方法文章

通过线栓栓塞法建立大鼠上矢状窦闭塞模型

DOI：

10.3791/62118

⸱

2021年7月4日

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1Department of Clinical Laboratory, the Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, 2Rehabilitation Department, Wenzhou Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, 3Department of Neurosurgery, the Hospital of Changle, 4Pediatrics Ward 2, Shouguang Hospital of Traditional Chinese Medicine, 5Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 6National-Local Joint Engineering Research Center of Rehabilitation Medicine Technology, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 7Rehabilitation Industry Institute, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, 8Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本研究通过线栓栓塞法建立了一种新型的Sprague-Dawley（SD）大鼠上矢状窦（SSS）血栓形成模型，并验证了该模型的稳定性和可靠性。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

导致脑静脉窦血栓形成（CVST）自然发病的机制大多尚不明确，且该疾病的发生过程涉及多种不可控因素，这给临床研究带来了极大的局限性。因此，建立能够标准化多种不可控混杂因素的稳定CVST动物模型，有助于克服临床研究中的不足。近几十年来，已构建了多种CVST动物模型，但基于这些模型所得出的研究结果存在不一致和不完整的问题。因此，为了进一步深入探讨CVST的病理生理机制，有必要建立一种新型且高度可重复的动物模型，这对于CVST的诊断与治疗具有重要的实践价值和科学意义。在本研究中，采用导丝栓塞法成功建立了一种新型的Sprague-Dawley（SD）大鼠上矢状窦（SSS）血栓形成模型，并验证了该模型的稳定性和可靠性。此外，我们还评估了CVST形成后大鼠脑静脉血流的变化情况。综上所述，该SD大鼠SSS血栓模型是一种新型的CVST动物模型，具有建模简便、创伤小、稳定性好以及可精确控制缺血时间和部位等优点。

引言

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脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种罕见的脑静脉系统疾病，占所有卒中病因的0.5%-1.0%，但在儿童和青年人群中相对发病率较高1。尸检发现，CVST占脑血管疾病死亡原因的10%2。血栓可发生于颅内静脉系统的任何部位，其中上矢状窦（SSS）是CVST最常受累的区域之一，且可累及多支血管。由于静脉窦狭窄或闭塞，颅内静脉回流受阻，常伴有颅内压升高3。CVST的临床表现复杂且随时间变化，尽管症状缺乏特异性，最常见的症状仍包括头痛（77.2%）、癫痫发作（42.7%）和神经功能缺损（39.9%）。严重情况下可出现昏迷甚至死亡4,5。近年来，随着整体医疗健康水平和公众健康意识的提高，相关危险因素的比例发生变化，创伤和感染所占比例下降，而由妊娠、产褥期、口服避孕药及其他因素引起的CVST比例逐渐上升5。

目前，脑静脉窦血栓形成（CVST）的发病机制仍不明确。为了深入探索CVST，需要进一步开展病理生理学研究。然而，大多数研究方法具有侵入性，因此在临床上难以实施。由于临床研究存在诸多限制，动物模型在基础研究和转化研究中具有不可替代的优势。

CVST 的病因复杂，因其初始发病常被忽视，且血栓形成的位置具有高度变异性。幸运的是，动物模型能够更好地控制这些因素。在过去的几十年中，已建立了多种 CVST 动物模型，每种模型均有其自身的缺点。根据不同的制备方法，大致可分为以下几类：简单的 SSS 结扎模型6,7；SSS 内注射促凝剂模型8；三氯化铁诱导的 SSS 血栓形成模型9；光化学诱导的 SSS 血栓形成模型10；以及自制栓塞闭塞 SSS 模型11。然而，大多数这些模型无法避免对动物大脑皮层造成的侵入性损伤，也无法精确控制缺血的时间和部位。在某些模型中，血栓会自发再通；而在其他模型中，SSS 则会永久闭塞。此外，复杂的操作和/或严重的损伤可能会影响这些模型后续的病理生理学研究结果。

本研究将线栓插入Sprague-Dawley（SD）大鼠的上矢状窦（SSS），成功建立了一种损伤小、可控性强且稳定性良好的脑静脉窦血栓形成（CVST）模型。此外，结合小动物磁共振成像（MRI）和激光散斑血流成像技术，验证了该模型的有效性。我们评估了模型建立前后脑血流的变化情况，并考察了模型的稳定性，为深入研究CVST的发生、发展及其相关病理生理机制奠定了基础。

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方案

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涉及动物受试者的实验程序已获得温州医科大学医学伦理与规范委员会的批准，并符合中国关于实验动物使用与护理的法律法规。

1. 线塞、SD大鼠及实验设备的准备

  1. 使用直径为 0.28 mm 的尼龙线作为线栓的主体。
    注意：尼龙线的软硬度应适中。
  2. 用硅胶材料包裹尼龙线的一端，线栓硅胶部分长度约为 1.2 cm，直径约为 1.2 mm。头部呈锥形，硅胶部分为圆柱形，另预留 5–7 cm。尼龙线易于夹持，术后可根据具体需要进行裁剪。
  3. 术前用 75% 乙醇浸泡线栓 3 分钟，堵闭前用生理盐水冲洗残留的乙醇。
  4. 选取 12 只雄性 SD 大鼠，体重介于 280 至 320 g 之间，随机分为假手术组和实验组（每组 n = 6）。经过一周的环境适应后，术前禁食 12 小时，禁水 4 小时。
  5. 准备实验所需以下仪器设备：小动物麻醉机、脑立体定位仪、解剖显微镜、高速颅骨钻、剪刀、镊子、血管钳、持针器、缝合针线、2 mL 注射器、激光散斑血流成像系统以及小动物 MRI 扫描仪。

2. 通过线栓栓塞法构建 SD 大鼠 SSS 栓塞模型

  1. 将SD大鼠放入麻醉诱导箱中，使用小动物麻醉机输送4%异氟烷以诱导麻醉。随后用镊子确认SD大鼠后肢及脚趾对中度夹捏无反应。
  2. 迅速将头部毛发已剃除的SD大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上。以1.5–2.0%异氟烷（流速0.5 L/min）维持麻醉，呼吸频率稳定在40–60次/分钟。通过加热垫将大鼠体温维持在37±0.2 °C。
    1. 将大鼠固定于立体定位架后，涂抹无菌眼用润滑剂，以保护角膜在麻醉期间不致干燥。
  3. 用5%聚维酮碘与75%乙醇交替擦拭大鼠头部表面三次进行消毒。于头部正中做一长约2.0 cm的皮肤切口，随后小心剥离顶部筋膜及骨膜，充分暴露颅骨。
    1. 确认前囟、后囟、冠状缝、矢状缝及人字缝的位置。
  4. 以冠状缝与人字缝之间的区域作为血流观察区。为避免颅骨影响激光散斑血流成像的观察效果，需在观察区域磨薄颅骨，直至血管清晰可见。磨薄区域大小约为1.0 cm × 1.0 cm。此步骤及后续操作均在解剖显微镜下进行。
    1. 颅骨打磨过程中，应使用常温生理盐水反复冲洗钻头，避免高温灼伤大脑皮层。
  5. 使用高速钻头在以bregma为中心的6.0 mm × 4.0 mm骨窗范围内磨除颅骨，暴露bregma区域的上矢状窦（SSS）。
    1. 打磨过程中使用生理盐水冷却颅骨。当颅骨变薄后，用镊子小心移除残留骨片，避免撕裂上矢状窦。
  6. 选择合适的线栓，以上矢状窦bregma点作为插栓点，用2 mL注射器针头小心穿刺，迅速将线栓头部插入插栓点。
    1. 此时线栓头部末端与上矢状窦之间的角度应约为30–45°；随后调整线栓末端与上矢状窦之间的角度至0–10°，缓慢将线栓沿窦腔中心插入，直至头部到达窦汇后缘。随后剪除多余的尾部。
      ​注意：穿刺上矢状窦时可能出现快速出血。若线栓末端无法一次性迅速插入插栓点，可用小块纱布或棉球轻轻压迫插栓点，同时缓慢滑动以小心暴露插栓点，再迅速将线栓末端插入上矢状窦。线栓插入后，若插栓点仍有出血，可使用明胶海绵等止血材料进行止血。

3. SD 大鼠脑表面血流的检测

  1. 使用激光光源均匀照射血流观测区域。反射光由相机采集后传输至计算机进行分析。激光散斑血流成像系统的参数设置如下：波长：λ = 785 nm；图像曝光时间：T = 10 ms。
  2. 将SD大鼠的血流观测区域置于激光散斑血流成像系统的视野中央，持续监测脑表面血流2分钟。采集并处理每只SD大鼠栓塞前后血流数据，获得观测区域的激光散斑血流图。
  3. 用生理盐水反复冲洗手术区域，清除骨屑和残留物。缝合皮肤（0#缝线），并用碘伏消毒。
  4. 术后维持大鼠体温，直至其苏醒后单笼饲养，并自由摄取食物和水。ad libitum。假手术组不得进行栓塞。
  5. 数据采集完成后，进行后期处理。
    1. 利用激光散斑血流成像系统软件提供的工具完成感兴趣区域（ROI）的选择。所得数值为ROI内的平均血流值，以及栓塞前后局部脑血流值。以栓塞前的血流值作为基线值。
    2. 选择四个ROI，测量每个ROI内脑血流的相对变化，以相对于基线值的百分比变化表示。

4. 小动物磁共振成像中线材位置的检测

  1. 使用以下T2加权成像（T2WI）参数进行MRI扫描：回波时间（TE）= 33 ms，重复时间（TR）= 3000 ms，激发次数（NEX）= 4，层数 = 28，层厚 = 0.8 mm，矩阵大小 = 256*256 mm2，翻转角 = 80°，视野（FOV）= 30*30 mm2，扫描时间 = 6分24秒；磁共振血管成像（MRA）参数设置如下：TE = 4.4 ms，TR = 12 ms，NEX = 4，层数 = 80，层厚 = 0.4 mm，矩阵大小 = 256*256 mm2，翻转角 = 80°，FOV = 30*30 mm2，扫描时间 = 16分23秒40毫秒。
  2. 将动物固定于MRI扫描台上，通过定位扫描校准脑部位置，确认位置无误后进行T2WI和MRA序列扫描。
  3. 检测过程中通过动物麻醉机持续维持麻醉状态，随后通过腹腔注射过量戊巴比妥处死SD大鼠。
  4. 图像采集与后处理：图像数据采集完成后，为更清晰地观察上矢状窦（SSS）内血栓栓塞状态，采用伪彩增强方法显示大鼠脑部T2WI图像。

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结果

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采用缝线法建立SD大鼠SSS血栓模型时，需预先准备好缝线（图1A），并备齐实验所需设备（图1B）。由于操作精细，模型制备需在解剖显微镜下完成。主要操作步骤如图2所示。为便于描述模型血流观察的具体细节，图3B标注了血流观察区域、骨窗及栓塞点，并展示了缝线栓子插入SSS后的状态（图3C）。模型制备完成后，采用激光散斑血流成像技术检测SD大鼠脑表面的血流情况（图4A、B）。图4C显示，与大脑中动脉（MCA）和毛细血管（CAPs）相比，SSS及桥静脉（BVs）的血流量显著降低。随后，采用小动物MRI从水平位（图5A）、矢状位（

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讨论

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本研究通过将自制的线栓插入SD大鼠的上矢状窦（SSS），成功建立了一种新型的CVST模型。此外，结合激光散斑血流成像与小动物MRI，对SD大鼠栓塞前后脑表面血流变化进行监测，以标准化缺血的时间点与部位。

1989年，Longa 等人通过将自制的尼龙缝合线逆行插入大鼠的颈外动脉，建立了可逆性的大脑中动脉（MCA）阻塞模型12。为了提高该模型的稳定性，此后陆续提出了多种改进方法13。该MCA阻塞模型能够精确定位缺血的时间和部位，易于实现再通，已被广泛应用于脑动脉卒中的基础研究14,15。在本研究中，基于MCAO模型的设计，通过将自制的线栓插入上矢状窦（SSS）起始位置的中心，建立了一种新型的脑静脉窦血栓形成（CVST）模型。

为了阐明颅内静脉窦血栓形成（CVST）的致病机制，已建立并应用了多种动物模型（表...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究由福建中医药大学高层次人才科研基金（X2019002-talents）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL 注射器Becton,Dickinson and Company301940
脑立体定位仪深圳瑞沃德生命科技有限公司68025
解剖显微镜武汉赛默飞奥光电技术有限公司SIM BFI-HR PRO
高速颅骨钻深圳瑞沃德生命科技有限公司78046
激光散斑血流成像系统武汉赛默飞奥光电技术有限公司SIM BFI-HR PRO
持针器深圳瑞沃德生命科技有限公司F31022-12
缝合线深圳瑞沃德生命科技有限公司F33303-08
剪刀深圳瑞沃德生命科技有限公司S13029-14
硅胶Heraeus Kulzer302785
小动物麻醉机深圳瑞沃德生命科技有限公司R540
小动物磁共振成像仪Bruker Medical GmbHBiospec 94/30 USR
镊子深圳瑞沃德生命科技有限公司F11029-11
血管钳深圳瑞沃德生命科技有限公司F22003-09

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Sprague Dawley MRI

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