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方法文章

小鼠下颌正畸牙齿移动过程中牙周膜胶原纤维的三维成像

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DOI：

10.3791/62149

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2021年4月15日

 ,  ,  , 
1Department of Oral Medicine, Infection and Immunity, School of Dental Medicine, Harvard University

本文内容

摘要

我们介绍了一种在小鼠中诱导正畸牙齿移动的实验方案，以及无需切片即可对牙周膜中的胶原纤维和血管进行三维可视化的技术方法。

摘要

正畸牙齿移动是一种复杂的生物学过程，由外部施加的力引起软组织和硬组织的改建。为了理解这些复杂的组织改建过程，关键在于在三维环境下研究牙齿及牙周组织，从而最大限度地减少切片处理及由此产生的组织伪影。小鼠模型因其体型小、代谢率高、遗传背景清晰且易于操作，常被用于发育生物学、结构生物学以及生物力学研究。原则上，这些特性也使其成为牙齿相关研究的理想模型。然而，主要障碍在于其牙齿尺寸较小，尤其是磨牙。本文旨在提供一套逐步操作方案，用于建立小鼠下颌磨牙的正畸牙齿移动模型，并介绍两种对牙周膜纤维成分进行三维成像的方法。第一种方法基于显微CT系统，可实现对新鲜胶原组织的相位增强 成像。第二种方法为骨组织透明化技术，使用肉桂酸乙酯作为透明试剂，可在不切片的情况下实现透过骨组织的成像，并保留内源性荧光信号。将该透明化方法与报告基因小鼠（如Flk1-Cre;TdTomato）结合，首次实现了对牙周膜及牙槽骨中三维血管网络的成像。

引言

正畸牙齿移动（OTM）的基本生物学基础是骨重建过程。这一重建过程的触发因素被认为与牙周膜（PDL）结构的变化有关，例如细胞外基质（ECM）应力、坏死以及血管的破坏与形成1,2,3。其他可能引发牙槽骨重建的因素还包括骨细胞对力的感知以及牙槽骨本身的机械形变；然而，这些因素在OTM中的具体作用仍尚未完全阐明4,5。

尽管已有大量研究致力于揭示正畸牙齿移动（OTM）过程中牙周膜（PDL）的结构与功能关系，但其明确的功能机制尚未被阐明6,7。造成这一现状的主要原因是获取位于两种硬组织（牙骨质和牙槽骨）之间的软组织（PDL）数据存在技术挑战。目前公认的研究方法通常需要对组织进行固定和切片，而这会破坏并改变PDL的原有结构。此外，大多数此类方法仅能提供二维数据，即使未发生形变，也仅能反映局部和有限的信息。由于PDL在结构和功能上具有非均一性，因此有必要采用一种能够完整呈现整个牙齿-PDL-骨复合体三维结构的研究方法。

本文将介绍一种在小鼠中生成OTM的方法，以及两种无需对样本进行切片即可实现牙周膜中胶原纤维三维可视化的方法。

小鼠模型被广泛用于 体内 医学、发育生物学、药物递送和结构研究中的实验。它们可通过基因改造来消除或增强特定蛋白质及其功能；具有快速、可重复且可预测的发育调控能力；同时由于体型微小，易于进行成像观察8尽管小鼠模型在牙科研究中具有诸多优势，但由于其牙齿尺寸较小，尤其是在需要进行临床操作时，该模型的使用并不普遍。因此，大鼠等动物模型9,10,11，狗12,13，猪14,15,16 和猴子17 比小鼠使用更频繁。随着高分辨率成像技术的近期发展，利用小鼠模型解析正畸牙移动（OTM）中复杂过程的优势愈发显著。本文介绍了一种在下颌磨牙中施加恒定力以诱导近中移动的方法 骨重建。大多数啮齿类动物的牙齿移动（OTM）实验均在上颌进行，因为下颌的活动性以及舌体的存在增加了实验的复杂程度。然而，当下颌需要保持三维结构完整性时，具有诸多优势：下颌骨可轻易作为完整骨骼进行解剖；在某些物种中，还可通过纤维性联合将下颌分离为两个半下颌。 它结构紧凑、扁平，仅包含牙齿而无任何窦腔。相比之下，上颌骨是颅骨的一部分，与其他器官和结构关系密切，因此需要进行广泛的切片才能分离出带有相关牙齿的牙槽骨。

通过使用自制的湿度控制舱，并将其与高分辨率显微CT内的加载系统耦合，实现相位增强成像，我们建立了一种方法，可对新鲜的纤维组织进行三维可视化，如先前研究所述9,18,19,20,21,22,23。新鲜组织在动物处死后立即扫描，无需任何染色或固定处理，从而减少了组织伪影以及 生物力学特性的改变。这些三维数据可用于纤维分布与取向的分析，具体方法见其他文献19。

本文介绍的第二种3D全组织成像方法基于下颌骨的光学透明化技术，该技术能够在不进行任何切片的情况下，实现通过骨组织对牙周膜纤维的成像。有趣的是，该方法还可用于观察骨组织自身的胶原纤维，但本文不对此进行讨论。总体而言，组织透明化有两种方法。第一种是基于水相的透明化方法，即将样本浸入折射率高于1.4的水溶液中，可通过简单浸泡、过度水合或水凝胶包埋实现。然而，该方法在透明程度以及组织结构的保存方面存在局限性，因此需要对组织进行固定。第二种方法为基于溶剂的透明化方法24,25，可获得高度透明的样本，且无需固定。我们针对下颌骨样本建立了一种基于肉桂酸乙酯（ethyl cinnamate, ECi）的改良型溶剂透明化方法。该方法具有使用无毒食品级透明剂、组织收缩极小以及能够保存荧光蛋白等优点。

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方案

所有动物实验均严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》以及哈佛大学机构动物护理和使用委员会的指导方针（方案编号：01840）。

1. 正畸牙齿移动

  1. 要制作小鼠卧床，需使用带有楔形、45°倾斜头枕的平板塑料平台。头枕可通过切割塑料盒制成。
    1. 将平台头部一端抬高，使头枕与台面之间形成约30°的夹角。固定一个弯曲的粗铁丝回形针（0.036）" （直径）固定在头部一端，用于夹持上切牙。
    2. 在尾端制作一个抬高的表面，用于附着正畸动力链，以固定下切牙。参见 图1 作为一个示例平台。
  2. 通过麻醉小鼠 使用1 mL注射器和27 G针头，按10 mg/kg剂量腹腔注射赛拉嗪，按100 mg/kg剂量腹腔注射氯胺酮。
  3. 将麻醉后的小鼠置于定制平台，通过将上门齿钩在回形针制成的环上固定上颌。使用正畸动力链钩住下门齿以打开小鼠下颌。用微型蜂鸟口腔拉钩保持颊部牵开。
  4. 将平台置于手术显微镜或任何可达到5-6倍放大倍率的体视显微镜下。
  5. 在小鼠眼睛上滴加50 µL生理盐水（约1滴），以防止角膜脱水。每20分钟补充一次生理盐水。
  6. 剪取一段直径为0.08 mm的铝丝，长度为1 cm。使用显微外科持针器，将铝丝从第一与第二磨牙接触点下方的邻间隙由颊侧向舌侧穿入。在第一磨牙前方预留2 mm的自由端，以便穿入弹簧末端。
  7. 剪取一段镍钛（NiTi）合金线圈，长度约为7至9圈。
    注意：该弹簧线圈的弹性性能可为正畸移动提供持续的力。线圈的总未拉伸长度应短于切牙与磨牙之间的间隙。需注意，为将线圈固定在牙齿上，每端需额外预留2圈。选用铝丝是为了减少显微CT扫描过程中诸如射束硬化等扫描伪影。
  8. 在下颌第一磨牙与下颌切牙之间置入镍钛螺旋弹簧（0.15 mm丝径，0.9 mm弹簧内径；提供10 g力）。利用1.6步骤中缠绕在第一磨牙上的结扎丝，将其紧密缠绕在螺旋弹簧的两圈上，以固定弹簧在磨牙侧的位置。
  9. 为确保受力均匀，在第一磨牙与切牙之间使用恰好3根处于激活状态的结扎丝。暂时将动力链从切牙上取下，将2至3根未受张力的结扎丝绕过切牙以固定弹簧圈。将结扎丝向下滑动至切牙的游离龈缘处。
  10. 在螺旋丝的切缘处放置一层可流动的复合树脂，并用牙科光固化灯固化。树脂固化后，更换动力链。
  11. 使用相同的固化灯，加热镍钛线圈20秒，以使镍钛线圈收紧。最终就位情况如图所示 图1C.
  12. 保留对侧结构完整，或在第一根与第二根之间插入假装置（如金属丝） 第二磨牙
  13. 将麻醉后的小鼠置于加热光源下，保持小鼠体温直至恢复。
  14. 将小鼠放回单独的笼子中，并每天进行监测。在正畸移动过程中无需改变饮食。
    注意：在动物一侧使用OTM装置可能会引起一定程度的不适，但不会影响进食。由于不适感增加，不建议在两侧同时插入装置。除非出现明显的疼痛症状，否则无需使用止痛药物。

2. 新鲜半下颌骨中牙周膜纤维的显微CT扫描

  1. 安装半下颌骨（图2）
    1. 在正畸移动达到所需时间后，通过颈椎脱位法处死小鼠。取出下颌骨并分离为两个半下颌骨。
      ​注意：由于样本不会被固定，因此必须尽快进行颌骨解剖和安装操作，最好在30分钟内完成。
    2. 使用洁净的无绒擦拭布轻轻去除周围软组织。
    3. 在至少4倍放大倍率的体视显微镜下，使用显微外科剪刀和镊子移除正畸装置。
    4. 将样本保存在1.5 mL体积的微量离心管中，并与一块用水润湿的无绒擦拭布一同保持湿润。
    5. 将可填充的牙科复合树脂填入载物台上的样本槽中，然后将新鲜的半下颌骨放入复合树脂内。安装前请确保与牙科复合树脂接触的骨面无任何软组织残留且保持干燥，否则牙科复合树脂无法正常固化。
    6. 调整半下颌骨的位置，使第一磨牙位于载物台中线沟槽的中央位置，并确保咬合面水平。当位置满意后，对复合树脂进行固化。
      注意：可在半下颌骨两侧和/或切牙上方添加少量牙科复合树脂，以帮助稳定样本。
    7. 将湿润的无绒擦拭布放入载物台的湿度池中。在第一磨牙的咬合面上放置牙科复合树脂。关闭成像室前，确保在样本层面没有任何物体阻挡X射线路径。
    8. 将成像室固定在微计算机断层扫描仪（micro-CT）上。将成像室旋紧至micro-CT载物台上，以最大限度减少成像过程中的移动。
    9. 开启X射线，同时垂直下移砧板，拍摄二维图像，直至砧板尖端被复合树脂包围但未检测到压力增加为止。
    10. 一旦砧板嵌入复合树脂中，关闭X射线源。然后打开micro-CT成像室，通过透明的有机玻璃窗口对复合树脂进行固化。
  2. micro-CT设置
    1. 将X射线源电压设为40 kV，电流设为200 µA。使用10倍放大倍率的探测器，将样本置于视野范围内。采集图像时使用2×2像素合并（binning=2）。
      注意：由于牙周膜（PDL）的密度显著低于骨组织和牙体组织，因此观察PDL需要更高的功率和更长的曝光时间。本方案提供的参数设置适用于PDL的可视化成像。
    2. 单帧图像曝光时间设为25秒。设置载物台旋转角度范围为183度或更大。扫描设置为采集2500个投影图像。不使用任何X射线源滤片，所得扫描图像的体素尺寸为每边0.76 µm。
    3. 根据micro-CT操作指南采集参考扫描图像用于正确重建。参考图像数量应为总投影数的1/3。使用滤波反投影算法进行三维体积重建，重建过程中不再进行额外的像素合并。

3. 透明化方法（图3）

  1. 准备五个 1.5 mL 微型离心管。
  2. 在 1.5 mL 微型离心管中分别准备 1.4 mL 以下溶液：磷酸盐缓冲液（PBS）中含 4% 多聚甲醛（PFA）、去离子水（DI 水）中含 50% 乙醇（EtOH）、去离子水中含 70% EtOH，以及两管 100% EtOH。
    注意：PFA 用于样本固定。ECi 透明化方法也可用于未固定的样本。若处理未固定样本，可直接跳过 PFA 步骤。
  3. 将解剖得到的半下颌骨放入 4% PFA 溶液中，用铝箔包裹后置于摇床上，室温、轻柔振荡条件下固定 6 小时。
  4. 将半下颌骨转移至 50% EtOH 溶液中，避光条件下在摇床上振荡 16 小时。
  5. 将半下颌骨转移至 70% EtOH 溶液中，避光条件下在摇床上振荡 16 小时。
  6. 将半下颌骨转移至 100% EtOH 溶液中，避光条件下在摇床上振荡 16 小时。
  7. 将步骤 3.6 重复一次，使用第二个 100% EtOH 管。
  8. 在玻璃或聚丙烯管中配制 5 mL ECi 溶液。
    注意：ECi 可溶解聚苯乙烯，但不溶解聚丙烯。此外，若组织不含荧光蛋白，透明化过程中样本可暴露于光照下。
  9. 将半下颌骨转移至 ECi 管中，用铝箔包裹管子，置于摇床上轻柔振荡，至少 12 小时。
    注意：本步骤可暂停。脱水后的样本可在室温下保存于 ECi 中。ECi 的凝固点或熔点为 6.5 至 8.0 °C，切勿在 4 °C 下保存。
  10. 半下颌骨现已准备好用于荧光显微镜成像。
    注意：成像过程中，样本必须浸没在 ECi 中以保持光学透明性。

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结果

本文介绍了一种制备正畸牙移动（OTM）模型的方法，以及两种无需切片即可对牙周膜（PDL）内胶原纤维进行三维成像的技术。在动物实验中，当无需考虑牙齿排列时，只要牙齿移动能在牙根各水平诱导牙槽骨改建，即可视为正畸性移动。为产生可靠的正畸牙移动，需在牙齿上施加恒定的力值。本研究使用激活后的形状记忆镍钛（NiTi）螺旋弹簧，在7天或更长的实验时间内持续提供10 g的恒定力。此处所述的弹簧激活方式（图1）可在马氏体相状态下对NiTi弹簧产生应变，使其进入滞后状态，从而向牙齿持续施加恒定应力。在弹簧就位后使用固化灯加热，可确保合金转变为奥氏体相，实现形状记忆效应。

本研究展示了9周龄雄性小鼠的代表性结果。在施加正畸力7天后，通过显微CT以1倍放大倍数测量第一与第二磨牙牙冠近中-远中向牙槽骨之间的平均距离为40 µm（n=12，标准差= 15 µm）（图1E）。在正畸力施加前后，牙周膜（PDL）在近中-远中方向的平均宽度均为80 µm（

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讨论

由于小鼠在体型、遗传和操作方面的优势，人们非常希望在小鼠中建立正畸牙移动（OTM）模型。使用下颌骨便于操作，无论是在组织解剖、样本制备还是成像方面均较为简便。本文介绍了一种在7天OTM周期内实现牙齿在骨内发生平移运动的方法。通过该方案，牙齿移动的总体持续时间可以延长，因为激活后的线圈可提供持续的力值 ，使牙齿移动距离达到约1 mm。然而，线圈的近中端固定在不断萌出的切牙上，因此力矢量会逐渐改变，并开始产生伸长力。若每隔7天对近中端的固位水平进行调整，即可避免这一问题。

牙周膜（PDL）是正畸牙齿移动（OTM）的启动者，因此了解其在OTM不同阶段的结构与功能具有重要意义。然而，牙周膜在结构和功能上均不均匀19,22,31,32。因此，为了获得有意义的数据，必须在三维（3D）条件下研究牙周膜，并应尽可能避免对组织进行切片和...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIDCR R00-DE025053，项目负责人：Naveh）资助。我们感谢哈佛生物成像中心提供的基础设施和支持。所有图示均使用biorender.com生成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL BD Luer-Lok 注射器BD309628
1× 磷酸盐缓冲液VWR Life Sciences0780-10L
200 proof 乙醇VWR Life SciencesV1016
铝合金 5019 丝Sigma-aldrichGF15828813直径 0.08 mm，长度 100th，硬态。用作磨牙周围的结扎丝。
Avizo 9.7Thermo Fisher ScientificN/A用于分析 microCT 扫描图像
Castroviejo 显微持针器Fine Science Tools12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0, CorrVIS-IR M27 85mmZeissN/A用于二次谐波成像
锥形插座手柄，单头，手工成型G.Hartzell and son126-CSH3检查镜的手柄
EC Plan-Neofluar 5x/0.16Zeiss440321-9902用于光片成像
Elipar DeepCure-S LED 固化灯3M ESPE76985
Eppendorf 带盖安全离心管，1.5 mLEppendorf22363204
肉桂酸乙酯，>= 98%Sigma-aldrichW243000-1KG-K
皮下注射针头，27G × 1/2''BD305109
Ketathesia 100 mg/mLHenry Schein Animal HealthNDC:11695-0702-1
KIMWIPES 精密擦拭纸Kimberly-Clark21905-026 (VWR 目录编号)购自 VWR
LightSheet Z.1 双向照明显微镜系统ZeissLightSheet Z.1/LightSheet 7用于光片成像
LSM 880 NLO 多光子显微镜ZeissLSM 880 NLO用于双光子成像
MEGAmicro，平面，直径 5 mm，SS 螺纹Hahnenkratt6220前表面检查镜
MicroCT 仪器，MicroXCT-200XradiaMICRO XCT-200
Mini-ColibriFine Science Tools17000-01
PermaFlo 可流动复合树脂Ultradent948
操作平台N/AN/A由实验室材料定制而成
常规体视显微镜 M80Leica MicosystemsM80
Sentalloy NiTi 开放线圈弹簧TOMY Inc.直径 0.15 mm 的闭合 NiTi 线圈，内径 0.9 mm，提供 10 g 的力。类似产品可从 Dentsply Sirona 购买。 
T-304 不锈钢结扎丝，直径 0.009''OrthodonticsSBLW109直径 0.009'' (0.23 mm)，软态
X-Ject E (赛拉嗪) 100 mg/mLHenry Schein Animal HealthNDC:11695-7085-1
Z100 修复树脂，A2 色3M ESPE5904A2

参考文献

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