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自组装血管化人皮肤等效物的生成

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DOI：

10.3791/62125

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2021年2月12日

 , 
1Departments of Bioengineering, University of California

本文内容

摘要

本实验方案的目的是描述利用简便且易于获取的技术，生成并进行血管化人皮肤等效物的长期培养及其体积分析。在尽可能的情况下，阐述了各步骤的设计原理，以便研究人员能够根据自身研究需求进行定制化调整。

摘要

人皮肤等效物（HSEs）是组织工程构建物，用于模拟人类皮肤的表皮和真皮组分。这些模型已被用于研究皮肤发育、伤口愈合以及移植技术。目前许多HSEs仍缺乏血管系统，并且通常依赖培养后组织学切片进行分析，从而限制了对结构的三维体积评估。本文介绍了一种利用易得材料制备带血管化人皮肤等效物（VHSE）的简便方案，并进一步描述了对这些构建物进行三维成像与定量分析的技术。简言之，VHSE在12孔培养插入式小室中构建，将真皮和表皮细胞接种于大鼠尾部I型胶原凝胶中。真皮层由分散在胶原凝胶中的成纤维细胞和内皮细胞组成；表皮层则由角质形成细胞（皮肤上皮细胞）构成，其在气-液界面处发生分化。重要的是，该方法可根据研究人员的需求进行定制，实验结果展示了使用两种不同类型成纤维细胞构建VHSE的情况：人真皮成纤维细胞（hDF）和人肺成纤维细胞（IMR90s）。VHSE在培养4周和8周时，通过共聚焦显微镜成像，并利用计算软件进行三维体积分析。本文还描述了一种优化的固定、染色、成像和透明化VHSE以实现三维观察的流程。该综合模型及其成像与分析技术可灵活适配各个实验室特定的研究需求，无论研究者是否具备HSE相关经验。

引言

人体皮肤具有多种重要的生物学功能，包括作为免疫/机械屏障、调节体温、参与水分保持以及感觉功能1,2,3,4。从解剖学角度看，皮肤是人体最大的器官，由三层主要结构（表皮、真皮和皮下组织）组成，并包含复杂的基质、血管、腺体以及免疫/神经系统成分，此外还有表皮细胞。表皮本身由四层细胞构成，这些细胞不断更新，以维持皮肤的屏障功能及其他天然结构（如汗腺、皮脂腺和指甲）3。皮肤生理学在免疫功能、伤口愈合、癌症生物学等领域具有重要意义，因此研究人员广泛采用多种模型，从体外单层培养到体内动物模型均有涉及。动物模型能够用于研究皮肤生理的全部复杂性，但常用动物模型（如小鼠）与人类相比存在显著的生理差异5。这些局限性以及动物模型日益增加的成本，促使许多研究人员致力于开发更贴近人类皮肤生理的体外模型1,6。其中一种较简单的模型类型为人表皮等效物（HEE；也称为半厚度皮肤模型），其结构仅包含位于无细胞真皮基质上的人表皮角质形成细胞，但可再现体内所见的表皮分化与分层现象。在此基础上，包含真皮和表皮成分（角质形成细胞和成纤维细胞）的模型通常被称为人皮肤等效物（HSE）、全厚度皮肤模型或类器官皮肤构建物（OSC）。简而言之，这些模型通过将真皮细胞包埋于凝胶基质中，并在其表面接种表皮细胞而构建。随后通过特殊培养基和空气暴露诱导实现表皮分化与分层7。皮肤等效物通常采用自组装技术构建，所用真皮凝胶主要为I型胶原（来源于大鼠尾部或牛皮）1,8，但也有类似模型引入了其他基质成分，如纤维蛋白9,10、成纤维细胞来源基质11,12、尸体来源去表皮膜13,14,15,16、市售凝胶及其他材料1,12,13,17,18,19。目前已有商业化的人工皮肤等效物产品（如先前综述所述1,2），但这些产品主要针对治疗用途开发，难以根据特定科研问题进行定制化调整。

HSE 已被应用于伤口愈合、移植、毒理学以及皮肤疾病/发育的研究中11,12,13,16,8,20,21,22,23。尽管与二维培养相比，三维培养能更全面地模拟人体组织的功能24，但引入更多样化的细胞类型以更准确地反映体内细胞群体，可实现对复杂组织中细胞间协调作用的研究24,25,26。目前大多数 HSE 仅包含真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞27，而体内 皮肤环境还包括许多其他类型的细胞。近期研究已开始纳入更多细胞群体，包括血管中的内皮细胞10,28,29,30,31,32,33,34、皮下组织中的脂肪细胞35,36、神经组分19,21、干细胞27,37,38、免疫细胞10,39,40,41,42，以及其他疾病/癌症特异性模型16, 40, 43,44,45,46,47。其中尤为重要的是血管系统；尽管部分 HSE 包含血管细胞，但总体上仍缺乏贯穿整个真皮层的完整毛细血管结构10,29、长期的体外 稳定性28以及适当的血管密度。此外，HSE 模型通常通过培养后的组织学切片进行评估，这限制了对 HSE 三维结构的分析。三维分析可实现对血管密度的体积评估48,49，以及对表皮厚度和分化程度区域差异的分析。

尽管HSE是常用的类器官模型之一，但在构建这些结构时仍存在诸多技术挑战，包括合适的细胞外基质和细胞密度的确定、培养基配方、正确的气液界面操作程序以及培养后的分析方法。此外，虽然已有HEE和HSE模型的发表方案，但目前尚无整合真皮血管系统并采用三维体积成像而非组织学分析的详细实验流程。本研究提供了一种易于实施的血管化人皮肤等效物（VHSE）培养方案，主要使用商业化细胞系。该方案设计为高度可定制化，便于根据不同细胞类型和研究需求进行直接调整。出于可及性、可获取性和成本考虑，本方案优先采用简单易得的产品和制备技术，而非依赖商业化的成品。此外，本文还描述了简便的三维体积成像与定量分析方法，可用于评估VHSE的三维结构。将该操作流程转化为一种可靠且易于推广的实验方案，可使非专业研究人员也能在个体化医学、血管化组织工程、移植材料开发及药物评价等领域应用这些重要的模型。

方案

1. 三维培养的准备工作

  1. 按照既定方案制备浓度为 8 mg/mL 的大鼠尾胶原原液50,51,52。或者，也可从供应商处购买适当浓度的大鼠尾胶原（参见材料列表）。
    注意：胶原可按 3–10 mg/mL 或更高浓度自行制备或购买50,51,52。本方案中的计算基于 8 mg/mL 的浓度，但可根据研究人员的实际需求进行调整。
  2. 扩增细胞系：在开始构建三维胶原真皮组分（步骤 2）时，需准备好内皮细胞和成纤维细胞；角质形成细胞则需在三维培养的第 7 天准备就绪。构建一个完整的 VHSE 构建体需要 7.5 × 105 个内皮细胞、7.5 × 104 个成纤维细胞和 1.7 × 105 个角质形成细胞（表 1）。
    注意：上述细胞密度适用于 12 孔规格的可透性组织培养插入物或相当规格。细胞密度和培养格式可根据研究人员的需求按比例放大或缩小。需明确说明的是，所列数量的内皮细胞和成纤维细胞可用于接种 1–3 个真皮组分，而每个表皮组分需要 1.7 × 105 个角质形成细胞。
  3. 本方案中所有细胞离心步骤均设置为 300 × g 离心 5 分钟，但对于更脆弱的细胞类型，离心力可适当降低。

2. 三维胶原真皮组分的制备

注意：步骤 2 是一个对时间敏感的操作，必须在一次连续操作中完成。建议在开始真皮组分接种前，对胶原蛋白原液进行质量检查，以确保其能够正常凝胶化并具有均匀性；参见讨论部分的故障排除建议。

  1. 无细胞胶原层的制备与接种
    1. 准备两个1.7 mL带盖微量离心管，一个用于无细胞支架，另一个用于细胞化真皮。本步骤所列用量可制备1 mL浓度为3 mg/mL的胶原（目标胶原浓度），足够制备（3）个12孔规格的VHSE。如需调整，相关计算公式已列出。体积和密度均可根据研究人员需求进行缩放（常见参考数值见表2）。
    2. 向每根离心管中加入100 µL培养级10倍浓缩磷酸盐缓冲液（PBS）（一根管可制备3个VHSE），再加入8.6 µL的1 N NaOH。将带盖离心管置于湿冰上，至少冷却10分钟。
      Cs = 胶原原液浓度
      Vf = 所需胶原终体积
      Ct = 目标胶原浓度
      Vs = 达到目标量（Vf）所需原液胶原体积
      Vpbs = 达到目标胶原浓度（Ct）所需10X PBS体积
      VNaOH = 达到Ct所需1N NaOH体积
      Vmedia = 达到Ct所需培养基、细胞悬液或ddH2O体积
      静态平衡公式，\( V_{pbs} = \frac{V_f}{10} \)，用于计算或过程分析。
      滴定方程：\( V_{\text{NaOH}} = V_{\text{s}} \times (0.023 \, \text{mL}) \)。
      稀释公式：\(V_s = V_f \times \frac{C_t}{C_s}\)，用于化学浓度计算。
      静态平衡方程；V_media = V_f - V_s - (V_pbs) - (V_NaOH)；用于化学体积计算。
    3. 准备1000 µL和250 µL正向置换移液器并放置备用。由于后续步骤对时间敏感，建议预先装好移液器吸头并设定体积（分别为375 µL和125 µL）。此外，另准备一支普通1000 µL移液器，设定为516 µL。
      注：必要时可用普通移液器替代正向置换移液器，但由于胶原黏度高，且该操作对时间和温度敏感，推荐使用正向置换移液器以获得一致的接种效果。若使用普通移液器，应动作缓慢。
    4. 准备培养插件孔板：用无菌镊子将三个12孔规格的培养插件放入无菌12孔组织培养板中，并置于中间列。
    5. 准备好适用于成纤维细胞和内皮细胞类型的冷培养基。
    6. 离心管冷却后，将其中一根管（用于无细胞支架）放置于支架上，使内容物可见；另一根管（用于细胞化真皮）继续保留在冰上。
    7. 从冰箱中取出8 mg/mL胶原原液，并置于湿冰上。
      注：切勿使用冷冻冰块或-20 °C台面冷却器，以免胶原冻结。
    8. 向冷离心管中加入516 µL培养基，立即使用1000 µL正向置换移液器加入375 µL冷胶原。将胶原直接加入溶液中（不要沿管壁加入）。立即移除空移液头，换用已准备好的250 µL正向置换移液器进行混匀。
      1. 快速而轻柔地混匀，避免产生气泡，尽可能不要将移液头从溶液中取出。混匀至溶液颜色均匀，通常需要约5次移液循环或10秒（若使用含酚红的培养基，颜色会变浅且均匀）。混匀时，应从管内不同位置（底部和顶部）吸取液体，以确保均匀混合。
        注：也可使用516 µL细胞培养级水或其他细胞培养级液体，但大多数培养基中的酚红是良好的混合指示剂。建议使用之前用于2D扩增的成纤维细胞或内皮细胞培养基。
    9. 立即向三个12孔培养插件的膜上各分散125 µL无细胞胶原。为确保无细胞胶原凝胶均匀覆盖，可轻轻摇晃培养板；若仍不均匀，可用移液头轻柔地“涂抹”膜表面以均匀分布胶原；避免对膜施加压力。胶凝几乎立即开始，因此应迅速完成此步骤以确保均匀覆盖。
      注：会有少量无细胞胶原剩余。可减少体积，但若制备的胶原悬液少于1 mL，则可能导致混合困难或胶凝不充分。
    10. 立即将12孔板转移至37 °C细胞培养箱中，至少静置20分钟使其胶凝（无细胞胶原可根据需要延长胶凝时间；在此期间可进行步骤2.2）。将胶原悬液从冰上移除并放回4 °C冰箱（胶原在4 °C下最稳定）。
  2. 细胞悬液与接种准备
    注：本实验方案的时间线中，此步骤对应浸没第1天（SD1）
    1. 在无细胞胶原支架胶凝期间，对内皮细胞和成纤维细胞系进行胰酶消化并计数。
    2. 将7.5 × 105个内皮细胞和7.5 × 104个成纤维细胞分别悬浮于258 µL对应培养基中，混合后得到516 µL细胞悬液。使用前将细胞悬液保持在湿冰上。
    3. 准备1000 µL和250 µL正向置换移液器并放置备用。由于后续步骤对时间敏感，建议预先装好移液器吸头并设定体积（分别为375 µL和250 µL）。此外，另准备一支普通1000 µL移液器，设定为516 µL。
  3. 真皮层细胞胶原接种
    1. 胶凝完成后，从培养箱中取出含无细胞胶原的12孔板。
      注：若30分钟后胶原仍未胶凝，则不应继续操作，可能在接种过程中出错或胶原原液存在问题（参见讨论部分的故障排除）。
    2. 将1.7 mL带盖离心管从湿冰上取出（含10x PBS和NaOH），放入支架中使内容物可见。松开或打开所有管盖（细胞悬液、冷离心管）。
    3. 从4 °C冰箱中取出胶原原液（8 mg/mL），置于湿冰上，保持管盖打开。
    4. 将516 µL冷却的细胞悬液加入冷离心管中。使用1000 µL正向置换移液器立即向管内溶液中直接加入375 µL冷胶原溶液。
    5. 将移液器中的胶原全部排出后丢弃正向置换移液头，立即换用250 µL正向置换移液器混匀胶原溶液。
    6. 混匀方式同前（快速而轻柔，避免产生气泡），尽可能不要将移液头从凝胶中取出。混匀至溶液均匀（约5次移液循环或10秒）。混匀时应从管内不同位置（底部和顶部）吸取液体，以确保均匀混合。
    7. 混匀后，立即向三个12孔培养插件的无细胞胶原支架上各转移250 µL细胞胶原溶液。为确保无细胞胶原支架均匀覆盖，可轻轻摇晃培养板，或使用正向置换移液器轻柔移动新接种的细胞胶原，避免扰动无细胞层。
    8. 立即将12孔板转移至37 °C细胞培养箱中，至少静置30分钟使其胶凝。使用后立即将胶原放回4 °C冰箱。
    9. 30分钟胶凝后，轻轻倾斜培养板以评估胶凝情况，确保胶原已完全固化。
    10. 向插件的上室和下室分别加入500 µL和1000 µL混合培养基（一半内皮细胞培养基，一半成纤维细胞维持培养基）（先加顶部，再加底部，以防止静水压将胶原推起）。缓慢沿孔壁加入培养基，避免直接滴加在胶原凝胶上，以减少对胶原的扰动。
      1. 确保胶原凝胶完全浸没，必要时可补充更多培养基。将培养板放入细胞培养箱中过夜培养。此阶段培养基含10% FBS；使用各细胞系的常规维持培养基（时间线和示意图见图1，A）。
        注：在整个VHSE培养过程中，培养基可根据特定细胞类型进行调整；可能需要一定优化。
  4. 浸没第2天（SD2）换液
    1. 将VHSE孔中的10% FBS培养基更换为含5% FBS（一半成纤维细胞、一半内皮细胞维持培养基）并补充100 µg/mL L-抗坏血酸的混合培养基。沿孔壁向培养插件的上室加入500 µL（再次注意沿侧壁缓慢加入，以减少对胶原的扰动），下室加入1000 µL。
    2. 此后每2天更换一次培养基（SD4和SD6），直至浸没第7天（SD7）。
    3. 使用手动移液器从孔中移除培养基。可使用抽吸装置，但可能导致构建物损伤或破坏。
      注：L-抗坏血酸必须每2–3天新鲜配制（其在溶液中会氧化生成过氧化氢，从而诱导氧化应激并最终导致细胞损伤53）。因此，由于L-抗坏血酸的存在，从SD2至VHSE培养结束期间必须每2–3天更换一次培养基。最简便的方法是预先配制一批培养基，每次换液时取一份并加入新鲜配制的L-抗坏血酸。使用细胞培养级水或培养基作为溶剂，新鲜配制100 mg/mL的L-抗坏血酸。L-抗坏血酸可促进成纤维细胞以适当速率合成胶原并增强胶原稳定性54,55,56；同时可降低内皮通透性并维持血管壁完整性56,57，并有助于表皮屏障的形成6,58。

3. 表皮组分的接种与分层诱导

  1. 浸没培养第7天（SD7）：接种角质形成细胞
    注意：在SD7接种角质形成细胞，以在VHSE上建立表皮层。此时间点可根据研究人员的具体需求进行调整。无角质形成细胞的浸没培养时间不应超过9天，因为过长的浸没培养常导致真皮层收缩加剧。若在SD7前已出现收缩，建议将浸没期缩短至5天，并在SD5接种表皮层。根据具体实验需求优化浸没培养时间（参见讨论部分的故障排除）。
    1. 在胰蛋白酶消化并接种至VHSE前，将角质形成细胞（N/TERT-120,59 或其他合适细胞）培养至其汇合度上限。对于N/TERT-1细胞，2D培养时汇合度不应显著超过30%，以防止角质形成细胞过早分化59。对于其他合适细胞系（如原代人表皮角质形成细胞），通常采用75–80%的汇合度上限60。
    2. 胰蛋白酶消化后，计数并将510,000个细胞重悬于600 µL含5% FBS的HSE分化培养基中（表1）。
      注意：600 µL中含510,000个细胞，按每构建体接种200 µL，可得每构建体170,000个细胞（共3个VHSE）。
    3. 使用手动移液器，吸取并弃去每个构建体孔中上下室的现有培养基。务必尽可能吸除全部培养基。通过将移液器吸头轻轻置于培养插件膜下方，轻敲插件使其暂时移位，以吸取可能因表面张力滞留在可渗透膜正下方的培养基。操作完成后，确保插件平整地放回孔中。可使用抽吸装置，但可能导致构建体损伤或破坏。
    4. 向每孔的下室加入1 mL含5% FBS的HSE培养基，然后向每孔的上室加入200 µL细胞悬液。直接接种于真皮构建体表面。将角质形成细胞在培养箱中静置2小时使其贴附。
    5. 接种角质形成细胞2小时后，小心向每个构建体孔的上室加入300 µL含5% FBS的HSE培养基；缓慢沿培养插件侧壁移液，避免扰动尚未牢固黏附于下方胶原凝胶的角质形成细胞。
    6. 加完培养基后，将构建体放回培养箱继续培养。
  2. 浸没培养第8/9天（SD8或SD9）
    1. 配制含1% FBS和100 µg/mL L-抗坏血酸的HSE培养基。
    2. 使用手动移液器吸除上下室中的培养基。
    3. 先向每个上室加入500 µL培养基，再向每个下室加入1 mL培养基。（此步骤可在SD8或SD9进行）
  3. 浸没培养第9/10天（SD9或SD10，应为步骤3.2的次日）
    1. 配制无血清HSE分化培养基，含100 µg/mL L-抗坏血酸。
    2. 使用手动移液器吸除上下室中的培养基。
    3. 向上室加入500 µL，向下室加入1 mL培养基。
  4. 气液界面第1天（ALI1）
    注意：ALI操作在步骤3.3的次日进行。
    1. 仅移除上室的废培养基，使各构建体升至气液界面（ALI）。使用手动移液器尽可能接近表皮层吸取，避免接触或损伤组织。
    2. 轻微倾斜培养板，从不同角度收集残留培养基，尽可能彻底移除。向培养板周围孔中加入约2 mL无菌水，以维持一致的湿度；在整个培养过程中保持这些孔中有水。
    3. 数小时后检查培养板，确认角质形成细胞仍处于气液界面。若上室仍有培养基，应将其移除。记录每次从各VHSE孔中移除的培养基体积（初始上下室总体积1500 µL减去移除量，可作为ALI阶段换液量的良好起点）。
      注意：不同VHSE达到气液界面所需的培养基体积不一定相同；通常若VHSE同时接种，则所需培养基体积相近，但并非绝对。应根据需要调整体积，以维持ALI状态，同时确保培养基液面不过低，防止VHSE干燥。更安全的做法是谨慎操作，每日少量移除培养基，直至在气液界面维持与组织水合之间达到平衡。
  5. 气液界面第2天（ALI2）
    1. 从此步骤起，仅使用含100 µg/mL L-抗坏血酸的无血清HSE培养基。在ALI第2天（ALI2）更换培养基。若上室有残留培养基，将其移除并计入此前记录的移除总量中。根据前一步骤中的公式计算所需培养基体积。例如：若从上室移除了200 µL培养基，则应加入1300 µL以建立ALI（因1500 µL - 200 µL = 1300 µL）。
    2. 根据计算所得体积，向下室每孔加入相应量培养基，然后将培养板放回细胞培养箱。每日记录所用培养基体积。当使用推荐量的胶原在12孔培养插件中构建时，ALI阶段的典型体积范围为750 µL至1300 µL。通常，随着培养成熟，所需体积逐渐减少，并在ALI第2–3周趋于稳定。具体体积可能因培养条件而异，需根据实验情况进行优化（如3.4.2–4.1所述）。

4. 血管化人皮肤等效物的常规维护

  1. 从气液界面培养第3天（ALI3）至培养结束：每隔2-3天更换下室培养基，使用含100 µg/mL L-抗坏血酸的无血清HSE培养基。继续按照步骤3.5.2所述方法调整并记录下室所需的培养基液面高度。
  2. 由于表皮表面必须始终暴露于空气中，需每日检查并调整培养基液面，直至建立稳定的气液界面水平。表皮层应呈现水合状态而非干燥，但不应有培养基积聚在构建物表面。采用8周气液界面培养可获得最稳定的形态学特征和表达水平；然而，根据具体应用需求，4至12周的培养时间也可能适用。不同细胞类型及培养条件下的培养时长可能需要进一步优化。
    注意：建议在周一、周三、周五更换培养基。VHSE在周末仍可保持良好状态，但应在周一尽早、周五较晚时更换培养基。在完全完成步骤1-4后，VHSE的构建即已完成。本方案中步骤5至结尾部分为可选的后续处理与成像技术，已针对此类3D构建物进行了优化。

5. 三维结构的固定与通透处理

注意：步骤 5 已针对本 3D 构建体特有的成像技术进行了优化，相关技术在本方案其余部分中详述。以下步骤对于生成 VHSE 并非必需。

  1. 固定/通透
    1. 在培养周期结束时，小心移除每个孔中上室和下室的所有培养基。
      注意：表皮层可能较为脆弱，操作时应轻柔，避免使用剧烈的移液操作扰动表皮。
    2. 将4%多聚甲醛（PFA）溶于PBS（pH 6.9）中，先沿上室壁加入（不要直接加在构建物上），再加入下室，以对每个构建物进行预固定。每室加入1 mL，室温孵育5分钟。
      注意：PFA具有危险性，操作时应谨慎，并佩戴适当个人防护装备（PPE），包括眼部防护。
    3. 5分钟后移除4% PFA溶液，按照前一步骤所述，向上室和下室加入含0.5% Triton X-100的4% PFA溶液。室温孵育1小时；从此时起，VHSE构建物不再需要无菌环境。
    4. 1小时后，小心移除通透/固定液，用1×PBS对样本洗涤3次。
    5. 将样本置于PBS中，于4 °C冰箱保存，或立即进行染色。如需保存，用塑料封口膜包裹培养皿，再包裹铝箔，以减少蒸发和光照暴露。
      注意：暂停点——在固定和通透完成后，本步骤可暂停，因为若按步骤5.1.5所述方法处理，样本可在数周内保持稳定。或者，也可在完成步骤5后立即进行染色（见步骤6）。

6. 三维结构的免疫荧光染色

  1. 构建物准备
    注意：VHSE 在从培养插件的多孔膜上分离后染色效果良好；分离膜也有利于无遮挡成像，并可减少染色所需的液体体积。
    1. 为进行免疫荧光染色，将插件倒置并放置在培养板的对应孔上方（若 VHSE 脱落，会落入含 PBS 的孔中）（补充图 1A）。
    2. 用一只手固定插件，使其稳定在孔上方，同时使用精细尖头镊子和/或精密刀片沿插件膜约一半周长进行切割。操作时应尽量贴近塑料外壳，手法轻柔，以避免损伤 VHSE 构建物。
    3. 使用精细尖头镊子夹住已切开的膜边缘，轻柔地将多孔膜连同 VHSE 构建物一起从插件上剥离。此步骤需极其小心且缓慢进行，以防破坏 VHSE 构建物结构。若 VHSE 构建物易于分离，则应自然落入下方孔中；若其卡在腔室侧壁，可用精细尖头镊子或小刮勺将其移入孔中。操作时需特别注意表皮层，因其通常较为脆弱（补充图 1A）。
      注意：有时膜难以完整剥离或会碎裂，此时可使用工具小心地将膜与 VHSE 构建物分开。必要时可通过浸入 PBS 防止 VHSE 在此过程中干燥。
    4. 一旦 VHSE 落入孔中，弃去残留的插件膜碎片，并将培养插件外壳保留在各孔中，以便在染色过程中保持 VHSE 处于浸没状态。
  2. 染色
    注意：由于 VHSE 可能较为脆弱，染色及相关操作、洗涤过程应尽可能轻柔。若表皮部分脱落，可将碎片单独染色；表皮上层本身脆弱且存在自然脱屑现象4，但为保证分析质量，应尽可能维持其完整性。
    1. 每孔构建物用 700 µL 封闭缓冲液配制所需的一抗染色液（通常所有一抗可置于同一染色液中，但新抗体需先行验证）。700 µL 适用于 12 孔板规格，其他培养体系可相应调整。一抗与二抗推荐浓度及封闭缓冲液配方见 表 3（可能需要优化）。
    2. 使用手动移液器移除孔中 PBS，注意避免直接接触 VHSE（因 VHSE 漂浮，不建议使用真空抽吸）。
    3. 向各孔加入一抗染色液，并将培养插件外壳放入孔中以保持 VHSE 浸没于液体中（补充图 1B）。用保鲜膜包裹培养板，再用铝箔包裹，在 4 °C 冰箱中避光孵育 48 小时，不振荡、不摇动（摇动可能损伤 VHSE 构建物）。
    4. 48 小时后，用 700 µL 封闭缓冲液（每孔）配制二抗及化学染料。
    5. 移除培养插件外壳及一抗染色液，用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，然后加入二抗染色液。将培养插件外壳重新放入孔中以保持 VHSE 构建物浸没（补充图 1B）。在 4 °C 冰箱中避光孵育 48 小时，不振荡、不摇动。
    6. 48 小时孵育后，用手动移液器移除染色液，并用 PBS 轻柔洗涤 3 次；避免将液体直接冲至 VHSE 上，因其可能脆弱。用过量 PBS 重新水化，并将培养插件外壳放回孔中，以保持 VHSE 浸没和水合状态（储存时用保鲜膜和铝箔包裹，以减少蒸发和光照）。
  3. 透明化处理（可选，终末步骤）
    注意：透明化处理为成像可选步骤。若进行该步骤，应在完成所有染色和成像后实施，因透明化会阻止进一步染色，可能影响荧光染料性能，并可能破坏 VHSE 结构。现有多种组织透明化方法49,61,62，可根据具体项目优化。下述水杨酸甲酯透明化法对 VHSE 简单有效。该透明化过程必须使用玻璃容器，移液枪头必须为玻璃或聚丙烯材质（聚苯乙烯接触水杨酸甲酯会溶解）。所有操作应在通风良好区域或通风橱中进行。
    1. 将 100% 甲醇加入小型浅口玻璃容器中（玻璃培养皿效果良好）。使用能容纳构建物的最小容器（以减少试剂浪费）。
    2. 用镊子或刮勺将构建物从培养板中取出（补充图 1C），放入盛有甲醇的容器中。若构建物未完全浸没，可补充甲醇。
    3. 在甲醇中对 VHSE 构建物进行脱水处理，共 3 次，每次 10 分钟；每次更换新鲜甲醇，并在最后一次处理后立即移除甲醇。在此过程中，构建物可能逐渐变浑浊并轻微收缩。
      注意：上述时间与次数已优化，但甲醇及后续水杨酸甲酯处理步骤可能需根据具体培养体系和染色情况调整。
    4. 移除甲醇后立即加入水杨酸甲酯，对 VHSE 进行 5 次、每次 5 分钟的浸洗。每次更换新鲜试剂，并将构建物保留在第五次浸洗液中储存。在此过程中，构建物将逐渐变得透明。
    5. 对构建物进行成像或于 4 °C 储存。透明化后应尽快完成所有成像，因荧光染料在水杨酸甲酯中数天内可能降解。透明化会使构建物变脆，长期储存虽不推荐，但需定期检查以确保水杨酸甲酯量充足。

7. 三维结构的共聚焦成像

注意：通过组织培养塑料成像无法获得与通过盖玻片玻璃成像相同的图像质量，本方法描述了定制玻璃底孔的制备，以防止共聚焦成像过程中样本干燥。通常，该方法足以支持至少3小时的成像。

  1. 成像前两天：制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）
    1. 制备PDMS48,63,64，建议浓度为[9:1]，即基础剂：交联剂。总共制备30 g PDMS：27 g基础组分和3 g交联剂。将任意洁净的混合容器置于天平上并去皮归零，先加入基础剂（27 g），再加入交联剂（3 g），使总质量达到30 g。务必先加基础剂，后加交联剂。
    2. 剧烈搅拌溶液至少4分钟，此过程会产生小气泡。充分混合后，将PDMS倒入100 mm培养皿或类似的耐热平底容器中。
    3. 将PDMS置于真空腔中脱气，直至混合产生的气泡完全消失且PDMS变得透明。缓慢释放真空，小心取出PDMS。将培养皿放入烘箱中过夜固化（50–60 °C）；确保培养皿放置平稳，以保证PDMS均匀固化。
      注意：固化后PDMS应透明，表面应光滑且不粘手（若发粘可能表明混合不充分）。
  2. 成像前一天：PDMS小室的制备
    1. 使用钢制打孔器或手持精密刀具，从7.1步骤中制备的PDMS片材上打孔或切割出一个圆形小室。小室直径应与VHSE构建体大小相近。在圆形小室周围切割出方形补片，形成单个PDMS小室。所制备的30 g PDMS应至少可制成四个定制小室。
      注意：PDMS小室尺寸必须接近VHSE构建体大小，以限制成像过程中样本的移动。可一次性制备多个小室，并长期存放于洁净容器中。
    2. 取一片与PDMS小室尺寸相近的玻璃盖玻片，用移液枪头在PDMS底部（即与培养皿接触的光滑面）均匀涂抹氰基丙烯酸酯胶水（如瞬间胶）。将PDMS小室居中压合在盖玻片上，确保打孔区域留出清晰的观察窗口（注意胶水不要覆盖观察窗口）。
      注意：如有条件，可采用等离子体键合将PDMS与盖玻片连接，作为替代方法65,66,67。
    3. 胶水需静置数小时或过夜干燥后方可使用。这些小室可重复使用，直至因正常使用磨损而损坏。
      注意：不建议在用于成像的胶合PDMS小室中对样本进行染色。这些小室可维持数小时不漏液，但在长时间染色过程中可能发生泄漏。
  3. VHSE成像
    注意：若对未透明化样本成像，使用PBS作为成像溶液；若对透明化样本成像，则使用水杨酸甲酯（或所选透明化溶液）作为成像溶液。
    1. 向PDMS小室中加入数滴成像溶液，检查是否漏液（若漏液，可用一点/一抹氰基丙烯酸酯瞬间胶修补，或更换小室）。
    2. 在将VHSE加入PDMS小室时，保持成像溶液在小室内。使用刮勺或精细镊子（补充图1C），从12孔板中取出构建体，并将其放置于PDMS小室的玻璃盖玻片上。将构建体以感兴趣的方向朝向物镜放置。例如，使用倒置显微镜成像表皮时，应使表皮朝下，面向玻璃。
      1. 另：若使用正置显微镜，则使表皮朝上。以下成像步骤以倒置显微镜为例描述，但可轻松适配正置显微镜。
        注意：操作VHSE时需谨慎，避免损伤。转移时应在孔板上方进行，以防构建体掉落。弯曲的平头刮勺是转移构建体最简便的工具（补充图1C）。
    3. 确保样本在小室内平放，表皮或真皮部分无折叠。若发生折叠，可用镊子或刮勺轻轻调整样本；加入适量成像溶液使VHSE暂时漂浮，有助于其展平。折叠或皱褶可通过肉眼或显微镜观察到。
    4. 用成像溶液填充小室，加入足够液体以保持样本湿润即可；液体过多会使样本漂浮，导致成像过程中移动。构建体应紧贴玻璃观察窗；通过倾斜PDMS小室测试是否移动。若存在移动，减少液体量；逐滴加减液体直至移动停止。
    5. 在小室上方覆盖一片玻璃载玻片，以减少成像过程中的蒸发（补充图1D）。对于长时间成像，需频繁检查样本，确保液体量适当。如有条件，可使用加湿腔进行成像（但通常非必需）。
    6. 将样本置于显微镜载物台上，透过玻璃盖玻片窗口进行成像（补充图1D）。该技术可支持至少3小时的连续共聚焦成像，但需定期检查样本湿润度，并根据需要补充成像溶液。
      注意：若样本已透明化，水杨酸甲酯会随时间推移降解胶水。可在每次成像之间重新涂抹PDMS粘合胶；或定期将样本转移至新小室。若使用等离子体键合的小室，则无此问题。
    7. 成像结束后，在小室内尽可能多地加入成像液体使样本漂浮。使用刮勺或精细镊子将样本转移回储存孔中。转移操作应在孔板上方进行，以防样本掉落。
    8. 每个PDMS小室及顶部玻璃盖玻片均可重复使用，直至破损。每次成像前需清洁底部玻璃，包括小室内外表面。重复使用前，务必检查是否漏液，并根据需要以胶水修补。
    9. 样本储存方法见步骤6.3.6；每隔数月添加PBS以维持保存状态。若样本已透明化，则应使用水杨酸甲酯在玻璃容器中保存，并定期检查液位。透明化样本可能迅速降解（数天内），应尽快成像。

结果

本文介绍了一种利用端粒酶逆转录酶（TERT）永生化角质形成细胞（N/TERT-120,59）、成人人类真皮成纤维细胞（hDF）和人类微血管内皮细胞（HMEC-1）在体外构建血管化人皮肤等效物（VHSE）的实验方案（图1）。此外，本方案还通过使用常见的肺成纤维细胞系（IMR90）替代hDF，展示了该方法在VHSE构建及其稳定性方面的可定制性。VHSE的构建过程由步骤1至4完成，而步骤5至7为可选的终点处理与成像技术，已针对此类VHSE进行了优化。需要注意的是，VHSE可根据具体研究问题进行相应处理，步骤5至7并非构建该结构所必需。为展示一种体积分析方法，已完成了三维成像、分析及三维重建。这些体积结构制备与成像方案可在微观和宏观水平上保持VHSE的结构完整性，从而实现全面的三维分析。

对表皮和真皮的表征显示，VHSE 构建体中的人类皮肤具有相应的免疫荧光标志物（图 2、3）。细胞角蛋白 10（CK10）是一种早期分化角质形成细胞标志物，通常标记皮肤等效物中的所有颗粒层以上各层18,30,68（图 2）。兜甲蛋白（involucrin）和丝聚合蛋白（filaggrin）是角质形成细胞的晚期分化标志物，标记皮肤等效物中最表层的颗粒层以上细胞层12,30,68,69（图 2）。使用远红荧光核染料（见材料列表）标记表皮和真皮中的细胞核，Col IV 标记真皮中的血管结构（图 2、图 3、图 4）。在 HSE 培养模型中，表皮基底膜（BM）组分并不总是能够正确表达15,16；本实验方案中，BM 的 Col IV 染色结果并不稳定。针对 BM 组分与结构的研究，可通过进一步优化培养基、细胞条件及成像参数获得改善14。

尽管通过VHSE培养物整体进行共聚焦成像通常能够获得高分辨率图像，足以用于表皮和真皮的计算分析，但本文所述的透明化方法可实现更深层组织的成像。透明化可提高共聚焦激光的穿透深度，对透明化后的样本，有效成像深度可超过1 mm（未透明化样本约为250 µm）。所描述的透明化技术（甲醇脱水和水杨酸甲酯处理）可充分匹配VHSE样本组织内部的折射率61。对VHSE进行透明化处理后，无需任何操作（例如重新定位构建物以分别成像真皮和表皮），即可直接对整个构建物进行完整成像，（图3）。

体积图像可用于生成三维重建，以绘制每个构建体中的血管网络（图4）。简言之，采集多个VHSE亚体积区域从真皮到表皮方向的共聚焦图像集，以检测IV型胶原染色（标记血管壁）和细胞核（由远红荧光核染料标记）。将图像堆栈载入计算软件（见材料列表），并使用基于以下文献48,70,71,72,73,74,75的自定义算法进行三维重建与定量分析，方法如前所述48。该算法根据IV型胶原染色自动分割血管成分。体积分割结果被传递至基于快速行进法的骨架化算法75,76,77。骨架化可确定每条IV型胶原标记血管的精确中心，所得数据可用于计算血管直径以及血管体积分数（图4）。若无法获得激光扫描显微镜，宽场荧光显微镜是一种可行的替代方案；血管网络和表皮均可通过宽场荧光显微镜成像（补充图2）。使用宽场成像对VHSE进行三维定量分析是可行的，尽管由于离焦光信号的存在，可能需要更多的图像滤波和去卷积处理。

3D皮肤培养过程示意图，显示细胞接种、分层诱导及培养后步骤。
图1：血管化人皮肤等效物生成的示意图时间线。A) 显示VHSE模型的进展过程：1）真皮组分接种，2）将角质形成细胞接种至真皮组分上，3）通过气液界面诱导上皮分层并维持培养。在培养终点可进行培养后处理和容积成像。B) 培养8周终点时，hDF VHSE在培养插件中的宏观结构相机图像。VHSE出现不同程度的收缩属于正常现象；如本方案所述，可通过优化减少收缩。（1 和 2）收缩较少的样本。（3 和 4）尽管收缩较明显，仍可获得结构正常的皮肤组织。请点击此处查看该图的放大版本。

皮肤蛋白的免疫荧光显微镜图像，示意图：兜甲蛋白、丝聚蛋白、角蛋白10。
图 2：通过免疫荧光标志物对表皮进行表征。 所有图像均通过共聚焦显微镜在体外皮肤等效物（VHSE）培养至第8周时间点时采集。相应的染色方法在方案步骤6中描述。在hDF VHSEs（左列）和IMR90 VHSEs（右列）中均可见正常的上皮标志物表达。兜甲蛋白（Involucrin）和丝聚蛋白（Filaggrin）是角质形成细胞晚期分化的标志物，表明两种VHSE类型的表皮均已完全分层。角蛋白10（Cytokeratin 10）是早期分化标志物，用于识别VHSE中的棘层及以上表皮层。细胞核在正交视图中以黄色显示。表面观与正交最大投影图像通过计算软件生成；图像经过单独缩放处理，并采用背景扣除与中值滤波以提高清晰度。比例尺为100 µm。（一抗与二抗信息以及实验室自配封闭缓冲液配方见表3）。请点击此处查看该图的高清版本。

透明化处理对组织可视化的影响；显微图像，三维重建；透明度显著提高
图3：未透明化与透明化后VHSE的对比。该VHSE由IMR90细胞生成，并在培养4周时间点通过共聚焦显微镜成像。胶原蛋白IV以青色显示；细胞核以品红色显示；在透明化后的三维重建中，品红色代表VHSE表皮层中细胞核的集中分布。未透明化的VHSE图像展示了在较厚VHSE结构中激光衰减的典型情况；经过透明化处理（甲醇和水杨酸甲酯）后，可从结构的真皮侧实现对整个构建物的成像，且激光衰减极小或无衰减。为减少过饱和现象，透明化VHSE的成像参数（包括激光线、增益和针孔）已调低。透明化与成像操作均按方案中第6步和第7步所述完成。正交最大投影图像与三维重建由计算软件完成，三维重建基于透明化后构建物的图像生成。所有图像均经过独立缩放，并采用背景扣除与中值滤波以提高清晰度。比例尺为100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本

4周和8周血管分析的三维骨架化示意图及量化图。
图4：VHSE内血管系统的三维分析。 通过共聚焦显微镜获取的体积图像，结合计算图像分析方法，可在培养终点对血管参数进行量化。从VHSE子体积中检测胶原蛋白IV染色信号（青色）以标记血管内皮壁，并根据胶原蛋白IV的位置实现血管结构的分割；分割数据随后进行骨架化处理，并确定每条血管的中心线（品红色）。图中展示了4周和8周IMR90 VHSE样本（未透明化）的三维骨架化示例。利用一组IMR90 VHSE实验的数据，计算了每个构建物中四个子体积（每个在z轴方向为250 µm）的血管直径和血管分数，数据先按每个VHSE取平均值，再按培养时间点进一步平均。结果显示，在4周和8周的培养期间，血管网络保持稳态，其血管直径与体内人皮肤相当78，血管分数也处于与体内人皮肤相近的数量级79（已有研究表明胶原构建物中的血管分数具有可调控性48，未来还可进一步优化以提高该数值）。数据以均值±标准误（S.E.M）表示；每个时间点n = 3。请点击此处查看该图的放大版本。

培养基成分
人真皮成纤维细胞系 (hDF)DMEM HG
5% 胎牛血清 (FBS)
1% 青霉素/链霉素 (P/S)
IMR90 成纤维细胞系DMEM/HAM’S F12 50:50
10% FBS
1% P/S
HMEC-1 内皮细胞系MCDB131 基础培养基
10% FBS
1% P/S
L-谷氨酰胺 [10 mM]
表皮生长因子 (EGF) [10 ng/mL]
氢化可的松 [10 µg/mL]
N/TERT-1 角质形成细胞系K-SFM 培养基基础液
1% P/S
牛垂体提取物 (BPE) [25 µg/mL]，来自 K-SFM 补充剂试剂盒
表皮生长因子 (EGF) [0.2 ng/mL]，来自 K-SFM 补充剂试剂盒
CaCl₂ [0.3 mM]
人皮肤等效物 (HSE) 分化培养基3:1 DMEM: Ham’s F12
1% P/S
0.5 µM 氢化可的松
0.5 µM 异丙肾上腺素
0.5 µg/mL 胰岛素

表1：培养基配方。 提供了人真皮成纤维细胞、IMR90成纤维细胞、HMEC-1细胞以及N/TERT-1角质形成细胞的二维培养条件下的培养基配方。这些配方用于在构建病毒性人皮肤等效物（VHSE）前扩增细胞系。人皮肤等效物（HSE）分化培养基用于生成VHSE；此处给出基础配方，在浸没培养和分层诱导阶段的不同时期，应按照方案步骤3所述逐步减少添加FBS的量。本HSE配方基于以下文献来源11,80。

胶原蛋白储备液浓度 (Cs) :8mg/mL
所需终体积 (Vf):1mL
用于中和的 NaOH 调整量*:1X
*每批胶原蛋白均需测试以确定将 pH 调至 7–7.4 所需的 NaOH 用量
所需胶原蛋白浓度 (mg/mL)
2345
10X PBS (Vpbs)0.10.10.10.1
胶原蛋白储备液 (Vs)0.250.3750.50.625
1N NaOH (VNaOH)0.005750.0086250.01150.014375
培养基 (Vmedia)0.644250.5163750.38850.260625

表2：胶原蛋白计算参考表。该参考表基于8 mg/mL的胶原蛋白母液浓度和1 mL的终体积，列出了常用的胶原蛋白终浓度及其所需体积（单位均为mL）。这些数值的计算公式见实验方案第2.2步。每次使用胶原蛋白母液前必须检测其pH值；必要时应加入NaOH调节pH至7–7.4（在加入PBS、NaOH、胶原蛋白母液和培养基后）。本实验方案采用3 mg/mL的胶原蛋白浓度，已针对VHSE细胞系进行优化；对于不同细胞系或预期实验结果，可能需要调整胶原蛋白浓度48。

一抗来源浓度用途
Filaggrin (AKH1) 小鼠单克隆 IgGSanta Cruz;
sc-66192 (200 µg/mL)		[1:250]晚期分化标志物15
Involucrin 兔多克隆 IgGProteintech;
55328-1-AP (30 µg/150 µL)		[1:250]晚期终末分化标志物15
Cytokeratin 10 (DE-K10) 小鼠 IgG，上清液Santa Cruz;
sc-52318		[1:350]表皮棘层上部标志物14,36,59
Collagen IV 兔多克隆抗体Proteintech;
55131-1-AP		[1:500]内皮血管壁标志物67
DRAQ 7Cell Signaling; 7406 (0.3 mM)[1:250]核标志物
二抗来源浓度用途
山羊抗兔 IgG DyLight™ 488 标记Invitrogen; 35552 (1 mg/mL)[1:500]Collagen IV 二抗
抗兔 IgG (H&L) (GOAT) 抗体，DyLight™ 549 标记Rockland Immunochemicals; 611-142-002[1:500]Involucrin 二抗
山羊抗小鼠 IgG (H&L), DyLight™ 488Thermo Scientific; 35502 (1 mg/mL)[1:500]Filaggrin 或 Cytokeratin 10 二抗
封闭缓冲液 (500 mL)
试剂用量
ddH2O450 mL
10 x PBS50 mL
牛血清白蛋白 (BSA)5 g
Tween 200.5 mL
冷溶性鱼明胶1 g
叠氮化钠 (10% 叠氮化钠溶于 diH2O)5 mL (终浓度 0.1 %)

表3：一抗和二抗以及封闭缓冲液配方。 所列抗体和化学染料用于图2、图3、图4中所示的染色。染色按照第6步实验方案使用此处列出的封闭缓冲液配方完成。根据所选的培养技术和细胞系，可能需要对染色浓度和孵育时间进行一些优化。

补充表1：缩略语列表。为方便读者查阅，提供以下缩略语列表。请点击此处下载该表格。

补充 图1：VHSE 操作技术辅助示意图。VHSE 的操作具有挑战性，尤其是在固定、处理和染色过程中。A-D 对应步骤 5-7 中的操作说明。A 展示了从培养插件中取出多孔膜的技术操作，以确保染色充分。B 展示了在染色和储存过程中如何保持每个 VHSE 完全浸没。C 展示了将构建物转移至 PDMS 成像孔的最安全且最简便的方法。D 显示一个 VHSE 置于 PDMS 成像孔中的状态：PDMS 孔底部粘附于载玻片上，形成成像窗口；上方覆盖另一块载玻片，以在长时间成像过程中维持湿度。请点击此处下载该文件。

补充 图2：标准宽场荧光显微镜可用于评估血管化皮肤等效物（VHSEs）。在无法获得激光扫描显微镜的情况下，宽场成像可用于常规的容积成像评估。例如，从顶端和基底外侧两个方面对VHSEs进行成像，并以正面视图和正交（Ortho.）最大投影方式展示。（上图）使用包壳蛋白（involucrin）和细胞核作为标记物对表皮进行成像。（下图）使用IV型胶原作为标记物对真皮血管系统进行成像。图像经过背景扣除以提高清晰度。由于来自非焦平面的光线，正交视图中可见“条纹”或“光晕”伪影。宽场成像可用于定量分析，但可能需要更多的图像处理步骤。请点击此处下载该文件。

讨论

本方案展示了一种简单且可重复的血管类器官（VHSE）生成及其三维分析方法。该方法仅依赖少量专业技术和设备，因此适用于各类实验室。此外，通过有限的方案调整即可替换细胞类型，使研究人员能够根据自身需求灵活优化本实验流程。

正确的胶原蛋白凝胶化是建立皮肤培养过程中具有挑战性的步骤。尤其是使用未经纯化的粗制制剂时，痕量污染物可能会影响凝胶化过程。为确保实验的一致性，用于生成 VHSE 的实验组应使用同一批次的胶原蛋白储备液进行。此外，理想的凝胶化应在 pH 7–7.4 条件下进行，而痕量污染物可能导致 pH 值偏移。在使用任何胶原蛋白储备液之前，应先配制一份无细胞的凝胶样品，达到目标浓度后，在凝胶化前测量其 pH 值。在开始真皮组分接种前完成此项胶原蛋白质量检查，可提前发现凝胶化是否正常以及胶原蛋白是否均一等问题，避免在完整实验体系建立后出现问题。可将少量胶原蛋白直接滴加到能够检测全 pH 范围的 pH 试纸上，而非直接接种于培养插件上，以确认 pH 值处于 7–7.4 范围内。凝胶化效果可通过将胶原蛋白凝胶溶液滴加到盖玻片或组织培养用塑料孔板上进行评估（推荐使用孔板，以模拟培养插件的受限侧壁环境）。经过凝胶化时间后，胶原蛋白应呈固态，即当孔板倾斜时不会流动。在相差显微镜下观察，胶原蛋白应呈现均一且透明的外观。接种过程中偶尔出现的小气泡属于正常现象，但在透明凝胶内部若出现大块不透明的无定形团块，则提示存在问题，可能源于混合不充分、pH 值不当，和/或在混合过程中未能保持胶原蛋白处于低温状态。

细胞接种量和培养基可进行调整。在上述方案中，包埋细胞的数量已针对12孔插入式培养板进行了优化，每毫升胶原中包含7.5 × 104个成纤维细胞和7.5 × 105个内皮细胞，同时在真皮结构顶部接种1.7 × 105个角质形成细胞。该血管化人皮肤等效物（VHSE）方案中的细胞密度是基于前期研究以及既往关于不同胶原浓度下三维血管网络形成48和人皮肤等效物（HSE）构建22,80,81的研究结果优化确定的。在类似系统中，已发表的内皮细胞密度为1.0 × 106个细胞/mL胶原48；成纤维细胞浓度通常介于0.4 × 105个细胞/mL胶原22,28,82至1 × 105个细胞/mL胶原8,58,83,84,85之间；角质形成细胞浓度范围则为0.5 × 105 [个细胞/cm2]80至1 × 105 [个细胞/cm2]8。可根据特定细胞类型和研究问题进一步优化细胞密度。含有收缩性细胞（如成纤维细胞）的三维培养可能发生收缩，导致细胞活力下降甚至培养失败86,87。应开展预实验以检测真皮区室的收缩情况（该现象可能由更多真皮细胞、更强收缩活性的真皮细胞、更长的浸没培养时间或更软的基质引起），并评估表皮表面覆盖程度。此外，若出现明显的真皮收缩或需要不同的角质形成细胞覆盖速率，也可对浸没培养天数及血清浓度梯度降低速率进行个性化调整。例如，若在真皮浸没培养期间或角质形成细胞形成表面单层过程中观察到收缩现象，可加快血清梯度降低过程，并尽早将VHSE提升至气液界面（ALI）培养，有助于防止进一步收缩。同样地，若角质形成细胞覆盖不理想，调整无血清条件下VHSE浸没培养的天数可能有助于提高表皮单层覆盖度，并因去除血清而减轻收缩。上述细胞密度的调整或其他建议均需根据具体的培养体系和研究目标进行优化。

在气液界面（ALI）培养期间，为建立正常的表皮分层结构，必须定期检查并维持每孔中的液体水平，以确保在整个培养过程中维持气液界面状态及各构建物的适当水合状态。应每日检查并记录培养基液面，直至气液界面水平保持稳定。表皮层应呈现水润状态，而非干燥，但构建物表面不应有培养基积聚。在气液界面阶段，构建物将逐渐呈现正常的不透明乳白/黄色。表皮层的发育可能不均匀，常见情况包括：由于胶原接种或真皮层收缩，VHSE（全层皮肤等效物）出现倾斜。在较小规格的构建物（24孔板尺寸）中，常可见中央区域表皮层较高；而在12孔板尺寸的构建物中，常可见表皮在周边形成脊状结构。构建物的收缩13可能导致这些表面形态改变，或使上述现象完全不出现。

对VHSEs进行染色和成像会引入机械操作。规划并尽量减少对每份培养物的操作至关重要。当必须进行操作时，在将VHSEs从插入膜上取下、向构建物表面添加染色液或洗涤液，以及在成像准备过程中将VHSEs从储存/成像孔中取出和放回时，均应保持轻柔的操作动作。特别需要注意的是，表皮组分的顶端层可能较为脆弱，存在从基底表皮层脱落的风险。即使在天然组织中，表皮的顶端层也较为脆弱并会发生脱屑现象4，但为了准确分析表皮结构，应尽量减少损伤或丢失。如果表皮层从构建物上剥离，可将其单独成像。通常基底表皮层仍附着在真皮层上，而部分顶端层可能发生脱离。为了观察表皮结构，使用细胞核染色有助于识别，因为细胞核密集是表皮中下层的特征。

本方案中已讨论了VHSE固定后的共聚焦成像，但也可在培养过程中通过基于直立显微镜的光学相干断层扫描（optical coherence tomography, OCT）对VHSE进行成像88,89,90,91,92,93。VHSE具有足够的稳定性，可在无需孵育或加湿的条件下持续成像至少两小时，且无明显影响。由于OCT无需标记且具有非侵入性，因此可在成熟过程中连续监测表皮厚度。其他非侵入性成像方式也可能适用。

由于激光在VHSE深层发生衰减，对真皮和表皮结构进行整体成像可能具有挑战性。可通过从两个方向对构建物进行成像来缓解这一问题：从表皮侧（图1）和从真皮侧（图2），从而实现对真皮血管结构和表皮的良好分辨率。此外，可对样本进行透明化处理，以实现对整个结构的容积成像，并将信号衰减降至最低。尽管尝试了多种透明化方法，但采用甲醇/水杨酸甲酯法所获得的结果最佳。希望优化其他透明化方法的研究人员可参考以下综述49,61,62。若进行透明化处理，建议在处理前先对样本进行完整的成像，因为该方法可能损伤荧光团和/或组织结构。此外，透明化后应尽快完成成像，因为荧光可能在数天内逐渐减弱。

为简便性和可及性起见，本方案采用了先前文献中报道的最简单的培养基混合物11,80。尽管使用简单培养基混合物具有诸多优势，但该选择的局限性也应被充分认识。其他研究团队已探讨了特定培养基组分对表皮和真皮健康的影响，并发现其他培养基添加剂94（如外源性游离脂肪酸/脂质）可增强表皮角质层并改善皮肤屏障功能。尽管我们的免疫荧光标记显示表皮具有适当的分化和分层结构，但根据具体研究目的的不同，可能仍需进一步优化培养基。此外，在评估本文所呈现的血管化皮肤等效物（VHSEs）时，尚未对表皮基底膜（BM）进行深入分析。BM的完整性是评价皮肤等效物的重要指标；多个研究团队已对培养时长及其对BM标志物的影响95，以及成纤维细胞的存在和添加生长因子对BM表达的影响进行了研究14。值得注意的是，在使用本方案时，应对BM组分进行评估和优化。

本方案描述了一种生成 VHSE 的操作流程，并展示了在气液界面（ALI）培养 8 周后的结果。VHSE 培养物在 ALI 条件下已成功维持长达 12 周，未见明显变化或活力丧失，且其存活时间可能更长。重要的是，本方案可便捷地适配于常见的细胞类型，例如以 IMR90 肺成纤维细胞替代真皮成纤维细胞即为一例。根据研究者的需求和可用资源，可对培养体系中的细胞类型和培养基配方进行调整，但差异较大的细胞类型可能需要优化培养基条件。总之，这些操作步骤旨在为皮肤生物学与疾病研究中的 VHSE 培养提供清晰、可靠的指导。为最大限度提升可及性，本方案采用常见设备、细胞系和试剂，设计为一种简洁而稳健的最小有效方法，可进一步根据具体研究需求进行定制化调整。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Jim Rheinwald 博士59 和 Ellen H. van den Bogaard 博士20 慷慨惠赠 N/TERT 细胞系。本研究由美国心脏协会（19IPLOI34760636）提供资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 N NaOHFisher ChemicalS318-100（从实验室储备液稀释）
4% 多聚甲醛ACROS Organics#41678-5000，批号 # B0143461使用 PBS 中的固体多聚甲醛配制，pH 调至 6.9
高压灭菌的镊子Fine Science Tools#11295-00Dumont #5 镊子
CaCl2Fisher 生物试剂货号 BP510-250，批号 190231RNase、DNase、蛋白酶无污染
细胞系，内皮细胞：微血管内皮细胞（HMEC1）ATCCCRL-3243SV40 永生化微血管内皮细胞。注意，使用了每毫升 750,000 个细胞的胶原。
细胞系，成纤维细胞：成人皮肤人成纤维细胞ATCCPCS-201-012原代真皮细胞。注意，胶原中使用了75,000 个细胞/mL。
细胞系，成纤维细胞：人肺成纤维细胞（IMR90）ATCCCCL-186原代胚胎细胞。注意使用了75,000 个细胞/mL 的胶原蛋白。
细胞系，角质形成细胞：N/TERT-1通过hTERT表达实现永生化。N/TERT-1细胞系使用携带潮霉素抗性基因的逆转录病毒载体构建。该细胞系由Dickson等人于2000年建立。可使用ATCC PCS-200-010或PCS-200-011替代。注意每种构建体使用170,000个细胞；必须使用汇合度为30%的培养皿中的N/TERT1细胞——两个90 mm、汇合度为30%的组织培养皿可提供足量细胞。作者感谢Jim Rheinwald博士和Ellen H. van den Bogaard博士慷慨惠赠N/TERT细胞系。
离心赛默飞世尔科技；Sorvall Legend X1R（标准实验设备）
计算软件MATLABMATLAB 2020aMathWorks，马萨诸塞州纳蒂克
共聚焦显微镜Leica TCS SPEII 共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜。可替换为其他共聚焦显微镜或去卷积显微镜。
盖玻片（22 × 22）Fisher Scientific12-545F0.13-0.17 mm 1号厚度
氰基丙烯酸酯超级胶水或硅脂胶粘剂专家#THI0102Glue Masters，厚型，瞬干胶，氰基丙烯酸酯；推荐使用强力胶
DMEM 培养基基础液康宁；美迪特克公司货号 10-013-CM；批号 26119007DMEM，1×（Dulbecco 改良 Eagle 培养基），含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺 && 磷酸盐缓冲液（含丙酮酸钠）
DMEM/F-12 50/50康宁；美迪特克公司货号 10-090-CV；批号 21119006DMEM/F-12 50/50，1×（Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F12 50/50混合液），含L-谷氨酰胺
乙醇Decon Labs#V1101（标准实验室试剂）
胎牛血清Fisher Scientific货号 # FB12999102，批号 # AE29451050研究级胎牛血清，三重0.1 μm无菌过滤
精细尖头镊子Fine Science Tools#11295-00Dumont #5 镊子
人表皮生长因子（EGF）Peprotech货号 AF-100-15-1MG，批号 0318AFC05 D0218用 PBS 中含 0.1% BSA 的溶液配制
氢化可的松Alpha Easar批号 # 5002F2A用DMSO配制
胰岛素（人）Peprotech批号 # 9352621
倒置光学/相差显微镜VWR76317-470（标准实验设备）
异丙肾上腺素Alfa Aesar#AAJ6178806DL-异丙肾上腺素盐酸盐，98%
角质形成细胞-SFM（1x）培养基基础液Gibco；Life Technologies 公司货号：10724-011；批号：2085518角质形成细胞无血清培养基（1X）；无血清培养基
L-抗坏血酸Fisher Chemical货号 A61-100，批号 181977，CAS 号 50-81-7结晶状。L-抗坏血酸也可作为盐的形式购买
L-谷氨酰胺（固体）Fisher Bioreagents货号 # BP379-100，批号 # 172183，CAS # 56-85-9L-谷氨酰胺，白色晶体或结晶性粉末
MCDB 131 培养基基础Gen DepotCM034-050，批号 # 03062021MCDB 131 培养基基础，不含 L-谷氨酰胺，无菌过滤
金属打孔器Sona Enterprises (SE)791LP，12孔板空心皮革打孔器套装，高碳钢，硬度：48HRC；（多种尺寸，包括）：1/8", 5/32", 3/16", 7/32", 1/4", 9/32", 5/16", 3/4", 7/16", 1/2", 5/8:, 3/4"此打孔器套装很有帮助，但使用X-acto刀片也可达到类似效果。适用于12孔Transwell VHSE的金属打孔器理想尺寸为3/8英寸。" 或 1/2".
甲醇Fisher ChemicalCAS # 67-56-1（可选）用于透明脱水步骤。
水杨酸甲酯Fisher ChemicalO3695-500；批号 # 164535；CAS # 119-36-8（可选）。用于透明化。
1.7 mL 微量离心管Genesee Scientific Corporation；Olympus Plastics货号 # 24-282；批号 # 194671.7 ml 微量离心管，透明；耐煮沸，聚丙烯材质，经认证无RNase、无DNase、无DNA、无PCR抑制剂且无内毒素
PBS，10倍浓度，细胞培养级或经高压灭菌APEX Bioresearch Products货号 # 20-134，批号 # 202237PBS缓冲液，10倍浓缩干粉包；将整包内容物加入容器中，加水至1升，配制成10倍浓缩液。
PBS，1× 细胞培养级，无钙，无镁Genesee Scientific Corporation货号 # 25-508；批号 # 07171015
PBS，1× 非细胞培养级APEX Bioresearch Products货号 # 20-134，批号 # 202237PBS缓冲液，10倍浓缩干粉包；将整包内容物加入容器中，加水至1升，配制成10倍浓缩液。使用时加水稀释至1倍工作浓度。 
青霉素/链霉素Gibco；Life Technologies 公司货号 # 15140-122，批号 # 2199839青霉素-链霉素双抗溶液（10,000 单位/毫升 青霉素；10,000 微克/毫升 链霉素）
小玻璃培养皿康宁PYREX 316060（可选）。用作透明化容器
培养皿，100 mmFisher ScientificFB0875713用于配制PDMS。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）道康宁GMID 02065622，批号 H04719H035Sylgard 184 硅弹性体基础剂，Dow Corning，Midland，MI
道康宁GMID 02065622，批次号 H047JC4003DOWSIL 184 硅酮弹性体固化剂
注：聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常以套件形式出售，包含基础剂和固化剂两种组分。
正向置换移液器（1000 && 250 μLGilson1000 μL：HM05136，M1000；250 μL：T12269LM1000 移液器量程（100–1000 μL）；M250 移液器量程至 250 μL
正向置换吸头/活塞（1000 && 250 μLGilson1000 uL：货号 # F148180，批号 # B01292902S；250 uL：货号 # F148114，批号 # B05549718S无菌毛细管和活塞
圆头刮勺（可选；标准实验设备）用于成像前对VHSEs进行操作
角质形成细胞无血清培养基（Keratinocyte-SFM）添加剂Gibco；Life Technologies 公司货号 # 37000-015，批号 # 2154180含人重组表皮生长因子（EGF，货号 # 10450-013）、牛垂体提取物（货号 # 13028-014）
组织培养板插件，12孔板规格，3个 µm 孔径大小康宁；康斯特货号 3462 - 澄清；批号 14919057Transwell；12 mm 直径插件，3.0 μm 孔径，经组织培养处理，聚酯膜，聚苯乙烯板 
12 孔组织培养板Greiner Bio-one；CellStar货号 # 665 180；批号 # E18103QT12孔细胞培养板；无菌，带盖；产品无菌，无可见DNA酶、RNA酶、人类DNA和热原。内容物无细胞毒性
组织培养板，60.8 cm² 培养面积Genesee Scientific Corporation货号 # 25-202；批号：191218-177B组织培养皿；经处理，生长面积 60.8 cm^2；无菌，无DNase、无RNase、无热原；本体聚苯乙烯
Triton X-100Ricca Chemical Company货号 # 8698.5-16，批号 # 4708R34润湿剂
0.25% 胰蛋白酶康宁；美迪特公司货号 # 25-053-CI0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1× 不含碳酸氢钠
从大鼠尾部分离的I型胶原蛋白Pel-Freez 生物制品公司56054-1Sprauge-Dawley 大鼠尾可从 Pel-Freez 或其他供应商处购买冷冻品。可从大鼠尾腱中分离胶原蛋白。分离方案参考文献 [Cross et al., 2010; Rajan et al., 2007; Bornstein, 1958]。或者，也可从包括 Corning（目录号：354249）在内的供应商处购买高浓度大鼠尾胶原蛋白。
真空室，台式Bel-ArtF42010-0000（标准实验设备）
手持式精密刀具X-ActoX3311（若已购买钢制打孔器，则可不使用X-Acto刀）

参考文献

  1. Stojic, M., et al. Skin tissue engineering 3. Biomaterials for Skin Repair and Regeneration. , 59(2019).
  2. Shevchenko, R. V., James, S. L., James, S. E. A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction. Journal of The Royal Society Interface. 7 (43), 229-258 (2010).
  3. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and Physiology of the Skin. Journal of the Dermatology Nurses' Association. 3 (4), (2011).
  4. McGrath, J. A., Eady, R. A. J., Pope, F. M. Anatomy and organization of human skin. Rook's textbook of dermatology. 10, 9781444317633(2004).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. Tissue Engineered Human Skin Equivalents. Pharmaceutics. 4 (1), (2012).
  7. Oh, J. W., Hsi, T. -C., Guerrero-Juarez, C. F., Ramos, R., Plikus, M. V. Organotypic skin culture. The Journal of investigative dermatology. 133 (11), 1-4 (2013).
  8. El-Ghalbzouri, A., Gibbs, S., Lamme, E., Van Blitterswijk, C. A., Ponec, M. Effect of fibroblasts on epidermal regeneration. British Journal of Dermatology. 147 (2), 230-243 (2002).
  9. Sun, T., Haycock, J., MacNeil, S. In situ image analysis of interactions between normal human keratinocytes and fibroblasts cultured in three-dimensional fibrin gels. Biomaterials. 27 (18), 3459-3465 (2006).
  10. Kreimendahl, F., et al. Macrophages significantly enhance wound healing in a vascularized skin model. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1340-1350 (2019).
  11. El Ghalbzouri, A., Commandeur, S., Rietveld, M. H., Mulder, A. A., Willemze, R. Replacement of animal-derived collagen matrix by human fibroblast-derived dermal matrix for human skin equivalent products. Biomaterials. 30 (1), 71-78 (2009).
  12. Roger, M., et al. Bioengineering the microanatomy of human skin. Journal of Anatomy. 234, 438-455 (2019).
  13. Carlson, M. W., Alt-Holland, A., Egles, C., Garlick, J. A. Three-Dimensional Tissue Models of Normal and Diseased Skin. Current Protocols in Cell Biology. 41 (1), 1-17 (2008).
  14. El Ghalbzouri, A., Jonkman, M. F., Dijkman, R., Ponec, M. Basement Membrane Reconstruction in Human Skin Equivalents Is Regulated by Fibroblasts and/or Exogenously Activated Keratinocytes. Journal of Investigative Dermatology. 124 (1), 79-86 (2005).
  15. Pruniéras, M., Régnier, M., Woodley, D. Methods for cultivation of keratinocytes with an air-liquid interface. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 1 Suppl 28-33 (1983).
  16. Ali, N., Hosseini, M., Vainio, S., Taieb, A., Cario-André, M., Rezvani, H. R. Skin equivalents: skin from reconstructions as models to study skin development and diseases. British Journal of Dermatology. 173 (2), 391-403 (2015).
  17. Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. The use of skin models in drug development. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69-70, 81-102 (2014).
  18. Mieremet, A., Rietveld, M., Absalah, S., van Smeden, J., Bouwstra, J. A., El Ghalbzouri, A. Improved epidermal barrier formation in human skin models by chitosan modulated dermal matrices. PLOS ONE. 12 (3), 0174478(2017).
  19. Vidal, S. E. L., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Abbott, R. D., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. 3D biomaterial matrix to support long term, full thickness, immuno-competent human skin equivalents with nervous system components. Organoids and Ex Vivo Tissue On-Chip Technologies. 198, 194-203 (2019).
  20. Smits, J. P. H., et al. Immortalized N/TERT keratinocytes as an alternative cell source in 3D human epidermal models. Scientific Reports. 7 (1), 11838(2017).
  21. Lebonvallet, N., et al. Effects of the re-innervation of organotypic skin explants on the epidermis. Experimental Dermatology. 21 (2), 156-158 (2011).
  22. Van Drongelen, V., et al. Barrier Properties of an N/TERT-Based Human Skin Equivalent. Tissue Engineering Part A. 20 (21-22), 3041-3049 (2014).
  23. Hensler, S., Kühlbach, C., Parente, J. D., Krüger-Ziolek, S., Möller, K., Müller, M. Establishment and initial characterization of a simple 3D organotypic wound healing model. , Available from: https://opus.hs-furtwangen.de/frontdoor/index/index/docld/4852 (2018).
  24. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5), 240-249 (2013).
  25. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  26. Amelian, A., Wasilewska, K., Megias, D., Winnicka, K. Application of standard cell cultures and 3D in vitro tissue models as an effective tool in drug design and development. Pharmacological Reports. 69 (5), 861-870 (2017).
  27. Lu, W., et al. Mixture of Fibroblasts and Adipose Tissue-Derived Stem Cells Can Improve Epidermal Morphogenesis of Tissue-Engineered Skin. Cells Tissues Organs. 195 (3), 197-206 (2012).
  28. Marino, D., Luginbühl, J., Scola, S., Meuli, M., Reichmann, E. Bioengineering Dermo-Epidermal Skin Grafts with Blood and Lymphatic Capillaries. Science Translational Medicine. 6 (221), 221(2014).
  29. Martins-Green, M., Li, Q. -J., Yao, M. A new generation organ culture arising from cross-talk between multiple primary human cell types. The FASEB Journal. 19 (2), 222-224 (2004).
  30. Kim, B. S., Gao, G., Kim, J. Y., Cho, D. -W. 3D Cell Printing of Perfusable Vascularized Human Skin Equivalent Composed of Epidermis, Dermis, and Hypodermis for Better Structural Recapitulation of Native Skin. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), 1801019(2019).
  31. Baltazar, T., et al. 3D bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 26 (5-6), 227-238 (2019).
  32. Klar, A. S., et al. Tissue-engineered dermo-epidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells. Biomaterials. 35 (19), 5065-5078 (2014).
  33. Grebenyuk, S., Ranga, A. Engineering Organoid Vascularization. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  34. Black, A. F., Berthod, F., L'heureux, N., Germain, L., Auger, F. A. In vitro reconstruction of a human capillary-like network in a tissue-engineered skin equivalent. The FASEB Journal. 12 (13), 1331-1340 (1998).
  35. Huber, B., Link, A., Linke, K., Gehrke, S. A., Winnefeld, M., Kluger, P. J. Integration of Mature Adipocytes to Build-Up a Functional Three-Layered Full-Skin Equivalent. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (8), 756-764 (2016).
  36. Monfort, A., Soriano-Navarro, M., García-Verdugo, J. M., Izeta, A. Production of human tissue-engineered skin trilayer on a plasma-based hypodermis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 7 (6), 479-490 (2013).
  37. Shamis, Y., et al. Fibroblasts derived from human embryonic stem cells direct development and repair of 3D human skin equivalents. Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 10(2011).
  38. Kim, Y., et al. Establishment of a complex skin structure via layered co-culture of keratinocytes and fibroblasts derived from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 217(2018).
  39. Chau, D. Y. S., Johnson, C., MacNeil, S., Haycock, J. W., Ghaemmaghami, A. M. The development of a 3D immunocompetent model of human skin. Biofabrication. 5 (3), 035011(2013).
  40. Vanden Bogaard, E. H., et al. Crosstalk between Keratinocytes and T Cells in a 3D Microenvironment: A Model to Study Inflammatory Skin Diseases. Journal of Investigative Dermatology. 134 (3), 719-727 (2014).
  41. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating Macrophages into Organotypic Co-Cultures: A 3D In Vitro Model to Study Tumor-Associated Macrophages. PLOS ONE. 7 (7), 40058(2012).
  42. Ouwehand, K., Spiekstra, S. W., Waaijman, T., Scheper, R. J., de Gruijl, T. D., Gibbs, S. Technical Advance: Langerhans cells derived from a human cell line in a full-thickness skin equivalent undergo allergen-induced maturation and migration. Journal of Leukocyte Biology. 90 (5), 1027-1033 (2011).
  43. Weinmüllner, R., et al. Organotypic human skin culture models constructed with senescent fibroblasts show hallmarks of skin aging. npj Aging and Mechanisms of Disease. 6 (1), 4(2020).
  44. Barker, C. L., et al. The Development and Characterization of an In Vitro Model of Psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 892-901 (2004).
  45. Larcher, F., Espada, J., Díaz-Ley, B., Jaén, P., Juarranz, A., Quintanilla, M. New Experimental Models of Skin Homeostasis and Diseases. Actas Dermo-Sifiliográficas (English Edition). 106 (1), 17-28 (2015).
  46. Varkey, M., Ding, J., Tredget, E. E. Fibrotic Remodeling of Tissue-Engineered Skin with Deep Dermal Fibroblasts Is Reduced by Keratinocytes. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 716-727 (2013).
  47. Moulin, V. J. Reconstitution of skin fibrosis development using a tissue engineering approach. Methods in Molecular Biology. 961, Clifton, N.J. 287-303 (2013).
  48. Morgan, J. T., Shirazi, J., Comber, E. M., Eschenburg, C., Gleghorn, J. P. Fabrication of centimeter-scale and geometrically arbitrary vascular networks using in vitro self-assembly. Biomaterials. 189, 37-47 (2019).
  49. Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21 (8), 1-8 (2016).
  50. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  51. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1, 2753(2007).
  52. Bornstein, M. B. Reconstituted rat-tail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Laboratory Investigation. 7 (2), 134-137 (1958).
  53. Clément, M. -V., Ramalingam, J., Long, L. H., Halliwell, B. The In Vitro Cytotoxicity of Ascorbate Depends on the Culture Medium Used to Perform the Assay and Involves Hydrogen Peroxide. Antioxidants & Redox Signaling. 3 (1), 157-163 (2001).
  54. Tajima, S., Pinnell, S. R. Ascorbic acid preferentially enhances type I and III collagen gene transcription in human skin fibroblasts. Journal of Dermatological Science. 11 (3), 250-253 (1996).
  55. Murad, S., Tajima, S., Johnson, G. R., Sivarajah, A., Pinnell, S. R. Collagen Synthesis in Cultured Human Skin Fibroblasts: Effect of Ascorbic Acid and Its Analogs. Journal of Investigative Dermatology. 81 (2), 158-162 (1983).
  56. Villacorta, L., Azzi, A., Zingg, J. -M. Regulatory role of vitamins E and C on extracellular matrix components of the vascular system. Vitamin E: An Overview of Major Research Directions. 28 (5), 507-537 (2007).
  57. Ashino, H., et al. Novel Function of Ascorbic Acid as an Angiostatic Factor. Angiogenesis. 6 (4), 259-269 (2003).
  58. Ponec, M., et al. The Formation of Competent Barrier Lipids in Reconstructed Human Epidermis Requires the Presence of Vitamin C. Journal of Investigative Dermatology. 109 (3), 348-355 (1997).
  59. Dickson, M. A., et al. Human keratinocytes that express hTERT and also bypass a p16(INK4a)-enforced mechanism that limits life span become immortal yet retain normal growth and differentiation characteristics. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1436-1447 (2000).
  60. Johansen, C. Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. Journal of visualized experiments: JoVE. (130), e56863(2017).
  61. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  62. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 35-39 (2017).
  63. Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
  64. Ng, J. M. K., Gitlin, I., Stroock, A. D., Whitesides, G. M. Components for integrated poly(dimethylsiloxane) microfluidic systems. ELECTROPHORESIS. 23 (20), 3461-3473 (2002).
  65. Eddings, M. A., Johnson, M. A., Gale, B. K. Determining the optimal PDMS-PDMS bonding technique for microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (6), 067001(2008).
  66. Markov, D. A., Lillie, E. M., Garbett, S. P., McCawley, L. J. Variation in diffusion of gases through PDMS due to plasma surface treatment and storage conditions. Biomedical microdevices. 16 (1), 91-96 (2014).
  67. Katzenberg, F. Plasma-bonding of poly(dimethylsiloxane) to glass. e-Polymers. 5 (1), (2005).
  68. El Ghalbzouri, A., Lamme, E., Ponec, M. Crucial role of fibroblasts in regulating epidermal morphogenesis. Cell and Tissue Research. 310 (2), 189-199 (2002).
  69. Kanitakis, J. Anatomy, histology and immunohistochemistry of normal human skin. European journal of dermatology: EJD. 12 (4), 390-399 (2002).
  70. Kroon, D. -J. Hessian based Frangi Vesselness filter. MATLAB Central File Exchange. , Available from: https://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/24409-hessian-based-frangi-vesselness-filter (2010).
  71. Jerman, T., Pernuš, F., Likar, B. Špiclin Enhancement of Vascular Structures in 3D and 2D Angiographic Images. IEEE Transactions on Medical Imaging. 35 (9), 2107-2118 (2016).
  72. Kovesi, P. Phase Preserving Denoising of Images. signal. 4, 6(1999).
  73. Vincent, L. Morphological grayscale reconstruction in image analysis: applications and efficient algorithms. IEEE Transactions on Image Processing. 2 (2), 176-201 (1993).
  74. Xie, L., et al. Quantitative susceptibility mapping of kidney inflammation and fibrosis in type 1 angiotensin receptor-deficient mice. NMR in Biomedicine. 26 (12), 1853-1863 (2013).
  75. Van Uitert, R., Bitter, I. Subvoxel precise skeletons of volumetric data based on fast marching methods. Medical Physics. 34 (2), 627-638 (2007).
  76. Sethian, J. A. A fast marching level set method for monotonically advancing fronts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1591-1595 (1996).
  77. Sethian, J. A. Fast Marching Methods. SIAM Review. 41 (2), 199-235 (1999).
  78. Braverman, I. M. The Cutaneous Microcirculation. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings. 5 (1), 3-9 (2000).
  79. Men, S. J., Chen, C. -L., Wei, W., Lai, T. -Y., Song, S. Z., Wang, R. K. Repeatability of vessel density measurement in human skin by OCT-based microangiography. Skin research and technology: official journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (4), 607-612 (2017).
  80. Commandeur, S., Ho, S. H., de Gruijl, F. R., Willemze, R., Tensen, C. P., El Ghalbzouri, A. Functional characterization of cancer-associated fibroblasts of human cutaneous squamous cell carcinoma. Experimental Dermatology. 20 (9), 737-742 (2011).
  81. Thakoersing, V. S., Danso, M. O., Mulder, A., Gooris, G., Ghalbzouri, A. E., Bouwstra, J. A. Nature versus nurture: does human skin maintain its stratum corneum lipid properties in vitro. Experimental Dermatology. 21 (11), 865-870 (2012).
  82. Thakoersing, V. S., Gooris, G. S., Mulder, A., Rietveld, M., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Unraveling barrier properties of three different in-house human skin equivalents. Tissue Engineering. Part C, Methods. 18 (1), 1-11 (2012).
  83. Bouwstra, J. A., Groenink, H. W. W., Kempenaar, J. A., Romeijn, S. G., Ponec, M. Water distribution and natural moisturizer factor content in human skin equivalents are regulated by environmental relative humidity. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 378-388 (2008).
  84. Thakoersing, V. S., van Smeden, J., Mulder, A. A., Vreeken, R. J., El Ghalbzouri, A., Bouwstra, J. A. Increased Presence of Monounsaturated Fatty Acids in the Stratum Corneum of Human Skin Equivalents. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 59-67 (2013).
  85. Smola, H., Thiekötter, G., Fusenig, N. Mutual induction of growth factor gene expression by epidermal-dermal cell interaction. The Journal of Cell Biology. 122 (2), 417(1993).
  86. Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. Normal Human Primary Fibroblasts Undergo Apoptosis in Three-Dimensional Contractile Collagen Gels. Journal of Investigative Dermatology. 110 (2), 153-157 (1998).
  87. Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. Long-Term Culture of Fibroblasts in Contracted Collagen Gels: Effects on Cell Growth and Biosynthetic Activity. Journal of Investigative Dermatology. 93 (6), 792-798 (1989).
  88. Smith, L. E., Bonesi, M., Smallwood, R., Matcher, S. J., MacNeil, S. Using swept-source optical coherence tomography to monitor the formation of neo-epidermis in tissue-engineered skin. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 4 (8), 652-658 (2010).
  89. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Park, H., Cense, B., De Boer, J. F. Birefringence measurements in human skin using polarization-sensitive optical coherence tomography. Biomed Opt. 2 (2), 287-291 (2004).
  90. Pierce, M. C., Strasswimmer, J., Hyle Park, B., Cense, B., de Boer, J. F. Advances in Optical Coherence Tomography Imaging for Dermatology. Journal of Investigative Dermatology. 123 (3), 458-463 (2004).
  91. Yeh, A. T., Kao, B., Jung, W. G., Chen, Z., Nelson, J. S., Tromberg, B. J. Imaging wound healing using optical coherence tomography and multiphoton microscopy in an in vitro skin-equivalent tissue model. Journal of Biomedical Optics. 9 (2), 9(2004).
  92. Derr, K., et al. Fully Three-Dimensional Bioprinted Skin Equivalent Contructs with Validated Morphology and Barrier Funtion. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (6), 334-343 (2019).
  93. Park, B. H., de Boer, J. F. Polarization Sensitive Optical Coherence Tomography. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , 1055-1101 (2015).
  94. Batheja, P., Song, Y., Wertz, P., Michniak-Kohn, B. Effects of Growth Conditions on the Barrier Properties of a Human Skin Equivalent. Pharmaceutical Research. 26 (7), 1689-1700 (2009).
  95. Dos Santos, M., Metral, E., Boher, A., Rousselle, P., Thepot, A., Damour, O. In vitro 3-D model based on extending time of culture for studying chronological epidermis aging. Matrix Biology. 47, 85-97 (2015).

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