脊髓腔内注射人源间充质干细胞及其向大鼠脑部迁移的追踪

摘要

可采用多种给药途径将间充质干细胞（MSCs）递送至大脑。在本研究中，通过脊髓腔内注射将MSCs递送至整个神经轴和大脑。将MSCs注射到大鼠的脊髓腔内，并对干细胞的迁移进行追踪和定量分析。

摘要

间充质干细胞（MSCs）已被广泛研究用于多种疾病的治疗。在涉及脑和脊髓功能缺陷的神经退行性疾病中，给药途径至关重要，因为MSCs必须迁移至脑和脊髓。本文描述了一种在大鼠模型中将MSCs注入脊髓腔（脊髓腔内注射）的方法，可同时靶向脑和脊髓。将一百万个MSCs注射至大鼠腰椎2-3节段的脊髓腔内。给药后，大鼠分别在注射后0、6和12小时被处死。采用光学成像和定量实时聚合酶链式反应（qPCR）技术追踪注射的MSCs。本研究结果表明，通过脊髓腔注射的MSCs在12小时后可在脑和脊髓中均被检测到。脊髓腔内注射的优势在于无需全身麻醉，且副作用较少。然而，MSCs向脑部迁移率低的缺点仍需克服。

引言

间充质干细胞
在疾病状态下，间充质干细胞（MSCs）通过旁分泌作用释放具有疾病特异性的治疗性物质¹，这些物质已被报道可调节免疫反应、修复受损组织并清除有毒物质²。因此，在治疗阿尔茨海默病和肌肉减少症等多因素疾病时，MSC疗法被认为比单靶点治疗更为有效^3,4,5,6。此外，与药物相比，MSCs具有归巢效应，能够通过识别体内炎症性细胞因子或趋化因子迁移至受损组织区域^7,8。然而，仅有部分细胞能够到达受损部位，且MSCs在迁移过程中的存活率会下降^9,10,11,12。因此，为了最大化MSCs的治疗效果，必须将具有活性的细胞递送至靶部位。故而在给予MSCs时，应根据目标疾病的特性选择合适的给药途径。

给药途径
治疗药物可通过多种途径给予患者。最常见的方法包括静脉注射进入体循环、口服给药以及皮下或肌肉注射。在神经退行性疾病中，将治疗药物递送至大脑的主要障碍是血脑屏障（BBB）。血脑屏障通过血管与脑实质之间的紧密连接，保护大脑免受外来病原体侵袭^13,14。然而，血脑屏障也矛盾地阻止了治疗药物进入脑实质。因此，穿越血脑屏障是脑部疾病疗法开发中的主要障碍^15,16。为克服这一局限，可通过外科手术将目标物质直接注射到脑内，即进行脑内注射^17,18,19。然而，应考虑手术干预可能带来的副作用，尤其是穿刺针在操作过程中会对神经元细胞造成损伤。

椎管内腔给药
鞘内给药——将药物注入脊髓蛛网膜下腔或脊髓腔——可通过脑脊液（CSF）将药物递送至大脑或神经轴，是脑内注射的一种有效替代方法。根据注射部位的不同，鞘内注射可分为侧脑室、小脑延髓池和脊髓腔注射。这三种途径均能使药物或细胞通过脑脊液扩散至大脑和脊髓。在脑室内或小脑延髓池内注射时，由于药物直接注入靠近大脑的区域，因此向脑组织递送药物的效率可能更高。然而，脊髓腔注射具有无需全身麻醉、无需手术植入脑室内储液器、总体安全性高²⁰，且必要时可重复操作等优势。

本研究旨在验证通过脊髓腔给药将间充质干细胞（MSCs）递送至脑和脊髓的可行性。首先，在大鼠模型中建立脊髓腔通路。随后，使用脂溶性示踪剂DiD（DiIC18(5)；1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基吲哚羰花青，4-氯苯磺酸盐）标记MSCs，以评估干细胞向脊髓和脑组织迁移的效率。通过离体光学成像评估细胞的分布情况。该方法操作简便，无需外科手术干预，不仅可用于干细胞的递送，还可用于向脊髓或脑组织递送药物、抗体、造影剂及其他物质。

方案

注意：本研究已获得三星医疗中心三星生物医学研究所（SBRI）的机构动物护理和使用委员会批准（批准编号：20170125001，日期：2017年1月25日）。SBRI 是国际实验动物评估和认可委员会的认证机构，遵循实验动物资源研究所制定的指导方针开展工作。

1. 人脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的制备

1. 人脐带华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）的培养
   1. 快速将一管人脐带华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）在37 °C水浴中解冻。将WJ-MSCs转移至50 mL锥形管中，并加入至少为细胞体积10倍（v/v）的生长培养基。用移液器吹打混匀以悬浮细胞。
   2. 300 × g 离心 g 5 分钟后，小心弃去上清液，并重悬细胞。
      注意：切勿丢弃细胞沉淀。
   3. 以每平方厘米5,000-6,000个细胞的密度将WJ-MSCs接种于T175培养瓶中². 将WJ-MSCs在37 °C CO₂培养箱中孵育₂ 培养箱中培养。每72小时更换一次生长培养基，直至华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）达到80-90%融合度。
      ​注：通常情况下，MSCs 需要 3-4 天达到 80-90% 汇合度。
2. 人脐带华通胶间充质干细胞的传代培养
   1. 弃去培养基，用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。移除 PBS，加入 5 mL 0.25% 胰蛋白酶-二钠乙二胺四乙酸（EDTA）（参见 材料表)。将细胞置于37 °C的CO₂培养箱中孵育₂ 孵育3分钟，直至华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）从培养瓶脱落。
   2. 加入含有10%胎牛血清的5 mL培养基以中和0.25%胰蛋白酶-EDTA。收集细胞混合液并转移至50 mL锥形管中。用10 mL培养基冲洗细胞培养瓶，并使用无菌血清移液管将细胞收集至50 mL离心管中。
   3. 将细胞混合物在300 × g 5 分钟后弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL 培养基中，计数 WJ-MSCs 数量。
      ​注意：切勿丢弃细胞沉淀。
   4. 以每平方厘米4,000–6,000个细胞的密度接种WJ-MSCs²，根据实验的不同而定。
3. 用DiD染料标记WJ-MSCs及用于脊髓腔内注射的WJ-MSCs制备
   注意：DiD 染料标记步骤按照制造商说明书进行。
   1. 当WJ-MSCs达到80%融合度时，按照上述方法进行消化分离。将WJ-MSCs重悬于密度为1 × 10⁶/mL 于无血清的无酚红最低必需培养基（MEM）α中。
   2. 每1 mL细胞悬液中加入5 µL DiD标记溶液，用移液器轻轻混匀。
   3. 37 °C孵育15分钟；将细胞悬液在300 × g 5 分钟。
   4. 移除上清液，并将WJ-MSCs重悬于无酚红的MEM α培养基中，细胞密度为1 × 10⁶/0.2 mL

2. 脐带间充质干细胞的脊髓腔内注射

1. 脊髓腔内注射的准备工作
   1. 使用5%异氟烷麻醉6周龄的Sprague-Dawley大鼠；随后在整个手术过程中以2%异氟烷维持麻醉。
      注意：在开始实验前应优化麻醉条件。
   2. 使用小型动物专用电动剃毛器剃除手术区域的毛发。
      ​注意：电动剃毛器可用手动剃须刀和剃须凝胶替代。
   3. 使用聚维酮碘对手术区域进行消毒。用手术刀做3 cm长的皮肤切口，使用手术刀和剪刀切除残留的皮肤和肌肉组织，暴露腰椎2-3节（L2-3）的棘突。
2. 通过脊髓腔注射DiD标记的WJ-MSCs
   1. 将大鼠置于俯卧位，适当弯曲其脊柱以增大相邻棘突之间的距离，可使用足量纸巾或其他有助于维持合适体位的材料。
   2. 用1 mL注射器吸取0.2 mL DiD标记的WJ-MSCs悬液。将23 G的注射器-针头组合垂直插入L2与L3棘突之间，进针直至接触椎体。
   3. 当针尖接触椎体后，回撤约0.5 cm，使针尖位于椎管内。倾斜注射器，调整针尖方向使其朝向头侧，在1分钟内将WJ-MSCs注入脊髓腔。
      ​注意：注射速度应预先优化。
   4. 注射完成后，将注射器完全从脊髓腔中拔出。缝合切口，并使用聚维酮碘对手术部位进行消毒。
3. 术后处理
   1. 在麻醉状态下，将大鼠稳定并限制其活动，倒置呈45°角持续15分钟。15分钟后停止麻醉，等待大鼠苏醒。

3. 脊髓腔内注射效果的评估

1. 在注射后 0、6 和 12 小时处死大鼠并分离脑和脊髓
   1. 使用 5% 异氟烷麻醉实验动物；在 PBS 灌注期间以 2% 异氟烷维持麻醉状态。
   2. 使用手术剪在膈肌下方做切口。用镊子撑开切口，并向前剪开肋骨以暴露心脏。
   3. 在右心房处刺一个小孔，将蝶形针插入左心室。向左心室灌注 100 mL 冷 PBS，持续 4–5 分钟，直至肝脏血液完全清除。
   4. 灌注完成后，沿矢状面使用手术刀从头部至尾部在背部做一长切口。使用手术剪、镊子和骨剪分离残留的脑组织和整个脊柱。去除残留的肋骨、连接骨及软组织。
2. 离体 DiD 荧光光学成像
   1. 将分离的组织置于光学成像设备的成像腔内。
   2. 设置参数如下：发射波长 700 nm，激发波长 605 nm，曝光时间 2 秒，单位为每秒每平方厘米每球面度光子数（p/s/cm²/sr）。采集光学图像。
      注：所有图像应在相同的照明条件下获取（灯电压、滤光片、光圈、视野和 binning 设置一致）。
   3. 使用绘图工具在脊髓区域绘制三个大小相同的矩形感兴趣区域（ROI），在脑部区域绘制一个圆形感兴趣区域（ROI）。测量各 ROI 的荧光强度。
3. 从脊髓和脑组织中提取基因组 DNA（gDNA）
   1. 使用手术镊、手术剪和咬骨钳小心去除颅骨和脊柱。
   2. 从颅骨和脊柱中取出脑和脊髓组织。将脊髓切成三段（颈段、胸段和腰段）。
      ​注：若组织不能立即分析，必须储存于 -80 °C。
   3. 使用预冷的研钵、研杵和液氮研磨组织。按照制造商说明书，使用商业化试剂盒提取 gDNA。
4. 定量实时聚合酶链式反应（qPCR）
   1. 使用分光光度计测定每个样本中 gDNA 的含量。
   2. 每样本使用 10 ng gDNA，并采用人源 Arthrobacter luteus（ALU）引物进行 qPCR^12,21。
   3. 采用 ΔΔC_T 法计算样本中 WJ-MSCs 的确切数量²²。

结果

为了评估间充质干细胞（MSCs）注入脊髓腔内的有效性，本研究使用了DiD标记的MSCs。在将MSCs注入脊髓腔之前，通过光学成像和荧光显微镜在体外评估了标记效率（图1）。按照方案第3.1节所述方法，使用DiD标记试剂对MSCs进行染色后，拍摄了接种DiD标记MSCs的培养板的光学图像（图1A）。DiD标记的MSCs（+DiD）呈红色；未标记DiD染料的对照MSCs（-DiD）未显示阳性信号。该结果通过荧光显微镜进一步验证（图1B）。同时使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对MSCs进行染色以观察其形态。未标记的MSCs（-DiD）呈蓝色，表明被DAPI或细胞核染色，但未显示与DiD染色相关的红色荧光。相反，DiD标记的MSCs（+DiD）同时呈现蓝色和红色荧光，表明DiD标记方法成功实现。

讨论

间充质干细胞（MSCs）治疗的最佳给药途径应根据目标疾病、患者状况以及拟递送药物的类型来选择。在包括MSC治疗在内的细胞治疗中，必须考虑将干细胞直接注射到脑内或通过脑脊液（CSF）进行鞘内注射，因为细胞无法穿过血脑屏障¹⁹。脊髓腔内注射相对无创，不会像脑室注射那样造成脑部神经损伤，且相关不良反应风险较低²⁰。通过腰椎穿刺获取脑脊液是一种在临床场所可轻松实施的操作。因此，通过脊髓腔注射向患者给予干细胞、药物、对比剂或其他物质并不困难^23,24,25。相比之下，脑室注射需要外科手术干预，操作更为复杂。然而，对于实验动物而言，向脊髓腔内注射比直接向脑内给药更具挑战性，这是因为啮齿类动物（包括小鼠和大鼠）的体型与人类相比非常小²⁶。

在进行椎管内给药时，必须将针头...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco-invitrogen	25200114	细胞培养
胎牛血清	biowest	S1520	培养基添加剂
gentamicin	Gibco-invitrogen	15710-072	培养基添加剂
Gentra Puregene 组织试剂盒	QIAGEN	158689	基因组DNA分离
MEM，无谷氨酰胺，无酚红	Gibco	51200038	WJ-MSC 注射用配方
最低必需培养基α	Gibco-invitrogen	12571063	WJ-MSC 培养基
Power SYBR Green PCR 主混合液	Applied Biosystems	4368577	定量实时PCR试剂
QuantStudio 6 Flex 实时PCR系统	Thermo fisher	4485694	定量实时PCR
台盼蓝	Gibco	15250061	注射
Vybrant DiD 细胞标记溶液	invitrogen	V22887	干细胞标记溶液
Xenogen IVIS Spectrum 系统	Perkin Elmer	124262	光学成像设备