通过等密度梯度纯化对U937细胞进行细胞组分分离

摘要

该分级分离方案可使研究人员从哺乳动物细胞中分离出细胞质、细胞核、线粒体和膜蛋白。后两种亚细胞组分通过等密度梯度离心进一步纯化。

摘要

本方案描述了一种利用去垢剂组合、机械裂解和等密度梯度离心法从哺乳动物细胞中获取亚细胞器蛋白组分的方法。该方法的主要优势在于，不依赖单一的增溶去垢剂来分离亚细胞组分，从而能够将细胞质膜与其他膜结合细胞器有效分离。本方法可为确定蛋白质在细胞内的定位提供一种可重复、可扩展且具有选择性的技术手段。该方法已成功用于从人单核细胞系U937中分离胞质、细胞核、线粒体及质膜蛋白。尽管本方案已针对该细胞系进行了优化，但仍可作为其他细胞系进行亚细胞分级分离的合适起始方案。文中还讨论了该方法可能存在的技术难点及其规避策略，以及针对其他细胞系可能需要进行的调整。

引言

亚细胞分级分离是一种通过多种方法裂解细胞并将其分离为不同组分的技术。研究人员可利用该技术确定蛋白质在哺乳动物细胞中的定位，或富集那些原本难以检测的低丰度蛋白质。尽管目前已存在一些亚细胞分级分离方法，也有可购买的商业试剂盒，但这些方法和试剂盒存在若干局限性，而本实验方案旨在克服这些问题。大多数细胞分级分离方法完全依赖去垢剂^1,2，通过使用含有浓度递增去垢剂的缓冲液来溶解不同的细胞组分。虽然这种方法快速且方便，但所获得的组分纯度较低。这些方法仅适用于研究人员轻松分离细胞中的一两种组分，却不足以同时从同一样本中分离出多种亚细胞组分。单纯依赖去垢剂通常会导致膜包被的细胞器和质膜被无差别地溶解，从而使这些组分的分离变得困难。使用此类试剂盒的另一个问题是研究人员无法针对特定应用对其进行修改或优化，因为其中大多数组分属于专有配方。最后，这些试剂盒价格昂贵，且使用次数有限，因此在处理较大样本时并不理想。

尽管已有不依赖去垢剂的线粒体分离试剂盒，但这些试剂盒并非专为分离质膜而设计，且获得的样品量明显低于标准分离方案^3,4。虽然差速离心法耗时较长，但通常能够获得仅使用去垢剂试剂盒无法实现的 distinct 组分¹。....

方案

1. 准备缓冲液和试剂

1. 配制新鲜的磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂溶液。
   1. 将17.4 mg苯甲基磺酰氟（PMSF）加入1 mL 100%乙醇中，配制100 mM储备液。
      ​注意：操作PMSF时需佩戴防护装备，因其在摄入、吸入以及接触皮肤或眼睛时具有危害性，对眼睛和皮肤具有腐蚀性。
   2. 根据制造商说明书，配制市售的蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）。
   3. 将91.9 mg偏钒酸钠（SOV）加入1 mL去离子水中，配制500 mM储备液。
      注意：操作SOV时需佩戴防护装备，因其若被摄入、吸入或接触眼睛可能具有危害性。严重暴露可能导致死亡。
2. 配制裂解缓冲液A、胞质分离（CI）缓冲液、细胞溶解（CS）缓冲液、核裂解（NL）缓冲液、裂解缓冲液B、细胞匀浆（CH）缓冲液、碘克沙醇稀释液以及去垢剂。
   1. 将8.7 g氯化钠（NaCl）和50 mL 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES，1 M，pH 7.4）加入950 mL去离子水中，配制裂解缓冲液A（终浓度为150 mM NaCl和50 mM HEPES）。
   2. 按如下步骤制备去垢剂储备液：将0.1 g十二烷基硫酸钠（SDS）加入10 mL裂解缓冲液A中（终浓度为1% SDS），将0.1 g脱氧胆酸钠加入10 mL裂解缓冲液A中（终浓度为1%），将2.5 mg皂苷素加入10 m....

结果

该实验流程的示意图（图1）直观地总结了成功分离悬浮培养的U937⁵细胞组分的各个步骤。从等体积（1 mL）的等密度梯度顶部收集的组分显示了线粒体和膜组分的纯化结果（图2）。使用针对VDAC的抗体（该蛋白定位于线粒体外膜⁶）检测发现，线粒体组分迁移至25%和30%碘克沙醇（v/v）的组分中（图2A）。使用针对Na,K⁺-ATP酶α1亚基的抗体（该蛋白是主要存在于质膜上的整合膜异源二聚体的一部分⁷）检测表明，膜污染组分与纯线粒体组分实现了分离（图2A）。纯膜组分迁移至密度最低的10%和15%碘克沙醇（v/v）组分中（图2B）。通过梯度离心，膜组分中的线粒体污染得以分离。

讨论

该方法是对先前发表的无需使用高速离心的亚细胞组分分离技术的一种改进版本¹¹。此改进后的方法需要更专业的设备以获得最佳结果，但其更为全面且结果具有更高的可重复性。

由于在坏死性凋亡过程中无法分离线粒体和膜样品以分析蛋白质定位，因此有必要开发初始方案¹²。尝试使用大多数市售试剂盒中常见的仅基于去垢剂的方法，结果得到包含质膜和细胞内所有膜包被细胞器的均一混合物。这些试剂盒的其他局限性包括无法对操作流程进行修改、单个样品成本较高、样品体积受限以及可处理的样品数量有限。本文所述方法可按任意规模调整，可修改为仅分离较少的组分，且无需使用昂贵的试剂即可完成。通过使用更多细胞可提高各组分的得率；操作步骤可根据具体研究需求进行调整，方法执行具有灵活性。例如，若研究人员不检测某一特定亚细胞组分，则在操作过程中无需分离该样品。同样地，如果研究人员不计划研究蛋白质的磷酸化状态（如无需使用正钒酸钠）或无需担心蛋白质变性问题（如无需使用己二醇），则可省略特定抑制剂或试剂的添加步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Benzonase核酸酶	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender 组织匀浆器	下一步进展	61-BB50-DX
皂苷	Sigma	D141
滚轴混合器	ThermoFisher
乙二胺四乙酸（EDTA）	Sigma	E9884
乙二醇双(β乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	细胞信号转导技术	2118
HEPES	VWR	97064-360
己二醇	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	非离子型非变性去垢剂
KCl	Sigma	P9333
甘露醇	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATP酶 α1（D4Y7E）	细胞信号传导技术	23565
敞口聚碳酸酯管，16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep（碘克沙醇） 密度梯度介质	Sigma	D1556-250ML
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma	P7626
蛋白酶抑制剂混合物，常规使用	VWR	M221-1ML
冷冻离心机	ThermoFisher
S50-ST 摇摆转子	Eppendorf
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma	436143
脱氧胆酸钠	Sigma	D6750
原钒酸钠（SOV）	Sigma	567540
超声波破碎仪	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus 微型超速离心机	赛默飞世尔科技
3.2 毫米不锈钢珠	下一个进展	SSB32
蔗糖	Sigma	S0389
Tris缓冲盐水（TBS）	VWR	97062-370
Tween 20			Western blotting 缓冲液中的非离子型去污剂
VDAC（D73D12）	细胞信号传导技术	4661