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方法文章

一种大鼠的EcoHIV脑部感染模型

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DOI：

10.3791/62137

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2021年1月21日

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用嵌合型HIV病毒（EcoHIV）建立新型大鼠主动HIV感染模型的实验方案，该模型对于深入理解HIV-1在脑组织中的病毒储存库，以及研究HIV相关性神经认知功能障碍及其共病（如药物滥用）具有重要意义。

摘要

已有大量研究表明，感染EcoHIV的小鼠模型在研究HIV相关神经系统并发症方面具有重要价值。建立用于药物滥用和神经认知障碍研究的感染EcoHIV的大鼠模型，将有助于神经HIV及HIV-1相关神经认知障碍（HAND）的研究。在本研究中，我们成功构建了一种利用嵌合型HIV（EcoHIV）建立的活跃HIV感染大鼠模型。首先，在培养的293 FT细胞中包装EcoHIV的慢病毒载体，持续48小时。随后，收集条件培养基并进行浓缩和滴度测定。接下来，我们将EcoHIV-EGFP通过双侧立体定位注射至F344/N大鼠的脑组织中。感染一周后，在脑组织中检测到EGFP荧光信号，表明EcoHIV可在大鼠体内成功诱导活跃的HIV感染。此外，我们还对小胶质细胞标志物Iba1进行了免疫染色，结果显示小胶质细胞是携带EcoHIV的主要细胞类型。进一步发现，感染八周后，EcoHIV大鼠在时间感知处理方面出现异常，这可能是HAND潜在的神经行为学机制之一，同时伴有突触功能障碍。综上所述，本研究将EcoHIV的HIV-1感染模型扩展至大鼠，为研究脑内HIV-1病毒储存库以及HAND及其共病（如药物滥用）提供了一个有价值的生物系统。

引言

生物系统加深了我们对人类免疫缺陷病毒1型相关神经认知障碍（HAND）及其潜在神经机制的理解2。确定何种生物系统最适合特定研究，通常取决于所关注的科学问题2。可用于研究HIV-1疾病发展的宿主动物模型种类有限，这给相关研究带来了挑战。为了研究HIV-1病毒复制和致病机制，Potash等人3建立了一种可发生主动HIV-1感染的小鼠模型，该模型将HIV表面包膜糖蛋白gp120的编码区替换为嗜鼠性逆转录病毒（MLV）的gp80，从而实现了病毒在小鼠体内的有效复制4。在嵌合型HIV（EcoHIV）小鼠经尾静脉注射后，观察到许多与HIV-1血清阳性个体相似的特征（例如，淋巴细胞和巨噬细胞被感染，引发抗病毒免疫反应以及炎症反应3,5,6）。

尽管小鼠和大鼠均属于鼠科（Muridae），但两者之间存在的基本物种差异可能会影响其对特定实验问题的适用性7。因此，将EcoHIV感染模型扩展至大鼠（常用于药物滥用和神经认知障碍研究）将有助于神经HIV的研究。例如，大鼠体型较大，使得颈静脉导管植入用于药物自我给药操作更为可行8。研究人员已采用大鼠的药物自我给药技术来评估HIV-1感染下的动机行为9。此外，许多神经认知/行为学任务最初是为大鼠设计的10。本文报道了通过立体定位注射将EcoHIV注入大鼠体内，从而扩展EcoHIV感染模型，为研究与神经HIV及HIV相关神经认知障碍（HAND）相关的新问题提供了重要机会。

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方案

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（联邦保证编号：D16-00028）。六只成年雄性F344/N大鼠在受控环境中成对饲养，光照周期为12小时光照：12小时黑暗，可自由获取食物和水。所有动物的护理均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》中制定的准则。

1. 在293 FT细胞中进行病毒包装

  1. 将293 FT细胞（5×105/mL）培养于明胶包被的75 cm2培养瓶中，使用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基11，在37 °C条件下培养至转染时细胞融合度达到50%。
  2. 在1.5 mL微量离心管中，将22.5 µL转染试剂（例如Lipofectamine 3000）溶于750 µL培养基（例如Opti-MEM）中，涡旋振荡3秒。
  3. 在另一1.5 mL微量离心管中，将20 µg EcoHIV质粒DNA溶于750 µL培养基中，并充分混匀。
  4. 将稀释后的DNA加入已稀释的转染试剂管中，轻轻混匀。室温孵育15分钟。
  5. 将上述混合物加入含有10 mL预温DMEM培养基的75 cm2培养瓶中。在37 °C条件下继续培养细胞2天。
  6. 收集并合并两个培养瓶中的24 mL条件培养基（含包装好的慢病毒颗粒）。
  7. 将全部24 mL条件培养基于4 °C、500 xg离心10分钟。将澄清的上清液转移至无菌的50 mL离心管中。
  8. 将8 mL Lenti-X浓缩剂与24 mL澄清上清液按1:3比例混合。通过轻柔颠倒混匀。4 °C孵育两天。
  9. 将混合液在4 °C、1,500 x g条件下离心45分钟。小心弃去上清液。
  10. 用100 µL 100 mM PBS轻轻重悬沉淀物。
  11. 使用p24 ELISA试剂盒测定病毒滴度。

2. EcoHIV-EGFP 病毒立体定位手术

  1. 使用3%七氟烷麻醉大鼠。当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，进行步骤2.2。
  2. 剃除脑区毛发，并用70%乙醇和含氯己定的消毒液对皮肤进行两次消毒。将大鼠俯卧位固定于立体定位仪中。
  3. 沿头皮正中线做皮肤切口（5–6 cm）。
  4. 在前囟外侧0.8 mm、头侧1.2 mm处标记两个钻孔位置。在颅骨相应位置各钻一个直径为0.4 mm的孔。
  5. 将滴定后的EcoHIV慢病毒溶液（1.04 × 106 TU/mL）吸入10 µL注射器中。将注射器固定于立体定位仪上。
  6. 将针头下降至接近钻孔表面，测量并继续下针2.5 mm深度。
  7. 以0.2 µL/min的速度注入1 µL病毒溶液。保持针头在注射部位内5分钟。缓慢上提针头直至完全退出大鼠颅骨。
  8. 用4-0丝线缝合皮肤。
  9. 用70%乙醇对切口消毒一次。皮下注射布托啡诺（Dorolex，0.1 mg/kg体重）。
  10. 将大鼠转移至带有加热垫的恢复室，直至其苏醒。

3. 脑切片的可视化

注意：在 EcoHIV 病毒注射后等待一至八周。

  1. 用5%七氟烷麻醉大鼠。当大鼠对有害刺激无反应且反射消失时，继续进行步骤3.2。
  2. 将大鼠仰卧位固定在通风橱内。
  3. 沿胸骨中线切开皮肤，剪开膈肌并打开胸腔。
  4. 将一支20 G × 25 mm的针头插入左心室。
  5. 立即用剪刀剪开右心房。
  6. 以5 mL/min的速度灌注50 mL预冷的100 mM PBS。
  7. 以5 mL/min的速度灌注100 mL冰冷的4%多聚甲醛。
  8. 断头取脑，切开头皮并取出脑组织。
  9. 用4%多聚甲醛在4℃下后固定过夜。
  10. 将脑组织转移至含有40 mL 30%蔗糖（溶于100 mM PBS）的50 mL离心管中，直至脑组织沉降至管底（约3天）。
  11. 将脑组织置于甲基丁醇中，在-80 °C下快速冷冻2分钟。
  12. 将脑组织固定在-20 °C冷冻切片机内的金属平台上。
  13. 使用冷冻切片机切割50 µm厚的冠状切片。
  14. 用细刷将脑切片转移至载玻片上。
  15. 每张切片加入0.3 mL抗荧光淬灭封片剂，并加盖22 mm × 50 mm的盖玻片封片。
  16. 将载玻片置于室温避光处直至干燥。
  17. 根据脑区边界及神经元形态特征，使用共聚焦显微镜进行Z轴层扫成像。
    注意：共聚焦显微镜设置如下：放大倍数60 X（A/1.4，油镜），Z轴步进间隔0.15 µm（针孔大小30 µm；后投影针孔半径167 nm），激发波长为488 nm。

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结果

收集感染EcoHIV-EGFP慢病毒的293FT细胞的条件培养基，随后进行浓缩和滴度测定，并通过立体定位注射至F344/N大鼠脑内（皮层区域）。注射后7天，处死大鼠，获取从前囟5.64 mm至前囟-4.68 mm范围的冠状脑切片图像。在图1A中，可见全脑范围内存在显著的EcoHIV-EGFP信号，尤其在皮层和海马齿状回区域。此外，Iba1与EcoHIV-EGFP探针的双标染色提供了有力证据，表明小胶质细胞是脑内携带EcoHIV表达的主要细胞类型（图1B）。值得注意的是，EcoHIV-EGFP的分布模式与大鼠脑内小胶质细胞在不同脑区的相对分布浓度一致（即皮层和海马齿状回）。

在后续研究中，我们验证了EcoHIV感染大鼠在模拟HIV相关性神经认知功能障碍（HAND）关键特征方面的实用性。采用上述详细方案，对F344/N大鼠进行立体定位注射EcoHIV-EGFP或生理盐水。首先，在感染后八周，评估了时间感知处理能力——这一功能可能是HAND的一个基本维度

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讨论

在本实验方案中，我们建立了一种由EcoHIV诱导的大鼠HIV感染模型。具体而言，我们描述了通过立体定位双侧注射EcoHIV至大脑皮层，可在注射后7天成功诱导大鼠脑内产生活跃的HIV感染。此外，我们证明EcoHIV感染大鼠可作为研究HIV相关神经认知功能障碍（HAND）关键特征的良好生物系统。在EcoHIV感染8周后，大鼠表现出显著的神经认知功能损害，包括时间处理能力的改变以及伏隔核（NAc）中型棘状神经元（MSNs）的突触功能障碍。鉴于动物模型在神经HIV和HAND研究中的重要性2，开发新的生物系统可能有助于推动该领域内新问题的探索。Potash等3首次报道了使用EcoHIV在小鼠中诱导活跃的HIV-1感染。具体方法为通过尾静脉注射0.1 mL EcoHIV病毒溶液3。感染6周后，可在脾细胞和淋巴细胞中检测到HIV-1病毒DNA。此外，单次EcoHIV接种即可在超过75%的小鼠中成功诱导感染。本研究采用双侧立体定位注射方法，成功实现了100%的大鼠感染（分别为n = 6或n = 4），并在注射后...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 HD043680、MH106392、DA013137 和 NS100624。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293FT 细胞ThermoFisher ScientificR70007
抗生素-抗真菌素溶液Cellgro30004CI100X
Corning BioCoat Gelatin 75 cm² 倾斜颈带通气盖细胞培养瓶Life Technologies354488
Corning DMEM 培养基（含 L-谷氨酰胺、4.5 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠）Life Technologies10013CV
盖玻片VWR637-137
钻孔器
Dumont #5 镊子World Precision Instruments14095
Dumont #7 镊子World Precision Instruments14097
Eppendorf Snap-Cap 微量离心生物纯 Safe-Lock 管Life Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus 抗菌性 4-0 聚乳酸-乙醇酸共聚物 910 缝线，27 英寸，FS-2Med Vet InternationalVCP422H
Hamilton 注射器Hamilton1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 转染试剂Life TechnologiesL3000015
虹膜镊World Precision Instruments15914
虹膜剪World Precision Instruments500216
慢病毒相关 p24 ELISA 检测试剂盒Cell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X 浓缩试剂TakaraPT4421-2
Opti-MEM I 低血清培养基Life Technologies11058021
多聚甲醛Sigma-Aldrich158127-500G
多聚甲醛SigmaP6148
ProLong Gold 封片剂Fisher ScientificP36930
七氟烷Merritt Veterinary Supply347075
立体定位仪Kopf InstrumentsModel 900
SuperFrost Plus 载玻片Fisher Scientific12-550-154%
Vannas 剪刀World Precision Instruments500086

参考文献

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