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通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞组分分离

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DOI：

10.3791/62119

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2021年8月12日

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1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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摘要

该分级分离方案可使研究人员从哺乳动物细胞中分离出细胞质、细胞核、线粒体和膜蛋白。后两种亚细胞组分通过等密度梯度离心进一步纯化。

摘要

本方案描述了一种利用去垢剂组合、机械裂解和等密度梯度离心法从哺乳动物细胞中获取亚细胞器蛋白组分的方法。该方法的主要优势在于，不依赖单一的增溶去垢剂来分离亚细胞组分，从而能够将细胞质膜与其他膜结合细胞器有效分离。本方法可为确定蛋白质在细胞内的定位提供一种可重复、可扩展且具有选择性的技术手段。该方法已成功用于从人单核细胞系U937中分离胞质、细胞核、线粒体及质膜蛋白。尽管本方案已针对该细胞系进行了优化，但仍可作为其他细胞系进行亚细胞分级分离的合适起始方案。文中还讨论了该方法可能存在的技术难点及其规避策略，以及针对其他细胞系可能需要进行的调整。

引言

亚细胞分级分离是一种通过多种方法裂解细胞并将其分离为不同组分的技术。研究人员可利用该技术确定蛋白质在哺乳动物细胞中的定位，或富集那些原本难以检测的低丰度蛋白质。尽管目前已存在一些亚细胞分级分离方法，也有可购买的商业试剂盒，但这些方法和试剂盒存在若干局限性，而本实验方案旨在克服这些问题。大多数细胞分级分离方法完全依赖去垢剂1,2，通过使用含有浓度递增去垢剂的缓冲液来溶解不同的细胞组分。虽然这种方法快速且方便，但所获得的组分纯度较低。这些方法仅适用于研究人员轻松分离细胞中的一两种组分，却不足以同时从同一样本中分离出多种亚细胞组分。单纯依赖去垢剂通常会导致膜包被的细胞器和质膜被无差别地溶解，从而使这些组分的分离变得困难。使用此类试剂盒的另一个问题是研究人员无法针对特定应用对其进行修改或优化，因为其中大多数组分属于专有配方。最后，这些试剂盒价格昂贵，且使用次数有限，因此在处理较大样本时并不理想。

尽管已有不依赖去垢剂的线粒体分离试剂盒，但这些试剂盒并非专为分离质膜而设计，且获得的样品量明显低于标准分离方案3,4。虽然差速离心法耗时较长，但通常能够获得仅使用去垢剂试剂盒无法实现的 distinct 组分1。不完全依赖增溶去垢剂的分离方法还允许进一步通过超速离心和等密度梯度离心进行纯化，从而减少组分间的交叉污染。本分离方案展示了利用去垢剂与高速离心相结合的方法，从 U937 单核细胞中分离亚细胞组分。该方法有助于从哺乳动物细胞中分离出细胞核、细胞质、线粒体和质膜组分，并使各组分间的污染降至最低。

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方案

1. 准备缓冲液和试剂

  1. 配制新鲜的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂溶液。
    1. 将17.4 mg苯甲基磺酰氟（PMSF）加入1 mL 100%乙醇中，配制100 mM储备液。
      ​注意：操作PMSF时需佩戴防护装备，因其在摄入、吸入以及接触皮肤或眼睛时具有危害性，对眼睛和皮肤具有腐蚀性。
    2. 根据制造商说明书，配制市售的蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）。
    3. 将91.9 mg偏钒酸钠（SOV）加入1 mL去离子水中，配制500 mM储备液。
      注意：操作SOV时需佩戴防护装备，因其若被摄入、吸入或接触眼睛可能具有危害性。严重暴露可能导致死亡。
  2. 配制裂解缓冲液A、胞质分离（CI）缓冲液、细胞溶解（CS）缓冲液、核裂解（NL）缓冲液、裂解缓冲液B、细胞匀浆（CH）缓冲液、碘克沙醇稀释液以及去垢剂。
    1. 将8.7 g氯化钠（NaCl）和50 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，1 M，pH 7.4）加入950 mL去离子水中，配制裂解缓冲液A（终浓度为150 mM NaCl和50 mM HEPES）。
    2. 按如下步骤制备去垢剂储备液：将0.1 g十二烷基硫酸钠（SDS）加入10 mL裂解缓冲液A中（终浓度为1% SDS），将0.1 g脱氧胆酸钠加入10 mL裂解缓冲液A中（终浓度为1%），将2.5 mg皂苷素加入10 mL裂解缓冲液A中（终浓度为250 µg/mL），并加入1 mL非离子型、非变性去垢剂（参见 材料表) 加至 9 mL 裂解缓冲液 A 中（终浓度为 10% (v/v)）。
    3. 通过将10 µL PMSF储备液（100 mM）、10 µL蛋白酶抑制剂（100x）、2 µL SOV储备液（500 mM）和100 µL皂苷储备液（250 µg/mL）加入878 µL裂解缓冲液A中，配制CI缓冲液（终浓度分别为1 mM PMSF、1x蛋白酶抑制剂、1 mM SOV和25 µg/mL皂苷）。配制完成后将溶液置于冰上，待加入细胞沉淀前保持低温。
    4. 通过加入10 µL PMSF储备液（100 mM）、10 µL蛋白酶抑制剂（100倍）、2 µL SOV储备液（500 mM）和100 µL非离子性非变性去垢剂储备液（参见 材料表)（10%）和118 µL 己二醇储存液（8.44 M）加入760 µL 裂解缓冲液A中（终浓度为1 mM PMSF、1×蛋白酶抑制剂、1 mM SOV、1%非离子型非变性去污剂和1 M 己二醇）。将溶液置于冰上，待加入细胞沉淀前保持低温。
    5. 将10 µL PMSF储备液（100 mM）、10 µL蛋白酶抑制剂（100倍）、2 µL SOV储备液（500 mM）、50 µL脱氧胆酸钠储备液（10%）、100 µL SDS储备液（1%）以及118 µL己二醇储备液（8.44 M）加入710 µL裂解缓冲液A中，配制NL缓冲液（终浓度分别为1 mM PMSF、1倍蛋白酶抑制剂、1 mM SOV、0.5%脱氧胆酸钠（v/v）、0.1% SDS（w/v）和1 M己二醇）。将该溶液置于冰上，待加入核沉淀前保持低温。
    6. 加入20 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、0.74 g 氯化钾（KCl）、0.19 g 氯化镁（MgCl₂）2)，2 mL 乙二胺四乙酸（0.5 M EDTA），2 mL 乙二醇双（β-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（0.5 M EGTA）、38.3 g 甘露醇和 23.9 g 蔗糖溶于 980 mL 去离子水中，配制裂解缓冲液 B（终浓度为 20 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM MgCl₂）2，1 mM EDTA，1 mM EGTA，210 mM 甘露醇和70 mM 蔗糖）。
    7. 通过将10 µL PMSF储备液（100 mM）和2 µL SOV储备液（500 mM）加入988 µL裂解缓冲液B中配制CH缓冲液（PMSF和SOV的终浓度分别为1 mM和1 mM；根据待裂解细胞数量调整最终体积）。将溶液置于冰上，直至加入细胞沉淀。
    8. 通过加入12 mL HEPES（1 M，pH 7.4）、447 mg KCl、114 g MgCl₂制备碘克沙醇稀释液2，将1.2 mL 0.5 M EDTA、1.2 mL 0.5 M EGTA、21.3 g 甘露醇和14.4 g 蔗糖加入88 mL 去离子水中（终浓度为120 mM HEPES、60 mM KCl、12 mM MgCl₂）2，6 mM EDTA、6 mM EGTA、1200 mM 甘露醇和 420 mM 蔗糖）。
    9. 将缓冲液置于 4 °C 保存，皂苷素置于 -20 °C 保存。

2. 胞质蛋白的提取

注意：以下步骤可用于U937细胞的培养与扩增，随后提取胞质蛋白。在所用浓度下，皂苷（digitonin）将透化细胞膜而不破坏其结构，从而释放胞质蛋白，同时保留其他细胞内蛋白。

  1. 在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养细胞。确保细胞总数达到6 × 108个。
    注意：本实验中使用标准血细胞计数板和显微镜进行细胞计数。
  2. 将培养的细胞在400 × g条件下离心10分钟。弃去上清液后，将细胞沉淀用室温磷酸盐缓冲液（PBS）重悬，终浓度为4 × 106个细胞/mL，并轻轻吹打以分散细胞团块。
  3. 将细胞悬液在400 × g条件下离心10分钟以收集细胞沉淀。弃去上清液，将细胞沉淀用预冷的裂解缓冲液A（步骤1.2.1中配制）重悬，终浓度为2 × 107个细胞/mL。
  4. 取7.5 mL用裂解缓冲液A悬浮的细胞（共3 × 107个细胞），置于冰上备用，用于核蛋白提取（第6部分）。将剩余细胞悬液在4 °C、400 × g条件下离心10分钟以收集细胞沉淀。
    注意：后续所有操作均需在4 °C或冰上进行，所有缓冲液需预先冷却。
  5. 弃去上清液，将细胞沉淀用CI缓冲液重悬，终浓度为2 × 107个细胞/mL，并轻轻吹打以分散细胞团块。将细胞悬液在4 °C下翻转旋转20分钟。
  6. 将细胞悬液在4 °C、400 × g条件下离心10分钟，将上清液转移至洁净离心管中。保留细胞沉淀并置于冰上保存。将收集的上清液在4 °C、18,000 × g条件下离心20分钟，以沉淀细胞碎片。
    注意：此高速离心步骤对于防止细胞器和膜结合蛋白污染胞质组分至关重要。
  7. 将沉淀弃去，上清液转移至新的洁净离心管中。重复步骤2.6中的两次离心操作，直至离心后不再出现沉淀。
  8. 收集上清液，即为胞质组分。短期储存（1个月内）时，应将上清液保存于4 °C；长期储存（>1个月）时，需将上清液与含1×还原剂的1× Laemmli缓冲液混合，在95 °C加热7分钟，然后储存于-20 °C或-80 °C。
  9. 将步骤2.6中获得的细胞沉淀用裂解缓冲液A重悬，终浓度为4 × 106个细胞/mL，并轻轻吹打以分散细胞团块。

3. 细胞匀浆

注意：以下步骤可用于对经皂苷（digitonin）处理的细胞（来自步骤 2.9）进行机械匀浆，这是分离线粒体和膜蛋白组分所必需的。

  1. 将细胞悬液在裂解缓冲液A（按步骤2.9配制）中离心，保留沉淀，弃去上清液，以去除细胞沉淀中过量的皂苷和胞质污染物。
    注意：可重复使用裂解缓冲液A洗涤，以进一步去除过量的胞质污染物。
  2. 用预冷的CH缓冲液（按步骤1.2.7配制）重悬细胞沉淀，终浓度为4 × 106 个细胞/mL。将细胞悬液置于冰上孵育30分钟。
  3. 若采用珠磨法进行机械裂解，将30 g预清洗的3.2 mm不锈钢珠放入50 mL带裙边的离心管中，加入15 mL裂解缓冲液B，并置于冰上预冷。若使用Dounce匀浆器（配紧贴的B型杵头），则加入适量裂解缓冲液B，插入杵头后置于冰上预冷。
  4. 孵育结束后（步骤3.2），弃去珠磨管（或Dounce匀浆器）中的裂解缓冲液B，将15 mL细胞悬液转移至珠磨管中（或将适量细胞悬液转移至匀浆器中）。
  5. 若采用珠磨法，将含有细胞悬液的带裙边珠磨管放入匀浆仪中，设置为8档速度运行5分钟。若使用Dounce匀浆器，则保持其处于冰上，用杵头以缓慢、均匀的动作来回推拉40次（或采用讨论部分所述的其他机械裂解方法）。
    注意：若使用的匀浆仪型号与本文所用不同，可能需要通过实验确定合适的转速和时间。
  6. 将匀浆液转移至洁净的离心管中，在4 °C条件下以400 × g离心10分钟。将上清液转移至新的洁净离心管中并保留；弃去沉淀。
    ​注意：本方案可在此处暂停，匀浆液可在4 °C短期保存（24小时）。

4. 去除杂质及粗线粒体与膜组分的分离

注意：以下步骤将通过逐步提高离心速度离心匀浆液，以去除细胞碎片。随后进行差速离心，以分离粗线粒体和膜组分。

  1. 将匀浆液（来自步骤 3.6）在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。
  2. 将上清液（来自步骤 4.1）在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。
  3. 将上清液（来自步骤 4.2）在 4 °C 条件下以 2,000 × g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的离心管中，弃去沉淀。
  4. 将上清液（来自步骤 4.3）在 4 °C 条件下以 4,000 × g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的离心管中，保留沉淀，此沉淀即为粗线粒体组分。
  5. 将上清液（来自步骤 4.4）在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 1 小时。弃去上清液，保留沉淀，此沉淀即为粗膜组分。
    ​注意：此处可暂停实验流程，沉淀样品可在 4 °C 短期保存（24 小时）。

5. 等密度梯度纯化

注意：以下步骤利用等密度梯度离心法纯化粗线粒体和膜组分。

  1. 通过将1份稀释液（步骤1.1.3中制备）与5份碘克沙醇（60% w/v 储存液）混合，制备50% (v/v) 的碘克沙醇工作液。通过将50% (v/v) 工作液与裂解缓冲液B按适当比例混合，制备10%、15%、20%、25%、30% 和 35% 的碘克沙醇溶液（v/v）。
  2. 将粗线粒体和膜组分沉淀物（来自步骤4.4和4.5）分别用200 µL裂解缓冲液B重悬。通过向200 µL重悬沉淀物中加入1800 µL碘克沙醇工作液（50% (v/v)），调节至45% (v/v) 碘克沙醇浓度。
  3. 按以下方式制备碘克沙醇不连续梯度（根据超速离心管的容量适当调整体积）：在8 mL开口薄壁超速离心管底部加入1 mL 15% (v/v) 碘克沙醇溶液，然后使用底层叠加法（underlaying technique）在第一层下方依次加入1 mL 20% (v/v)、1 mL 25% (v/v)、1 mL 30% (v/v) 和 1 mL 35% (v/v) 碘克沙醇溶液。
    注意：此步骤需制备两个梯度，一个用于线粒体组分，另一个用于膜组分。
  4. 在一个梯度中，使用底层叠加法将2 mL粗线粒体沉淀（悬浮于45% (v/v) 碘克沙醇中）加入离心管底部，位于35% (v/v) 碘克沙醇层之下。在另一梯度中，同样使用底层叠加法将2 mL粗膜沉淀（悬浮于45% (v/v) 碘克沙醇中）加入另一离心管底部，位于35% (v/v) 碘克沙醇层之下。
  5. 通过在梯度管顶部叠加1 mL 10% (v/v) 碘克沙醇溶液至15% 层之上，向每根梯度管顶部加液。通过添加10% (v/v) 碘克沙醇溶液，使各管之间的重量差异控制在0.1 g以内，以实现平衡。
  6. 将密度梯度管在4 °C条件下以100,000 × g 离心18小时。确保所用超速离心机的加速度和减速度均设为最低值。
    注意：在线粒体梯度中，将在25% 与 30% (v/v) 碘克沙醇之间的界面处观察到一条可见条带，此即为纯化的线粒体组分。在膜梯度中，将在15% (v/v) 碘克沙醇组分中观察到一条可见条带，此即为纯化的膜组分。膜梯度中可能在25% 和 30% (v/v) 碘克沙醇组分中出现额外条带，提示存在线粒体污染。
  7. 从管顶部开始收集各组分，每1 mL为一份，注意尽量减少含有可见条带组分的体积，并在收集每一层后更换移液器吸头。或者，可用针头穿刺薄壁管侧面，直接收集可见条带。
  8. 将样品按步骤2.8所述方式保存，直至通过蛋白定量检测和Western blot验证。

6. 细胞核蛋白提取

注意：使用离子型和非离子型去污剂，以及超声处理和离心等技术，以下步骤将溶解所有细胞膜，从而实现核蛋白的分离。

  1. 将步骤 2.4 中悬浮于裂解缓冲液 A 的 7.5 mL 细胞等分试样离心，弃去上清液。加入 800 µL 冰冷的 CS 缓冲液（步骤 1.2.4 中配制），通过移液和涡旋重悬沉淀。将样品在冰上（或 4 °C）孵育 30 分钟，以破坏质膜和细胞器膜，同时保护核蛋白。
  2. 在 4 °C 下以 7,000 × g 离心细胞悬液 10 分钟，弃去上清液。向核沉淀中加入 800 µL 冰冷的 NL 缓冲液（步骤 1.2.5 中配制），并加入 1 U/µL 苯甲酸酶。通过轻柔移液重悬沉淀。在 4 °C 下于翻转旋转仪上孵育 30 分钟，以破坏核膜。
  3. 将样品管置于冰浴中冷却，以 20% 功率超声处理 5 秒（重复 3 次，脉冲间间隔 5 秒），结合步骤 6.2 中加入的苯甲酸酶，以剪切核酸。
  4. 在 4 °C 下以 7,800 × g 离心超声处理后的样品 10 分钟。收集并保存上清液，即为核组分。收集上清液时务必避免扰动不溶性沉淀。如需储存，可按照步骤 2.8 所述方法处理样品。

7. 蛋白质定量与蛋白质印迹分析

注意：以下步骤将定量各组分中的总蛋白，并确认亚细胞组分的纯度。

  1. 采用标准Bradford法测定各组分中的总蛋白含量。预期蛋白产量请参见表1。
    注意：也可使用其他蛋白检测方法，如二辛可宁酸（BCA）法或280 nm处吸光度测定，替代Bradford法测定总蛋白含量。
  2. 将各组分与含1×还原剂的1×Laemmli缓冲液混合，于95 °C加热7分钟。每组分取10 µg上样至标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶中，以20 mA电流运行1小时。
  3. 通过标准免疫印迹转膜程序，在100 V条件下转膜30分钟，将分离后的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用含0.1%非离子型去污剂（v/v）的5%脱脂奶粉TBS缓冲液（1×Tris缓冲盐水）室温封闭PVDF膜30分钟。
  4. 加入针对各亚细胞组分特异性管家蛋白的一抗，4 °C孵育过夜。用含0.1%非离子型去污剂（v/v）的5%脱脂奶粉TBS缓冲液（1×）室温洗涤膜10分钟。
    注意：本实验方案中，分别使用抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH，1:10000）、组蛋白H3（1:2000）、电压依赖性阴离子通道蛋白（VDAC，1:1000）和Na,K+-ATP酶抗体检测胞质、核、线粒体和膜组分。
  5. 加入相应辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（按生产商说明书稀释），室温孵育1小时。用含0.1%非离子型去污剂（v/v）的5%脱脂奶粉TBS缓冲液（1×）室温洗涤膜10分钟。采用标准化学发光法显影印迹膜。

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结果

该实验流程的示意图（图1）直观地总结了成功分离悬浮培养的U9375细胞组分的各个步骤。从等体积（1 mL）等密度梯度顶部收集的组分显示了线粒体和膜组分的纯化结果（图2）。使用针对VDAC（一种定位于线粒体外膜的蛋白质）6的抗体，表明线粒体组分迁移至25%和30%碘克沙醇（v/v）的组分中（图2A）。使用针对Na,K+-ATP酶α1亚基的抗体（该亚基是主要存在于质膜上的整合膜异源二聚体的一部分）7，显示膜污染组分与纯线粒体组分实现了分离（图2A）。纯膜组分迁移至密度最低的10%和15%碘克沙醇（v/v）组分中（图2B）。膜组分中的线粒体污染通过梯度得以分离。

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讨论

该方法是对先前发表的无需使用高速离心的亚细胞组分分离技术的一种改进版本11。此改进后的方法需要更专业的设备以获得最佳结果，但其更为全面且结果具有更高的可重复性。

由于在坏死性凋亡过程中无法分离线粒体和膜样品以分析蛋白质定位，因此有必要开发初始方案12。尝试使用大多数市售试剂盒中常见的仅基于去垢剂的方法，结果得到包含质膜和细胞内所有膜包被细胞器的均一混合物。这些试剂盒的其他局限性包括无法对操作流程进行修改、单个样品成本较高、样品体积受限以及可处理的样品数量有限。本文所述方法可按任意规模调整，可修改为仅分离较少的组分，且无需使用昂贵的试剂即可完成。通过使用更多细胞可提高各组分的得率；操作步骤可根据具体研究需求进行调整，方法执行具有灵活性。例如，若研究人员不检测某一特定亚细胞组分，则在操作过程中无需分离该样品。同样地，如果研究人员不计划研究蛋白质的磷酸化状态（如无需使用正钒酸钠）或无需担心蛋白质变性问题（如无需使用己二醇），则可省略特定抑制剂或试剂的添加步骤。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由 NIH R15-HL135675-01 和 NIH 2 R15-HL135675-02 项目资助，项目负责人为 T.J.L.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Benzonase核酸酶Sigma-AldrichE1014
Bullet Blender 组织匀浆器下一步进展61-BB50-DX
皂苷SigmaD141
滚轴混合器ThermoFisher
乙二胺四乙酸（EDTA）SigmaE9884
乙二醇双(β乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）SigmaE3889
GAPDH (14C10) 细胞信号转导技术2118
HEPESVWR97064-360
己二醇Sigma68340
IgepalSigmaI7771非离子型非变性去垢剂
KClSigmaP9333
甘露醇SigmaM9647
MgCl2SigmaM8266
NaClSigmaS9888
Na, K-ATP酶 α1（D4Y7E）细胞信号传导技术23565
敞口聚碳酸酯管，16 x 52 mmSeton Scientific7048
OptiPrep（碘克沙醇） 密度梯度介质SigmaD1556-250ML
苯甲基磺酰氟（PMSF）SigmaP7626
蛋白酶抑制剂混合物，常规使用VWRM221-1ML
冷冻离心机ThermoFisher
S50-ST 摇摆转子Eppendorf
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma436143
脱氧胆酸钠SigmaD6750
原钒酸钠（SOV）Sigma567540
超声波破碎仪ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus 微型超速离心机赛默飞世尔科技
3.2 毫米不锈钢珠下一个进展SSB32
蔗糖SigmaS0389
Tris缓冲盐水（TBS）VWR97062-370
Tween 20Western blotting 缓冲液中的非离子型去污剂
VDAC（D73D12）细胞信号传导技术4661

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

to:

William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

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