可采用多种给药途径将间充质干细胞（MSCs）递送至大脑。在本研究中，通过脊髓腔内注射将MSCs递送至整个神经轴和大脑。将MSCs注射到大鼠的脊髓腔内，并对干细胞的迁移进行追踪和定量分析。
本文内容
摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）已被广泛研究用于多种疾病的治疗。在涉及脑和脊髓功能缺陷的神经退行性疾病中，给药途径至关重要，因为MSCs必须迁移至脑和脊髓。本文描述了一种在大鼠模型中将MSCs注入脊髓腔（脊髓腔内注射）的方法，可同时靶向脑和脊髓。将一百万个MSCs注射至大鼠腰椎2-3节段的脊髓腔内。给药后，大鼠分别在注射后0、6和12小时被处死。采用光学成像和定量实时聚合酶链式反应（qPCR）技术追踪注射的MSCs。本研究结果表明，通过脊髓腔注射的MSCs在12小时后可在脑和脊髓中均被检测到。脊髓腔内注射的优势在于无需全身麻醉，且副作用较少。然而，MSCs向脑部迁移率低的缺点仍需克服。
引言
间充质干细胞
在疾病状态下，间充质干细胞（MSCs）通过旁分泌作用释放具有疾病特异性的治疗性物质1，这些物质已被报道可调节免疫反应、修复受损组织并清除有毒物质2。因此，在治疗阿尔茨海默病和肌肉减少症等多因素疾病时，MSC疗法被认为比单靶点治疗更为有效3,4,5,6。此外，与药物相比，MSCs具有归巢效应，能够通过识别体内炎症性细胞因子或趋化因子迁移至受损组织区域7,8。然而，仅有部分细胞能够到达受损部位，且MSCs在迁移过程中的存活率会下降9,10,11,12。因此，为了最大化MSCs的治疗效果，必须将具有活性的细胞递送至靶部位。故而在给予MSCs时，应根据目标疾病的特....
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方案
注意：本研究已获得三星医疗中心三星生物医学研究所（SBRI）的机构动物护理和使用委员会批准（批准编号：20170125001，日期：2017年1月25日）。SBRI 是国际实验动物评估和认可委员会的认证机构，遵循实验动物资源研究所制定的指导方针开展工作。
1. 人脐带华通氏胶来源的间充质干细胞的制备
- 人脐带华通胶来源的间充质干细胞（WJ-MSCs）的培养
- 快速将一管人脐带华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）在37 °C水浴中解冻。将WJ-MSCs转移至50 mL锥形管中，并加入至少为细胞体积10倍（v/v）的生长培养基。用移液器吹打混匀以悬浮细胞。
- 300 × g 离心 g 5 分钟后，小心弃去上清液，并重悬细胞。
注意：切勿丢弃细胞沉淀。 - 以每平方厘米5,000-6,000个细胞的密度将WJ-MSCs接种于T175培养瓶中2. 将WJ-MSCs在37 °C CO₂培养箱中孵育2 培养箱中培养。每72小时更换一次生长培养基，直至华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs）达到80-90%融合度。
注：通常情况下，MSCs 需要 3-4 天达到 80-90% 汇合度。
- 人脐带华通胶间充质干细胞的传代培养
- 弃去培养基....
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结果
为了评估间充质干细胞（MSCs）注入脊髓腔内的有效性，本研究使用了DiD标记的MSCs。在将MSCs注入脊髓腔之前，通过光学成像和荧光显微镜在体外评估了标记效率（图1）。按照方案第3.1节所述方法，使用DiD标记试剂对MSCs进行染色后，拍摄了接种DiD标记MSCs的培养板的光学图像（图1A）。DiD标记的MSCs（+DiD）呈红色；未标记DiD染料的对照MSCs（-DiD）未显示阳性信号。该结果通过荧光显微镜进一步验证（图1B）。同时使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对MSCs进行染色以观察其形态。未标记的MSCs（-DiD）呈蓝色，表明被DAPI或细胞核染色，但未显示与DiD染色相关的红色荧光。相反，DiD标记的MSCs（+DiD）同时呈现蓝色和红色荧光，表明DiD标记方法成功实现。
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讨论
间充质干细胞（MSCs）治疗的最佳给药途径应根据目标疾病、患者状况以及拟递送药物的类型来选择。在包括MSC治疗在内的细胞治疗中，必须考虑将干细胞直接注射到脑内或通过脑脊液（CSF）进行鞘内注射，因为细胞无法穿过血脑屏障19。脊髓腔内注射相对无创，不会像脑室注射那样造成脑部神经损伤，且相关不良反应风险较低20。通过腰椎穿刺获取脑脊液是一种在临床场所可轻松实施的操作。因此，通过脊髓腔注射向患者给予干细胞、药物、对比剂或其他物质并不困难23,24,25。相比之下，脑室注射需要外科手术干预，操作更为复杂。然而，对于实验动物而言，向脊髓腔内注射比直接向脑内给药更具挑战性，这是因为啮齿类动物（包括小鼠和大鼠）的体型与人类相比非常小26。
在进行椎管内给药时，必须将针头.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过基础研究项目提供的资助支持，该项目由教育部门资助（NRF-2017R1D1A1B03035940），以及韩国卫生技术研究开发项目提供的资助支持&D 项目，由韩国健康产业开发院（KHIDI）资助，资金来源于保健福祉部 &韩国保健福祉部（资助编号：HI14C3484 和 HI18C0560）。我们感谢 Editage（www.editage.co.kr）在英文语言编辑方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco-invitrogen | 25200114 | 细胞培养 |
| 胎牛血清 | biowest | S1520 | 培养基添加剂 |
| gentamicin | Gibco-invitrogen | 15710-072 | 培养基添加剂 |
| Gentra Puregene 组织试剂盒 | QIAGEN | 158689 | 基因组DNA分离 |
| MEM，无谷氨酰胺，无酚红 | Gibco | 51200038 | WJ-MSC 注射用配方 |
| 最低必需培养基α | Gibco-invitrogen | 12571063 | WJ-MSC 培养基 |
| Power SYBR Green PCR 主混合液 | Applied Biosystems | 4368577 | 定量实时PCR试剂 |
| QuantStudio 6 Flex 实时PCR系统 | Thermo fisher | 4485694 | 定量实时PCR |
| 台盼蓝 | Gibco | 15250061 | 注射 |
| Vybrant DiD 细胞标记溶液 | invitrogen | V22887 | 干细胞标记溶液 |
| Xenogen IVIS Spectrum 系统 | Perkin Elmer | 124262 | 光学成像设备 |
参考文献
- Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. Paracrine mechanisms of mesenchymal stem cells in tissue repair. Methods in Molecular Biology. 1416, 123-146 (2016).
- Liang, X., Ding, Y., Zhang, Y., Tse, H. F., Lian, Q. Paracrine....
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