我们描述了用于小鼠肠道的被动CLARITY（PACT）染色方案，该方案可实现上皮下组织（包括神经元、胶质细胞和肠内分泌细胞（EEC））的可视化，且无需进行组织切片。该方案包括将经甲醛固定的组织进行水凝胶包埋，随后使用阴离子去污剂进行脱脂以“透明化”组织。
本文内容
摘要
摘要
CLARITY（透明脂质交换丙烯酰胺杂化刚性成像兼容组织水凝胶）是一种新兴的有价值技术，通过丙烯酰胺包埋实现组织脱脂（无需切片）并保存三维组织结构，适用于免疫染色。该技术在成像动态肠道环境方面具有重要意义，可用于研究稳态和疾病状态下不同类型细胞之间的相互作用。本文描述了针对小鼠肠道优化的该方法，有助于追踪上皮细胞、肠内分泌细胞、神经元、胶质细胞以及延伸至上皮细胞或肠内分泌细胞的神经纤维投射，这些结构分别介导微生物感知和营养物质化学感知。取1-1.5 cm肠道组织，在第1天于4 °C条件下用含4%多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS）固定过夜。第2天弃去PFA溶液，用PBS洗涤组织三次。为保持组织完整性，将组织置于水凝胶中包埋：使用PBS配制4%水凝胶（丙烯酰胺）溶液（由30% ProtoGel稀释而成），于4 °C孵育过夜。第3天，将组织-水凝胶混合物在37 °C °C 下孵育 1 小时以使水凝胶聚合。随后用 PBS 轻柔洗涤组织三次，以去除多余的水凝胶。接下来的脱脂（透明化）步骤包括将组织在含 8% 十二烷基硫酸钠（SDS）的 PBS 溶液中于 37 °C 孵育 2 天（第 4 天 & 5）在室温（RT）下于摇床上孵育。第6天，用PBS彻底清洗组织以去除SDS。组织可进行免疫染色：先在含0.3% Triton X-100的PBS中加入0.5%正常驴血清稀释的一抗溶液中，4°C孵育过夜；随后在相应的Alexa Fluor二抗溶液中室温孵育1.5小时，并用DAPI（1:10000）进行核染色。将组织转移至洁净的玻片上，使用VectaShield封片，用于共聚焦成像。
引言
CLARITY（透明脂质交换丙烯酰胺杂化刚性成像兼容组织水凝胶）是一种新兴的重要技术，通过丙烯酰胺（水凝胶）包埋和组织去脂化来保存三维组织结构，从而实现无需切片的免疫染色1,2。水凝胶包埋的组织具有光学透明性和大分子通透性，在使用去垢剂去除脂质后，蛋白质和核酸仍得以保留。该技术被《Science》杂志评为2013年十大重要突破之一3。 尽管该技术最初是为成像富含脂质的脑组织而开发的（因为脂质会影响光散射和成像质量），但目前已被广泛用于肠道、肝脏、肾脏和心脏等其他组织的成像。该技术通过消除切片需求，实现了对组织的整体染色与成像，避免了因细胞类型分布不均而导致的细胞间相互作用评估偏差。此外，该技术还支持共聚焦z轴层扫成像，并可重建组织的三维图像，从而比传统组织切片更真实地评估不同细胞类型的密度、微结构以及细胞间相互作用。同时，该技术已被改进用于骨等致密组织的免疫染色以及原位杂交研究。水凝胶包埋的三维组织为阐明上皮细胞、肠内分泌细胞、胶质细胞和神经元之间的相互作用提供了一个极具吸引力的平台，这些相互作用最近被指出对理解帕金森病、阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍等疾病的病理生理机制至关重要4。
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方案
所述所有动物实验均经埃默里大学动物使用与护理委员会批准。选用8至12周龄的C57BL/6小鼠（雌雄均可），在实施安乐死前可自由获取食物和水。
1. 肠道的切除（第1天）
- 采用二氧化碳窒息法处死小鼠，二氧化碳流速为1.6 mL，直至观察到呼吸停止持续2分钟。
- 将小鼠仰卧固定于解剖板上，四肢固定。用70%乙醇消毒腹部。用镊子夹起皮肤，用剪刀剪开。
- 轻轻提起肝脏，辨认胃部。用镊子夹住胃，于胃上方剪断食管。继续用镊子固定胃部，小心剪除肠系膜，将肠道从腹腔分离至直肠。在直肠处剪断已分离的肠道。
- 将分离的肠道转移至含有冰浴PBS溶液的培养皿中。随后，小心剪除回肠段之间的肠系膜，拉直肠道，从胃部开始，沿肠道一直剪除至结肠的所有肠系膜。
- 根据需要，取1-1.5 cm肠段用于CLARITY染色，放入另一含有冰浴PBS的培养皿中。
- 使用连接20 G钝头针头的5 mL注射器，用冰浴PBS冲洗肠腔内的粪便内容物。
注意：使用相同技术，肠道任意区域均可用于CLARITY染色。肠段可沿肠系膜剪开，或保持完整，用于后续步骤。
2. 肠道组织的固定（第1天）
- 用 PBS 中的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液固定组织。
- 将 1–1.5 cm 长的目标....
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结果
CLARITY 透明化处理的小鼠肠道组织图像如图1所示。成功完成本方案可获得高质量、清晰的图像，所有细胞细节均可清晰观察。针对细胞核的 DAPI 染色是评估 CLARITY 方案质量以及后续免疫染色效果的良好指标，因其能够反映组织完整性。此外，细胞形态也可提供方案是否成功的线索，特别是对于具有明显形态特征的神经元、胶质细胞和肠内分泌细胞。若细胞形态扭曲，染色稀疏或异常，则表明组织制备过程受到破坏。
小鼠回肠经泛神经元标志物 Tuj1 染色（β-3-微管蛋白，红色）与胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP，绿色）共染色的结果如图所示 图1A使用成像软件对z轴堆栈图像进行处理后生成的小鼠结肠三维图像，经神经元标记物Tuj1（红色）染色，如图所示。 图1B显示小鼠结肠中产生嗜铬粒蛋白A的肠内分泌细胞染色结果 图1C在所有图像中，蓝色代表DA.......
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讨论
CLARITY 方法在对小鼠肠道进行染色以三维可视化多种细胞类型（包括上皮细胞、神经元和胶质细胞）方面具有重要价值，尤其适用于观察延伸穿过肠壁至肠腔的神经纤维网络5及其对胶质细胞和肠内分泌细胞（EEC）的神经支配。本文所采用的方法是根据 Yang 等人于 2014 年发表的原始研究1进行改良的。
该方案中的关键步骤包括：肠道组织经 overnight 固定后立即洗去固定剂，随后进行水凝胶包埋和脱脂。脱脂后的 PBS 洗涤至关重要，可去除脱脂步骤中残留的洗涤剂。
CLARITY 染色的优势在于无需切片即可实现组织成像，同时保持组织结构、蛋白质和核酸的完整性，即使在灌注组织中也能提供高质量的图像，并可对组织微结构及细胞间相互作用（如神经元-胶质细胞、肠内分泌细胞-胶质细胞等）进行三维评估。此外，观察发现 CLARITY 染色的切片在 -20 °C 保存后仍能保持良好的荧光信号，因此如有需要可后续成像。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者希望感谢美国胃肠病学会（AGA）AGA-Rome 功能性胃肠道动力障碍试点研究奖（授予 BC）、美国国立卫生研究院资助项目 AI64462（ASN）以及埃默里大学整合细胞成像显微镜核心设施的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛（PFA） PBS 溶液 | ThermoFischer Scientific | J19943 | 用于组织固定 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI） | ThermoFischer Scientific | D1306 | 1/10,000 稀释 |
| Alexa Fluor-488 | ThermoFischer Scientific | A-11034 | 1/1000 稀释 |
| Alexa Fluor-555 | ThermoFischer Scientific | A-21428 | 1/500 稀释 |
| 抗 GFAP（胶质纤维酸性蛋白）抗体 | Abcam | ab7260 | 1/500 稀释 |
| 抗 beta III 微管蛋白（或 Tuj1）抗体 | Abcam | ab18207 | 1/1000 稀释 |
| 嗜铬粒蛋白 A | Abcam | ab15160 | 1/250 稀释 |
| ProtoGel 30% | National Diagnostics | EC-890 | 有毒，危险，请小心操作——使用时用 PBS 配制成 4% 溶液 |
| 十二烷基硫酸钠 | ThermoFischer Scientific | 28364 | PBS 中含 8% |
| Vectashield 封片介质 | Vector Laboratories | H-1000 |
参考文献
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 33....
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