCR），以检测NS1和M1的水平，作为病毒存在的间接指标，并将检测结果与对MOI 0.1样品的10倍系列稀释液进行RT-qPCR所获得的标准曲线进行比对。反应体系组成见表3，反应条件如下：95 °C预变性10分钟；随后进行40个循环的三步扩增：95 °C变性10秒，60 °C退火10秒，72 °C延伸30秒；熔解曲线分析条件：95 °C 10秒，65 °C 60秒，97 °C 1秒。

9. 空斑实验

  1. 第0天：在24孔板中接种MDCK（Madin Darby Canine Kidney）细胞
    1. 从长满单层的T75培养瓶中移除培养基，用1×PBS洗涤两次以彻底去除血清残留。加入10 mL胰蛋白酶，在37 °C、5% CO2条件下孵育20–30分钟，直至细胞脱落。
      ​注意：不要敲击培养瓶，以免导致细胞成团。
    2. 将细胞悬液转移至含有2 mL完全Eagle最小必需培养基（EMEM）的15 mL离心管中。离心（300 × g，5分钟，室温），弃去上清液。
    3. 用6 mL完全EMEM重悬细胞沉淀，通过台盼蓝染色法进行细胞计数。
    4. 将MDCK细胞悬液稀释至浓度为1 × 105 个细胞/mL，每孔接种1 mL稀释后的细胞悬液至无菌24孔板中。在37 °C、5% CO2条件下孵育24小时，使每个孔形成完全汇合的MDCK细胞单层。
  2. 第1天：MDCK细胞感染
    1. 准备感染用培养基。移除24孔板中MDCK单层细胞的培养基，用1×dPBS洗涤两次。第二次洗涤时，将PBS保留在孔中，同时在另一块24孔板中进行病毒的系列稀释。
    2. 将病毒样品置于冰上解冻，并在24孔板中用感染培养基进行系列稀释，获得从10-1到10-6的稀释梯度。
      ​示例：向24孔板的每个孔中加入270 µL感染培养基。
    3. 向每排第一个孔中加入30 µL病毒样品，使用新的移液枪头充分混匀后，取适量转移至下一孔进行10倍稀释。依次操作直至完成10-6稀释；对所有病毒样品重复步骤9.2.1–9.2.3。
    4. 移除MDCK孔板中的PBS，每孔加入100 µL已稀释的病毒液，每个稀释度设两个重复孔。对照孔中加入100 µL感染培养基（不含病毒）。在35 °C、5% CO2条件下孵育1小时，每隔15分钟轻轻摇动培养板以避免局部干燥。
    5. 移除病毒接种液，每孔加入1 mL液体覆盖层。在35 °C、5% CO2条件下继续孵育72小时。
  3. 第4天（感染后72小时）：空斑显色与观察
    1. 移除液体覆盖层，用含4%甲醛的1×PBS固定细胞1小时。弃去甲醛溶液，用1×PBS或蒸馏水洗涤一次。
    2. 加入1%结晶紫溶液染色15分钟。弃去染液，用流水冲洗细胞。在室温下将培养板干燥。
    3. 干燥后计数空斑，并根据以下公式计算病毒滴度：
      空斑数 × 稀释倍数 = 每100 μL中的空斑形成单位（PFU）数

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

尽管传统T细胞构成了适应性免疫应答抗病毒感染以促进病毒清除的主要细胞库，但先天性T细胞群体则在更广泛的范围内发挥作用，可在后期有效抑制病毒载量并促进清除。因此，本方案专门建立了稳定的研究条件，用于研究流感病毒感染后先天性T细胞的激活及其功能细胞群，而无需来自同一供体的上皮细胞和免疫细胞样本。该方案也可应用于其他病毒，但可能仅限于具有顶端释放特性的病毒，即病毒不应进入基底层与外周血单个核细胞（PBMC）室接触。

根据图1中的代表性结果，本方案有助于从原代细胞悬液出发，在3T3饲养层上获得人神经上皮干细胞（hNESPC）群体。图1展示了hNESPC在3T3饲养层上生长过程中的典型进展示例。这些细胞可用于气液界面（ALI）培养体系中的分化，以获得具有功能性纤毛细胞和杯状细胞的多层人鼻上皮细胞（hNEC）（

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

针对病毒的先天免疫反应在抗病毒管理中是一个研究尚不充分的领域。气道上皮细胞与先天免疫细胞协同作用，不仅在感染期间抑制病毒复制，还在病毒载量未得到有效控制时，成为适应性免疫反应过度激活的关键决定因素12,13,17然而，目前仍缺乏可用于研究上皮细胞与先天免疫系统相互作用、并阐明先天免疫细胞活化以产生适当抗病毒反应的相关人类模型，这仍是一个挑战。因此，这种气液界面共培养模型是一种多功能技术，可用于评估鼻上皮层与免疫细胞之间的多种相互作用。该模型结合了体外分化的原代人鼻上皮细胞（hNECs）、通过流式细胞术分析外周血单个核细胞（PBMC）的活化状态以及病毒感染实验，其中许多关键步骤均已明确界定，以确保本实验方案的成功实施。此外，也可对涉及的气道部分进行进一步改造，以适用于体外研究-来自上呼吸道和下呼吸道的分化细胞均可使用，为该方案增添了进一步的灵活性。

然而，在研究病毒感染中上皮细胞与...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

我们感谢新加坡国立大学耳鼻喉科系和微生物学与免疫学系的研究人员在原代人鼻上皮细胞培养及病毒培养相关工作中的帮助。我们还要感谢新加坡国家大学医院耳鼻喉科的外科医生及手术团队，他们在提供本研究所需的细胞和血液样本方面给予了协助。
本研究由新加坡国家医学研究理事会资助，项目编号为 NMRC/CIRG/1458/2016（负责人：De Yun Wang）和 MOH-OFYIRG19may-0007（负责人：Kai Sen Tan）。Kai Sen Tan 获得了欧洲过敏与临床免疫学会（EAACI）2019 年研究奖学金的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5% 胰蛋白酶-EDTAGibco15400-054
0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0，无RNaseThermofisherAM9260G0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock 管Eppendorf00301200861.5mL 离心管
10 mL K3EDTA 真空采血管BD36664310mL 血液采集管
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12孔板Corning 3513
12孔Transwell插件Corning 3460膜插件
1x FACS裂解液BD349202
2.0 mL SafeLock 管Eppendorf00301200942 mL 离心管
24孔板Corning 3524
24孔Transwell插件Corning 3470
含亚甲蓝的3%乙酸STEMCELL Technologies07060
3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸SigmaT-074
含15%甲醇作为稳定剂的37%甲醛溶液（H2O）Sigma533998
5810R 离心机Eppendorf5811000320
5 mL 聚丙烯管（流式管）BD352058
70 µm 细胞筛Corning 431751
A-4-62 转子Eppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501细胞解离试剂
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolymerNA液体覆盖层
Bio-Plex Manager 6.2 标准软件Bio-Rad Laboratories, Inc171STND01多重分析管理软件
蝶形针 21 GBD367287
霍乱毒素SigmaC8052
结晶紫 MerckC6158
Cytofix/Cytoperm 溶液BD554722固定和通透溶液
Dispase IISigmaD4693中性蛋白酶
DMEM/高葡萄糖GE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/F-12营养混合物Gibco-Invitrogen11320033
dNTP 混合液PromegaU1515dNTP 混合液
EMEM（含L-谷氨酰胺）ATCC30-2003
EVOM 跨膜电阻测量仪WPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS 裂解液BD3492021x 裂解液
Falcon 15 mL 管CellStar18827115 mL 管
Falcon 50 mL 管CellStar22726150 mL 管
Fast Start Essential DNA Probes MasterRoche6402682001qPCR 主混合液
Ficoll Paque PremiumResearch Instruments17544203密度梯度介质
H3N2（A/Aichi/2/1968） ATCCVR547
H3N2 M1 正向引物序列Sigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 反向引物序列Sigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 正向引物序列Sigma5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 反向引物序列Sigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
热灭活胎牛血清Gibco10500-064
hNESPCs人类供体NA
人表皮生长因子Gibco-InvitrogenPHG0314
氢化可的松STEMCELL Technologies7925从鼻甲偏曲手术期间采集的鼻活检组织中获得
胰岛素SigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR 仪器
Live/DEAD Blue 细胞染色试剂盒 *适用于紫外激发ThermofisherL23105活力染色剂
MILLIPLEX MAP 人细胞因子/趋化因子磁珠面板 II - 预混23重检测Merck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23免疫学多重检测
丝裂霉素CSigmaM4287
M-MLV 5x 缓冲液PromegaM1705RT-PCR 5x 缓冲液
M-MLV 逆转录酶PromegaM1706逆转录酶
N-2 补充剂Gibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perm/Wash 缓冲液BD554723通透洗涤缓冲液
PneumaCult-ALI 10x 补充剂STEMCELL Technologies5001
PneumaCult-ALI 基础培养基STEMCELL Technologies5001
PneumaCult-ALI 维持补充剂（100x）STEMCELL Technologies5001
随机引物PromegaC1181随机引物
重组Rnasin RNase抑制剂PromegaN2511RNase抑制剂
RNA裂解缓冲液QiagenPart of 52904
RPMI 1640（含L-谷氨酰胺）ATCC30-2001
STX2 电极WPI, Sarasota, FL, USASTX2电极
T25 培养瓶Corning430639
T75 培养瓶Corning430641U
TPCK 胰蛋白酶SigmaT1426
台盼蓝HycloneSV30084.01
病毒RNA提取试剂盒Qiagen52904病毒RNA提取试剂盒
V型96孔板Corning3894

参考文献

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

固有免疫激活鼻上皮细胞固有T细胞外周血单个核细胞流式细胞术流感病毒感染上皮免疫串扰细胞因子分析
无接触共培养模型用于研究呼吸道病毒感染期间的固有免疫细胞活化
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。