小鼠下颌正畸牙齿移动过程中牙周膜胶原纤维的三维成像

摘要

我们介绍了一种在小鼠中诱导正畸牙齿移动的实验方案，以及无需切片即可对牙周膜中的胶原纤维和血管进行三维可视化的技术方法。

摘要

正畸牙齿移动是一种复杂的生物学过程，由外部施加的力引起软组织和硬组织的改建。为了理解这些复杂的组织改建过程，关键在于在三维环境下研究牙齿及牙周组织，从而最大限度地减少切片处理及由此产生的组织伪影。小鼠模型因其体型小、代谢率高、遗传背景清晰且易于操作，常被用于发育生物学、结构生物学以及生物力学研究。原则上，这些特性也使其成为牙齿相关研究的理想模型。然而，主要障碍在于其牙齿尺寸较小，尤其是磨牙。本文旨在提供一套逐步操作方案，用于建立小鼠下颌磨牙的正畸牙齿移动模型，并介绍两种对牙周膜纤维成分进行三维成像的方法。第一种方法基于显微CT系统，可实现对新鲜胶原组织的相位增强 成像。第二种方法为骨组织透明化技术，使用肉桂酸乙酯作为透明试剂，可在不切片的情况下实现透过骨组织的成像，并保留内源性荧光信号。将该透明化方法与报告基因小鼠（如Flk1-Cre;TdTomato）结合，首次实现了对牙周膜及牙槽骨中三维血管网络的成像。

引言

正畸牙齿移动（OTM）的基本生物学基础是骨重建过程。这一重建过程的触发因素被认为与牙周膜（PDL）结构的变化有关，例如细胞外基质（ECM）应力、坏死以及血管的破坏与形成^1,2,3。其他可能引发牙槽骨重建的因素还包括骨细胞对力的感知以及牙槽骨本身的机械形变；然而，这些因素在OTM中的具体作用仍尚未完全阐明^4,5。

尽管已有大量研究致力于揭示正畸牙齿移动（OTM）过程中牙周膜（PDL）的结构与功能关系，但其明确的功能机制尚未被阐明^6,7。造成这一现状的主要原因是获取位于两种硬组织（牙骨质和牙槽骨）之间的软组织（PDL）数据存在技术挑战。目前公认的研究方法通常需要对组织进行固定和切片，而这会破坏并改变PDL的原有结构。此外，大多数此类方法仅能提供二维数据，即使未发生形变，也仅能反映局部和有限的信息。由于PDL在结构和功能上具有非均一性，因此有必要采用一种能够完整呈现整个牙齿-PDL-骨复合体三维结构的研究方法。

方案

所有动物实验均严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》以及哈佛大学机构动物护理和使用委员会的指导方针（方案编号：01840）。

1. 正畸牙齿移动

1. 要制作小鼠卧床，需使用带有楔形、45°倾斜头枕的平板塑料平台。头枕可通过切割塑料盒制成。
   1. 将平台头部一端抬高，使头枕与台面之间形成约30°的夹角。固定一个弯曲的粗铁丝回形针（0.036）" （直径）固定在头部一端，用于夹持上切牙。
   2. 在尾端制作一个抬高的表面，用于附着正畸动力链，以固定下切牙。参见 图1 作为一个示例平台。
2. 通过麻醉小鼠 使用1 mL注射器和27 G针头，按10 mg/kg剂量腹腔注射赛拉嗪，按100 mg/kg剂量腹腔注射氯胺酮。
3. 将麻醉后的小鼠置于定制平台，通过将上门齿钩在回形针制成的环上固定上颌。使用正畸动力链钩住下门齿以打开小鼠下颌。用微型蜂鸟口腔拉钩保持颊部牵开。
4. 将平台置于手术显微镜或任何可达到5-6倍放大倍率的体视显微镜下。
5. 在小鼠眼睛上滴加50 µL生理盐水（约1滴），以防止角膜脱水。每20分钟补充一次生理盐水。
6. 剪取一段直径为0.08 mm的铝丝，长度为1 cm。使用显微外科持针器，将铝丝从第一与第二磨牙接....

结果

本文介绍了一种制备正畸牙移动（OTM）模型的方法，以及两种无需切片即可对牙周膜（PDL）内胶原纤维进行三维成像的技术。在动物实验中，当无需考虑牙齿排列时，只要牙齿移动能在牙根各水平诱导牙槽骨改建，即可视为正畸性移动。为产生可靠的正畸牙移动，需在牙齿上施加恒定的力值。本研究使用激活后的形状记忆镍钛（NiTi）螺旋弹簧，在7天或更长的实验时间内持续提供10 g的恒定力。此处所述的弹簧激活方式（图1）可在马氏体相状态下对NiTi弹簧产生应变，使其进入滞后状态，从而向牙齿持续施加恒定应力。在弹簧就位后使用固化灯加热，可确保合金转变为奥氏体相，实现形状记忆效应。

本研究展示了9周龄雄性小鼠的代表性结果。在施加正畸力7天后，通过显微CT以1倍放大倍数测量第一与第二磨牙牙冠近中-远中向牙槽骨之间的平均距离为40 µm（n=12，标准差= 15 µm）（图1E）。在正畸力施加前后，牙周膜（PDL）在近中-远中方向的平均宽度均为80 µm（

讨论

由于小鼠在体型、遗传和操作方面的优势，人们非常希望在小鼠中建立正畸牙移动（OTM）模型。使用下颌骨便于操作，无论是在组织解剖、样本制备还是成像方面均较为简便。本文介绍了一种在7天OTM周期内实现牙齿在骨内发生平移运动的方法。通过该方案，牙齿移动的总体持续时间可以延长，因为激活后的线圈可提供持续的力值 ，使牙齿移动距离达到约1 mm。然而，线圈的近中端固定在不断萌出的切牙上，因此力矢量会逐渐改变，并开始产生伸长力。若每隔7天对近中端的固位水平进行调整，即可避免这一问题。

牙周膜（PDL）是正畸牙齿移动（OTM）的启动者，因此了解其在OTM不同阶段的结构与功能具有重要意义。然而，牙周膜在结构和功能上均不均匀^19,22,31,32。因此，为了获得有意义的数据，必须在三维（3D）条件下研究牙周膜，并应尽可能避免对组织进行切片和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL BD Luer-Lok 注射器	BD	309628
1× 磷酸盐缓冲液	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof 乙醇	VWR Life Sciences	V1016
铝合金 5019 丝	Sigma-aldrich	GF15828813	直径 0.08 mm，长度 100th，硬态。用作磨牙周围的结扎丝。
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	用于分析 microCT 扫描图像
Castroviejo 显微持针器	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0, CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	用于二次谐波成像
锥形插座手柄，单头，手工成型	G.Hartzell and son	126-CSH3	检查镜的手柄
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	用于光片成像
Elipar DeepCure-S LED 固化灯	3M ESPE	76985
Eppendorf 带盖安全离心管，1.5 mL	Eppendorf	22363204
肉桂酸乙酯，>= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
皮下注射针头，27G × 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES 精密擦拭纸	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR 目录编号)	购自 VWR
LightSheet Z.1 双向照明显微镜系统	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	用于光片成像
LSM 880 NLO 多光子显微镜	Zeiss	LSM 880 NLO	用于双光子成像
MEGAmicro，平面，直径 5 mm，SS 螺纹	Hahnenkratt	6220	前表面检查镜
MicroCT 仪器，MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo 可流动复合树脂	Ultradent	948
操作平台	N/A	N/A	由实验室材料定制而成
常规体视显微镜 M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi 开放线圈弹簧	TOMY Inc.		直径 0.15 mm 的闭合 NiTi 线圈，内径 0.9 mm，提供 10 g 的力。类似产品可从 Dentsply Sirona 购买。
T-304 不锈钢结扎丝，直径 0.009''	Orthodontics	SBLW109	直径 0.009'' (0.23 mm)，软态
X-Ject E (赛拉嗪) 100 mg/mL	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 修复树脂，A2 色	3M ESPE	5904A2