小鼠葡聚糖硫酸钠诱导结肠炎模型中肠道炎症的系统性评分分析

摘要

使用免费的计算机辅助系统对肠道炎症进行系统性评分，是定量比较以溃疡和炎症性改变为特征的结肠炎模型中组织病理学变化的有力工具。组织学结肠炎评分评估可加强临床观察结果，并有助于数据解读。

摘要

小鼠结肠炎模型是研究炎症性肠道疾病发病机制时广泛使用的工具。然而，目前仍缺乏用于客观、可重复地量化疾病严重程度的可靠标准。大多数结肠炎分析方法依赖于对小段肠组织进行有限的组织学评分，导致分析结果不完整或存在偏倚。本文结合高分辨率图像采集与全结肠的纵向分析，对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中的肠道损伤和溃疡情况进行量化。该方案可在无需大量用户培训的情况下，获得客观且可重复的结果。本文提供了DSS诱导结肠炎数据示例下的样本制备和图像分析的详细步骤。该方法可轻松适用于其他伴有明显黏膜损伤性炎症的小鼠结肠炎模型。我们证明，炎症/损伤及糜烂/溃疡黏膜占结肠总长度的比例与DSS诱导疾病进展过程中的体重减轻等临床表现高度一致。该组织学方案为DSS结肠炎实验中疾病活动度的无偏标准化分析提供了可靠、省时且经济的辅助手段。

引言

胃肠道上皮屏障在隔离管腔内抗原和病原体与深层组织区室方面发挥着关键作用¹。在炎症性肠病（IBD）、缺血或手术损伤等病理状态下所见的上皮损伤和黏膜伤口，常伴随腹泻、体重减轻、便血和腹痛等临床症状。损伤发生后，上皮细胞通过迁移和增殖来实现再上皮化，修复黏膜屏障缺陷。炎症消退及黏膜完整性的恢复对于重建肠道黏膜稳态和功能至关重要^2,3,4。

已采用多种动物模型来研究与肠上皮屏障损伤相关的潜在分子机制。化学诱导结肠炎的模型已被广泛使用，这些模型具有良好的建立基础且易于应用，尤其适用于炎症性损伤（如炎症性肠病IBD）的相关研究。其中一种常见、可重复且可靠的结肠炎小鼠模型是利用葡聚糖硫酸钠（DSS）介导的结肠损伤与炎症。疾病严重程度因小鼠品系、DSS剂量、DSS给药持续时间以及DSS的分子量而异^5,6,7。

在DSS结肠炎期间，肠道黏膜损伤通常通过疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）进行评估，该指数是根据体重减轻、粪便血液含量和粪便性状综合评分得出的。粪便血液含量可以是显微镜下可见的（通过粪便愈创木脂酸试验检测）或肉眼可见的；粪便性状则分为硬便、软便或液态（即腹泻）^5,8。这些临床参数的评分可能具有主观性，并且会因操作者的经验与偏倚而有所不同，但总体而言，该数据提供了可靠的信息，因此被炎症性肠病（IBD）研究人员广泛使用。相比之下，目前尚无普遍接受的黏膜损伤组织学评估方法。最常见的是由经过培训的病理学家检查结肠的选定区域，并根据若干参数进行评分，通常包括隐窝损伤和白细胞浸润^9,10,11。然而，由于不同研究报告中所考察的参数数量和分析的组织量差异较大，许多已发表研究之间的可比性受到限制。为了减少观察者偏倚并提高研究间的可重复性，理想的组织学评分方案应满足以下条件：1）涵盖整个结肠长度，因为肠道黏膜炎症常呈不均匀分布，且跳跃性病变较为常见；2）将分析限定于特定的关键且易于解读的参数，以降低主观性；3）便于快速、一致地处理大量样本；4）使用广泛可得且经济实惠的工具进行数据采集、分析和展示。

在此，我们介绍一种用于处理整个结肠或小肠长段的完整技术 "瑞士卷" 结合使用免费的计算机辅助评分系统，分析因DSS诱导的结肠炎所导致的肠道黏膜炎症与损伤。

方案

所有所述动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准。

1. 组织采集

1. 根据批准的实验方案，使用异氟烷麻醉后经颈椎脱位人道处死小鼠。所有动物实验均经认证的伦理审查委员会批准，符合国家及机构关于动物使用的指导原则。
2. 将小鼠仰卧置于解剖板上，使用20 G × 1 1/2英寸的针头固定四肢。
3. 使用镊子和剪刀在腹部皮肤上做一小切口，并将皮肤向一侧拉开，暴露腹膜。
4. 从耻骨联合至腹部两侧，沿腹膜中线切开，打开腹腔。
5. 小心移除组织和器官，直至暴露大肠。在结肠两侧切断骨盆骨，以充分暴露从肛门至盲肠的整个器官。
6. 在仔细解剖结肠的同时，轻柔去除附着的脂肪组织、小静脉和小动脉，并在肛门近端和盲肠远端稍作切割。
   注意：完成瑞士卷（Swiss roll）操作过程中，解剖所得结肠应保持在室温下。
7. 使用插入肛门的柔软塑料灌胃针，以1× PBS轻柔冲洗结肠，清除粪便内容物。
8. 将结肠平直放置，沿肠系膜动脉纵向剖开，从远端至近端将结肠纵向分为两半（图1A）。其中一半组织可用于组织学分析，另一半可用于Western blot、PCR检测，或卷成第二个瑞士卷用于新鲜冷冻的免疫荧光显微镜观察¹²。

2. 瑞士卷的制备

1. 使用剃刀从近端结肠去除多余组织，直至整个结肠长度方向上的宽度基本一致。
2. 将结肠调整至腔面朝上，并使用柔性灌胃针完全展平组织。如有需要，可添加更多PBS，以保持组织在整个操作过程中的湿润状态。
3. 用纸巾吸除多余的PBS。使用注射器和灌胃针，在组织表面加入10%中性缓冲福尔马林溶液，固定并展平组织，持续2-3分钟。
4. 用直镊夹住远端结肠末端，从远端向近端将结肠卷成同心圆状（图1B）。
   注意：卷制过程中可用食指轻推“瑞士卷”内侧，确保组织完全卷入内部。
5. 插入27 G针头，从中间固定结肠，以维持其瑞士卷形态（图1C）。
6. 将带针头的瑞士卷放入组织包埋盒中，并置于组织学标本容器内。
   注意：固定前必须确保组织与包埋盒方向平行（图1D）。
7. 在10%中性缓冲福尔马林溶液中于4 °C固定过夜¹³。
8. 过夜固定后，用PBS洗涤组织3次。
9. 在进行石蜡包埋前，向组织中加入70%乙醇。在继续操作前需从瑞士卷中取出针头。组织可在室温下保存于乙醇中，直至进行石蜡包埋¹³。
10. 将样品放入组织处理机中，进行石蜡包埋，并切出4 µm厚的切片，贴附于带正电荷的显微镜载玻片上（图1E）。此步骤可作为可选的暂停点。
    注意：正确的组织方向对于获得适合图像分析的切片至关重要。在石蜡包埋盒中平行放置的瑞士卷可产生完整切片，适用于图像分析（图1F-1H）。应避免斜切，以防产生不完整切片（图1I-1K）。更多细节请参见讨论部分。
11. 使用苏木精和伊红（H&E）对切片进行染色¹³。

3. 数字化扫描与分析

注意：为准确评估黏膜变化，应仅选择包含至少90%全结肠长度的组织切片。

1. 使用切片扫描仪或成像仪（参见材料表）扫描染色切片。生成的图像需达到每像素0.25微米的分辨率，使用40倍物镜和40倍放大倍数。
2. 安装并下载适用于扫描切片数字分析的软件（参见材料表）。
3. 在图像处理软件中打开扫描图像（图2A）。确认整个结肠可见，且样本无缺失区域。
4. 通过点击标签成像器（图2A）激活标签成像器和比例尺工具，以正确标识扫描切片。
5. 点击注释（图2A）打开注释工具，然后点击新建图层（图2B）创建三个不同的图层，用于量化瑞士卷的总长度、炎症/损伤以及糜烂/溃疡。通过点击图层颜色（图2B）为每个图层选择不同颜色。
6. 使用黏膜肌层作为参考，点击钢笔工具（图2A）测量每个图层/类别的长度：
   1. 将图像放大至400 µm（或更高）以便清晰观察黏膜肌层。
      注：可通过鼠标滚轮轻松调节放大倍数，在沿切片移动绘制线条时需根据需要调整放大倍数。
   2. 点击钢笔工具，沿黏膜肌层绘制线条（图2A）。根据需要移动指针以查看相邻分析区域。
      注：每次停止使用钢笔工具时，将生成一个小的新图层区域。可通过图层区域选项卡查看和编辑该区域（选择目标片段，若需更正错误则点击删除图层，图2B）。
7. 当所有图层（图2C）定义完成后，使用图层区域选项中的导出网格至文本文件按钮导出数据（图2B）。
   注：在创建图层过程中应经常保存文件，以确保数据正确存储。
8. 打开文本文件，并使用电子表格软件复制数据。汇总每个区域的所有片段，计算损伤和溃疡占总长度的百分比。
9. 为计算组织学结肠炎评分（HCS）并评估疾病严重程度，需考虑以下三个主要特征：
   1. 检查健康肠黏膜，其特征为隐窝-管腔轴上排列有序的上皮细胞、固有层中免疫细胞稀少，以及位于黏膜与黏膜下层之间的黏膜肌层（图3A）。
   2. 检查炎症/损伤，其特征为上皮隐窝变薄或部分缺失上皮细胞，黏膜出现炎症并伴有中性粒细胞浸润隐窝（图3B）。
   3. 检查是否存在糜烂/溃疡，其特征为表面上皮缺失区域，或完全缺乏上皮隐窝的区域（无论是否伴有白细胞浸润）（图3C）。
10. 使用以下公式计算以总长度百分比表示的损伤和溃疡区域的组织学结肠炎评分（HCS）：
    
    注：HCS将炎症/损伤百分比与糜烂/溃疡百分比相加，并对后者乘以系数2，这一设定基于合理假设：上皮完全丧失会导致屏障完整性最大程度破坏，因而疾病更严重。HCS能一致地反映DSS诱导实验性结肠炎所引起的形态学变化。值得注意的是，我们在DSS结肠炎模型中未观察到结肠淋巴样聚集体或滤泡数量与临床疾病严重程度之间存在明确相关性，因此本分析未包含对此项的量化。
11. 截取代表性图像快照（点击快照，图2A）并保存。如有需要，点击显示/隐藏比例尺（图2A）添加比例尺。

结果

为了说明在DSS攻击后黏膜损伤及结肠炎后续恢复过程中，组织学结肠炎评分分析的可靠性，我们对八只10周龄雄性C57BL6野生型小鼠在饮水中给予2.5%的DSS，持续5天，随后更换为普通饮水，恢复5天。在DSS急性给药期间（第0至第5天），小鼠体重未发生明显变化（图4A）。从第5天开始，当小鼠改饮普通自来水后，体重显著下降。在给予DSS 3天后出现便血和稀便，并持续至后续3天的饮水期，直至实验第8天（图4B）。这些观察结果表明，DSS暴露造成的最严重损害发生在第5至第8天的恢复阶段。在第10天测量结肠长度，证实实验结束时结肠长度显著缩短（图4C）。在第0、2、5、7、8和10天采集结肠组织，制备石蜡包埋的瑞士卷切片。组织经H&E染色后进行高分辨率扫描（图4D），并据此计算组织学结肠炎评分（图...

讨论

我们的组织学结肠炎评分系统是一种可靠的工具，用于量化肠道组织的炎症程度和损伤情况。该方法能够全面评估整个器官的组织病理学状态，避免因仅选择小面积或不完整切片而带来的偏差。成功实施本方案的关键步骤包括：正确制备瑞士卷式肠组织样本，以确保至少分析结肠长度的90%；在石蜡包埋和切片过程中保持平行方向，以获得整齐均匀的组织切片，并呈现上皮隐窝的纵向视图；在经验丰富的病理学家指导下进行实践和培训，确保受训人员能够准确区分急性炎症、上皮损伤与糜烂/溃疡；以及配备高分辨率数字扫描仪。

在进行石蜡包埋和切片时，需要进行微小调整并排除故障，以正确地定位瑞士卷（Swiss roll），确保组织相对于石蜡盒和刀片保持平行方向（图1E-F）。遵循这种空间取向可减少不完整切片的数量。如果结肠被完美地卷成瑞士卷状，则包含最长组织长度的最佳切片将位于瑞士卷的中部（图1F）。连续收集多个切片可显著提高获得良好取向切片的概率，使隐窝的整个长度均清晰可见（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Aperio AT2 – 高通量数字全片扫描	Leica Biosystems	Aperio AT2
带防水防潮层的吸水垫	VWR International	56616-032
American Line 66-0089 单刃刀片，每包100片	GT Midwest	TL5837
BD Luer-Lok 无针一次性注射器	Fisher Scientific	14-823-2A
波恩斜视剪 - ToughCut	精细科学工具	11103-09
波恩斜视剪 - ToughCut	精细科学工具	14084-09
Dumont #5 镊子	精细科学工具	11251-20
中性缓冲福尔马林溶液，10%	Sigma	HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea	Fisherbran	70% 变性乙醇
ImageScope	Aperio	版本 12.3.3.5039	http://www.leicabiosystems.com/病理成像/aperio-数字化病理/整合/imagescope/
LeakBuster 样本容器：无菌	Starplex Scientific	B120210
磷酸盐缓冲液，不含钙 &和镁	康宁	21-040-CV
塑料喂养管，20 号 × 30 毫米	Instech	FTP2030
PrecisionGlide 针头，规格：20 G × 1 1/2 英寸	BD（Becton, Dickinson and Company）	305176
PrecisionGlide 针头，规格：27 G × 1/2 英寸	BD（Becton, Dickinson and Company）	305109
注射器，10 ml	BD（Becton, Dickinson and Company）	302995
Unisette 组织包埋盒	Simport	M505-2