使用免费的计算机辅助系统对肠道炎症进行系统性评分，是定量比较以溃疡和炎症性改变为特征的结肠炎模型中组织病理学变化的有力工具。组织学结肠炎评分评估可加强临床观察结果，并有助于数据解读。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠结肠炎模型是研究炎症性肠道疾病发病机制时广泛使用的工具。然而，目前仍缺乏用于客观、可重复地量化疾病严重程度的可靠标准。大多数结肠炎分析方法依赖于对小段肠组织进行有限的组织学评分，导致分析结果不完整或存在偏倚。本文结合高分辨率图像采集与全结肠的纵向分析，对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中的肠道损伤和溃疡情况进行量化。该方案可在无需大量用户培训的情况下，获得客观且可重复的结果。本文提供了DSS诱导结肠炎数据示例下的样本制备和图像分析的详细步骤。该方法可轻松适用于其他伴有明显黏膜损伤性炎症的小鼠结肠炎模型。我们证明，炎症/损伤及糜烂/溃疡黏膜占结肠总长度的比例与DSS诱导疾病进展过程中的体重减轻等临床表现高度一致。该组织学方案为DSS结肠炎实验中疾病活动度的无偏标准化分析提供了可靠、省时且经济的辅助手段。
引言
胃肠道上皮屏障在隔离管腔内抗原和病原体与深层组织区室方面发挥着关键作用1。在炎症性肠病（IBD）、缺血或手术损伤等病理状态下所见的上皮损伤和黏膜伤口，常伴随腹泻、体重减轻、便血和腹痛等临床症状。损伤发生后，上皮细胞通过迁移和增殖来实现再上皮化，修复黏膜屏障缺陷。炎症消退及黏膜完整性的恢复对于重建肠道黏膜稳态和功能至关重要2,3,4。
已采用多种动物模型来研究与肠上皮屏障损伤相关的潜在分子机制。化学诱导结肠炎的模型已被广泛使用，这些模型具有良好的建立基础且易于应用，尤其适用于炎症性损伤（如炎症性肠病IBD）的相关研究。其中一种常见、可重复且可靠的结肠炎小鼠模型是利用葡聚糖硫酸钠（DSS）介导的结肠损伤与炎症。疾病严重程度因小鼠品系、DSS剂量、DSS给药持续时间以及DSS的分子量而异5,6,7。
在DSS结肠炎期间，肠道黏膜损伤通常通过疾病活动指数（Disease Activity Index, DAI）进....
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方案
所述所有动物实验均经密歇根大学动物使用与护理委员会批准。
1. 组织采集
- 根据批准的实验方案，使用异氟烷麻醉后实施颈椎脱位，以人道方式处死小鼠。所有动物实验均经认证的审查委员会批准，符合国家和机构的动物使用指南。
- 将小鼠仰卧置于解剖板上，使用20 G × 1 1/2英寸的针头固定小鼠四肢。
- 使用镊子和剪刀在腹部皮肤上做一小切口，并将皮肤向一侧拉开，暴露腹膜。
- 从耻骨联合至腹部两侧，沿腹膜中线切开，打开腹腔。
- 小心移除组织和器官，直至暴露出大肠。在结肠两侧切断骨盆骨，以充分暴露从肛门至盲肠的整个器官。
- 在仔细解剖结肠的同时，轻柔去除附着在其上的脂肪组织、小静脉和小动脉，并在肛门近端和盲肠远端稍作切割。
注意：完成瑞士卷（Swiss roll）操作过程中，解剖出的结肠应保持在室温下。 - 使用插入肛门的柔软塑料灌胃针，以1×PBS轻柔冲洗结肠，清除粪便内容物。
- 将结肠平直放置，沿肠系膜动脉纵向切开，从远端至近端将结肠纵向分为两半（图1A）。其中一半组织可用于组织学分析，另一半可用于Western blot、PCR检测，或卷成第二个瑞士卷用于新鲜冷冻免疫荧光显微镜观察12。
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结果
为了说明在DSS攻击后黏膜损伤及随后结肠炎恢复过程中，组织学结肠炎评分分析的可靠性，我们对八只10周龄雄性C57BL6野生型小鼠在饮水中给予2.5% DSS，持续5天，随后恢复期给予普通水5天。在急性DSS给药期间（第0至第5天），小鼠体重未发生明显变化（图4A）。从第5天开始，当小鼠改饮普通自来水后，体重急剧下降。在给予DSS 3天后出现血便和稀便，并在之后的3天饮水期持续存在，直至实验第8天（图4B）。这些观察结果表明，DSS暴露最严重的损害效应出现在第5至第8天的恢复期。实验第10天对结肠长度的测量证实，实验结束时结肠长度显著缩短（图4C）。在第0、2、5、7、8和10天采集结肠组织，制备石蜡包埋的瑞士卷切片。组织经H&E染色后进行高分辨率扫描（图4D），并据此计算组织学结肠炎评分（
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讨论
我们的组织学结肠炎评分系统是一种可靠的工具，用于量化肠道组织的炎症程度和损伤情况。该方法能够全面评估整个器官的组织病理学状态，避免因仅选择小面积或不完整切片而带来的偏差。成功实施本方案的关键步骤包括：正确制备瑞士卷式肠组织样本，以确保至少分析结肠长度的90%；在石蜡包埋和切片过程中保持平行方向，以获得整齐均匀的组织切片，并呈现上皮隐窝的纵向视图；在经验丰富的病理学家指导下进行实践和培训，确保受训人员能够准确区分急性炎症、上皮损伤与糜烂/溃疡；以及配备高分辨率数字扫描仪。
在进行石蜡包埋和切片时，需要进行微小调整并排除故障，以正确地定位瑞士卷（Swiss roll），确保组织相对于石蜡盒和刀片保持平行方向（图1E-F）。遵循这种空间取向可减少不完整切片的数量。如果结肠被完美地卷成瑞士卷状，则包含最长组织长度的最佳切片将位于瑞士卷的中部（图1F）。连续收集多个切片可显著提高获得良好取向切片的概率，使隐窝的整个长度均清晰可见（
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望感谢美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 DK055679、DK089763、DK079392、DK061739、DK072564 以及密歇根大学病理学切片扫描服务中心提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Aperio AT2 – 高通量数字全片扫描 | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| 带防水防潮层的吸水垫 | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 单刃刀片，每包100片 | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok 无针一次性注射器 | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| 波恩斜视剪 - ToughCut | 精细科学工具 | 11103-09 | |
| 波恩斜视剪 - ToughCut | 精细科学工具 | 14084-09 | |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具 | 11251-20 | |
| 中性缓冲福尔马林溶液，10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% 变性乙醇 | |
| ImageScope | Aperio | 版本 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/病理成像/aperio-数字化病理/整合/imagescope/ |
| LeakBuster 样本容器：无菌 | Starplex Scientific | B120210 | |
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| PrecisionGlide 针头，规格：20 G × 1 1/2 英寸 | BD（Becton, Dickinson and Company） | 305176 | |
| PrecisionGlide 针头，规格：27 G × 1/2 英寸 | BD（Becton, Dickinson and Company） | 305109 | |
| 注射器，10 ml | BD（Becton, Dickinson and Company） | 302995 | |
| Unisette 组织包埋盒 | Simport | M505-2 |
参考文献
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflam....
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