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方法文章

通过免疫染色与原位杂交联合检测小鼠嗅觉感觉神经元的激活 原位 杂交

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DOI：

10.3791/62150

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2021年4月11日

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

本文内容

摘要

本方案结合 原位 通过化学刺激激活小鼠嗅觉感觉神经元后，利用原位杂交与免疫荧光联合技术鉴定其表达的嗅觉及犁鼻器受体基因。

摘要

动物依赖化学通讯来传递和感知相关的环境信息，这些信息范围从食物质量的评估到可利用的交配伙伴或威胁的探测。在小鼠中，这一功能主要由嗅觉系统及其下属的亚系统（包括主嗅觉系统和副嗅觉系统）来执行。这两个系统均具有外周器官，其内分布着表达G蛋白偶联受体的感觉神经元，这些受体能够结合到达鼻腔的化学信号分子。尽管这些受体的分子特性已被广泛阐明，但对其特异性配体的了解仍十分有限。本文所述方法结合了原位杂交技术对嗅觉或犁鼻器受体的检测，以及对磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）——一种神经元激活标志物——的免疫检测。 原位 嗅觉或犁鼻器受体的原位杂交检测与磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）免疫检测相结合——pS6是神经元激活的标志物。该方案旨在鉴定嗅觉器官检测到纯化或复杂化学刺激后，在单次暴露事件中被激活的神经元。重要的是，该技术可用于研究在生物学相关情境下被触发的神经元。理想情况下，该方法可用于探究嗅觉系统的分子生物学机制以及嗅觉相关行为。

引言

化学通讯是动物界中最普遍的交流形式。在哺乳动物中，化学信号的检测主要通过嗅觉实现，对寻找食物、定位潜在交配对象以及躲避潜在捕食者至关重要1,2,3。小鼠的嗅觉系统进一步划分为不同的亚系统，每个亚系统具有独特的解剖学、生理学和分子特性4。其中，主嗅觉系统（MOS）和副嗅觉系统（AOS）是目前研究最广泛且特征最清晰的两个系统。

主嗅觉系统（MOS）主要负责检测到达鼻腔的挥发性化学分子。这一功能由主嗅觉上皮（MOE）中的嗅觉感觉神经元（OSNs）实现，OSNs构成了该系统的感觉界面。每个OSN以单基因和单等位基因的方式表达数千种嗅觉受体（ORs）中的一种5。此外，ORs通常具有较宽的调谐特性6，单个气味分子可结合多种OR，从而形成气味的组合编码7。

而副嗅觉系统（AOS）主要负责信息素和克里摩那素的检测。这些配体可激活犁鼻器（VNO）中的犁鼻感觉神经元（VSNs）。位于VNO顶端区域的VSNs表达犁鼻受体1家族（V1Rs）8，而基底层的神经元则表达犁鼻受体2家族（V2Rs）9。重要的是，已有研究表明部分VSNs可同时表达一种以上的犁鼻受体10,11,12。

尽管目前已掌握大量关于ORs和VRs的分子特征信息，但对其相应配体的了解仍然十分有限。确定负责检测特定分子或复杂刺激的嗅觉神经元是嗅觉、嗅觉驱动行为及生理反应研究领域的重要任务。为实现嗅觉受体的去孤儿化，已尝试多种策略，包括钙成像7单细胞RNA测序13,14异源受体表达15以及基于即刻早期基因（IEGs）的策略16最近，一些技术已被用于评估气味物质对感觉神经元的调节作用，使用 体内 钙成像17,18 以及荧光蛋白标记的单细胞RNA测序策略19大多数这些技术需要人工设置，或在分离的神经元上进行，因此无法同时评估由所用气味引发的行为反应。

本方案通过结合检测特定嗅觉受体（ORs）或犁鼻器受体（VRs）的核糖探针与磷酸化核糖体蛋白 S6（pS6）的免疫检测——一种神经元激活的替代标志物，实现对单次气味暴露后被激活的感觉神经元进行鉴定。该方法是一种可靠的技术，可用于在具有生物学意义的背景下研究不同化学信号所激活的感觉神经元的身份特征。

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方案

动物实验程序均依照坎皮纳斯大学（生物研究所机构动物护理和使用委员会——动物实验研究伦理委员会）批准的动物实验方案 #1883-1 进行，该方案遵循巴西联邦动物实验控制国家委员会（CONCEA）制定的指导方针。

1. 材料准备

  1. 在1× PBS中配制1 L的3% H2O2（v/v）。将100 mL 10× PBS和100 mL 30% H2O2加入500 mL超纯水中，再用超纯水定容至1 L。该溶液需现用现配。
  2. 准备一个加湿染色缸，内置用5× SSC溶液润湿的无尘实验室擦拭纸片。
  3. 配制杂交洗涤液：5× SSC（55 °C）、2× SSC（55 °C）、0.2× SSC（55 °C）和0.1× SSC（55 °C及室温）。将适当体积的20× SSC储备液溶于无RNase的超纯水中。每次实验开始前需新鲜配制稀释后的溶液。
  4. 配制免疫组织化学封闭液：1× PBS/1% BSA/0.1% Triton X-100。配制100 mL时，将10 mL 10× PBS、10 mL 10% BSA和3.33 mL 3% Triton X-100加入70 mL超纯水中，再用超纯水定容至100 mL。每次实验开始前需新鲜配制。
  5. 配制PTw溶液：1× PBS/0.1% Tween-20。配制100 mL时，将1 mL 10% Tween-20和10 mL 10× PBS加入70 mL超纯水中，再用超纯水定容至100 mL。每次实验开始前需新鲜配制。
  6. 配制无RNase的0.1 M三乙醇胺溶液。配制250 mL时，在200 mL无RNase的超纯水中加入3.33 mL分析纯三乙醇胺，并在搅拌下溶解（配制时需使用无RNase的玻璃器皿和磁力搅拌器）。用HCl调节pH至8.0，再用无RNase的超纯水定容，并避光保存至使用。每次实验开始前需新鲜配制。
  7. 在1× PBS中配制无RNase的0.1% H2O2（v/v）。配制1 L时，将100 mL 10× PBS和3.3 mL 30% H2O2加入500 mL无RNase的超纯水中，再用无RNase的超纯水定容至1 L。该溶液需现用现配。
  8. 准备以下无RNase的溶液：0.2 M HCl；1 M Tris-HCl（pH 8.0）；10 mg/mL酵母tRNA；10% SDS；10× PBS；100× Denhardt's溶液；20× SSC；50%硫酸葡聚糖；6 M HCl。
  9. 配制无RNase的4%多聚甲醛固定液。配制100 mL时，将4 g多聚甲醛溶于80 mL 1× PBS中，用10 M NaOH调节pH至7.4，再用1× PBS定容至100 mL。该溶液必须在每次实验开始前新鲜配制。
    注意：多聚甲醛为有害物质，吸入可能造成伤害。应在通风橱中配制，并佩戴防护手套、口罩和护目镜。
  10. 配制无RNase的解剖液：30%蔗糖/0.45 M EDTA（pH 8.0）/1× PBS。配制100 mL时，将30 g蔗糖溶于60 mL无RNase的0.5 M EDTA（pH 8.0）中，加入10 mL 10× PBS，再用无RNase的0.5 M EDTA（pH 8.0）定容至100 mL。
  11. 准备无RNase的玻璃或塑料量筒和烧杯。
  12. 配制无RNase的预杂交液和杂交液：50%去离子甲酰胺（v/v）/600 mM NaCl/200 μg/mL酵母tRNA/0.25% SDS（w/v）/10 mM Tris-HCl（pH 8.0）/1× Denhardt's溶液/1 mM EDTA（pH 8.0）/10%硫酸葡聚糖（w/v）。在量筒中配制10 mL时，依次加入5 mL去离子甲酰胺、1.2 mL 5 M NaCl、200 μL 10 mg/mL酵母tRNA、250 μL 10% SDS、100 μL 1 M Tris-HCl（pH 8.0）、200 μL 50× Denhardt's溶液、20 μL 500 mM EDTA（pH 8.0）和2 mL 50%硫酸葡聚糖（分子量500,000），再用无RNase的超纯水定容至10 mL。每次实验开始前需新鲜配制。
    注：硫酸葡聚糖黏度较高，建议额外多配制20%的总体积以补偿移液误差。可根据需要省略预杂交液中的酵母tRNA。
  13. 准备热塑性实验室薄膜盖片。将热塑性薄膜裁成比载玻片长宽各小1-2 mm的矩形片。
  14. 配制TN缓冲液：100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl。配制100 mL时，将10 mL 1 M Tris-HCl（pH 7.5）和3 mL 5 M NaCl加入70 mL超纯水中，再用超纯水定容至100 mL。每次实验开始前需新鲜配制。
  15. 配制TNB封闭缓冲液：在TN缓冲液中加入0.5%封闭试剂A（w/v）。配制200 mL时，将1 g封闭试剂A溶于200 mL TN缓冲液中（封闭试剂A的商业来源见材料表）。
  16. 配制TNT缓冲液：在TN缓冲液中加入0.05% Tween-20。配制1 L时，将5 mL 10% Tween-20加入950 mL TN缓冲液中，再缓慢加入TN缓冲液至1 L以避免起泡。每次实验开始前需新鲜配制。
  17. 配制Tyramide-Alexa 488工作液：1×扩增缓冲液A/0.0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488。配制100 μL时，将1 μL 0.15% H2O2和1 μL tyramide-Alexa 488加入98 μL扩增缓冲液A中（tyramide-Alexa 488和扩增缓冲液A的商业来源见材料表）。该溶液需现用现配。
  18. 配制Tyramide-Alexa 555工作液：1×扩增缓冲液A/0.0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555。配制100 μL时，将1 μL 0.15% H2O2和1 μL tyramide-Alexa 555加入98 μL扩增缓冲液A中（tyramide-Alexa 555和扩增缓冲液A的商业来源见材料表）。该溶液需现用现配。
  19. 配制Tyramide-biotin工作液：1×扩增缓冲液B/0.0015% H2O2/1:50 tyramide-biotin。配制100 μL时，将1 μL 0.15% H2O2和2 μL tyramide-biotin加入97 μL扩增缓冲液B中（tyramide-biotin和扩增缓冲液B的商业来源见材料表）。该溶液需现用现配。
  20. 将玻璃器皿在200 °C下烘烤至少4小时。对不可重复使用的塑料器皿（包括载玻片架、柯普林瓶和注射器）用3% H2O2处理15-30分钟，再用无RNase的水彻底冲洗。对不锈钢金属器械（如解剖工具、镊子和冷冻切片机样品夹）用3% H2O2处理15分钟，再用无RNase的水彻底冲洗。用RNase清除剂清洁实验台面、加热板和干浴器。

2. 核糖探针合成

注意：以下为合成1 kb地高辛标记的cRNA探针的步骤 原位 原位杂交通过 体外 转录基于先前发表的方案20,21,22,23.

  1. 使用适当的寡核苷酸引物对从目标基因（例如，嗅觉受体基因）中扩增出一段1 kb的DNA片段。应选择能够扩增出存在于待检测成熟mRNA中的区域的引物对（例如，基因的编码序列）。不同嗅觉受体的引物组合列于 材料表有关检测其他犁鼻嗅觉受体探针的详细信息，请参阅先前的出版物16,21.
  2. 在0.8%琼脂糖凝胶上电泳PCR产物，并切下目标1 kb条带。
  3. 使用合适的基于微型柱的凝胶回收试剂盒，按照制造商的说明书纯化DNA片段。
  4. 定量纯化的DNA片段，并根据制造商说明书将其克隆至合适的PCR克隆载体中。建议使用含有T7和SP6 RNA聚合酶启动子的克隆载体，以使插入的扩增片段两侧被这些启动子包围。
  5. 根据制造商方案，通过化学转化或电穿孔法将重组质粒转化至无重组能力的感受态细菌中。
  6. 将分离的转化细菌菌落接种于富集培养基中，按照试剂盒说明书通过质粒DNA小量提取法分离质粒。
  7. 根据制造商的说明书，使用合适的限制性内切酶进行限制性消化分析和/或Sanger测序，以检测插入DNA片段的身份和方向。
  8. 进行限制性酶切以实现线性化 10 μg 使用适当的限制性内切酶对质粒进行酶切。为制备反义核糖探针，随后 体外 转录时，使用一种限制性内切酶，在插入片段的末端（与位于基因编码序列下游的RNA聚合酶启动子相对的一端）切割质粒DNA，以生成正义链核糖探针。 体外 转录时，使用一种限制性内切酶，在插入片段中位于基因编码序列上游的RNA聚合酶启动子相对端的末端处切割质粒DNA。
  9. 将质粒线性化反应产物的等分试样在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。确认线性化完全后，按照制造商方案，使用基于柱子的PCR纯化试剂盒纯化剩余反应产物。
  10. 合成地高辛标记的cRNA探针 体外 使用1-进行转录2 μg 以线性化的质粒为模板，选用适当的酶（如T7或SP6 RNA聚合酶）以及合适的地高辛（DIG）标记试剂盒。
  11. 通过使用 DNase I 消化反应中的 DNA 模板以将其去除 37 °C 30分钟。
  12. 使用基于微型柱的RNA纯化试剂盒或基于凝胶过滤的纯化试剂盒纯化cRNA探针。将所得探针洗脱于 50 μL 无RNase水。
  13. 使用荧光测定法对所得的核糖探针进行定量，最好采用荧光测定方法。通常，预期产量高于 100 ng/μL.
  14. 在自动化电泳系统或无RNase的0.8%琼脂糖凝胶上运行核糖探针，以检测探针质量和是否降解。
  15. 将合成的探针储存在 -80 °C 直到需要时

3. 小鼠对嗅觉刺激的暴露

  1. 在暴露前至少 24 小时，将每只动物单独饲养于清洁的笼子中。暴露前至少 2 小时移除食物格栅。本研究中使用的所有动物均为 8–12 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠（平均体重：20 g）。
  2. 准备适当的嗅觉刺激物。可使用不同的刺激物来激活主嗅上皮（MOE）或副嗅器官（VNO）中的嗅觉神经元。有关嗅觉刺激物的完整列表，请参阅其他出版物3, 16, 22,23,24。液体刺激物（如化学溶液、尿液或重组蛋白溶液）可滴加在医用纱布或棉球上。
  3. 将嗅觉刺激物放入笼内，让动物不受干扰地暴露 1 小时。
  4. 处死小鼠，并使用无 RNase 的解剖工具迅速解剖 MOE 或 VNO 组织。

4. 组织解剖与冷冻

  1. 在体视显微镜下使用解剖液解剖MOE或VNO。
    1. 对于犁鼻器，去除较厚的鼻中隔骨，保留围绕该器官的较软的软骨壳。
  2. 准备样本以进行冷冻切片。
    1. 用吸水纸将样本吸干，然后放入含有包埋介质的组织学塑料模具中。
    2. 对于犁鼻器，使用1 mL注射器将每个器官垂直排列，并将其拉至塑料模具的底部图1A).
    3. 对于MOE，将其置于塑料模具底部，筛板朝下。
    4. 去除标本周围的气泡，因为这些气泡可能会影响切片。
    5. 将标本置于干冰上冷冻。
    6. 将样本块保存在 -80 °C.
      注意：冷冻样本可在切片前保存数月。
  3. 进行冷冻切片。
    1. 打开冷冻切片机，并将温度设置为 -23 °C 至少在使用前4小时。
    2. 从组织学塑料模具中取出冷冻组织块，并用剃刀片修整。
    3. 标本周围保留 5 mm 空间，以便于切片操作（图1B).
    4. 使用包埋介质将组织块固定于冷冻切片机的样品夹上。
    5. 收集 16 μm 切片置于带正电荷的显微镜载玻片上。
    6. 将载玻片保存于 -80 °C.
      ​注意：载玻片可保存在 -80 °C 数月之前 原位 杂交

5. 分步操作 原位 杂交实验方案

  1. 使用吹风机将载玻片干燥10分钟。先用暖风对载玻片进行解冻，然后切换至室温风，直至包埋介质变为不透明。
  2. 每张载玻片加入500 μL无RNase的4%多聚甲醛固定液，在23–26 °C下孵育15分钟，以固定组织切片。
  3. 用无RNase的1× PBS缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  4. 每张载玻片加入500 μL无RNase的0.2 M HCl溶液，在23–26 °C下孵育10分钟。
  5. 用无RNase的1× PBS缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  6. 每张载玻片加入500 μL无RNase的0.1% H2O2/1× PBS溶液，在23–26 °C下孵育30分钟。此步骤需在避光条件下进行，以防止过氧化氢因光照而降解。
  7. 用无RNase的1× PBS缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  8. 将载玻片转移至含有250 mL无RNase的0.1 M三乙醇胺缓冲液（pH 8.0）和磁力搅拌子的广口瓶中，在通风橱内进行乙酰化处理。在持续搅拌下加入625 μL乙酸酐，随后降低搅拌速度，再逐滴加入另外625 μL至载玻片表面，然后停止搅拌，孵育10分钟。
  9. 用无RNase的1× PBS缓冲液洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  10. 在60 °C的无RNase 1× PBS缓冲液中洗涤载玻片一次，持续5分钟。
  11. 进行预杂交处理：依次将载玻片从1× PBS中取出，用无尘实验室纸巾轻轻吸干。每张载玻片上加样400 μL预杂交液，并将其置于已预热至60 °C的湿盒中（可置于水浴或加热烘箱内），在60 °C下孵育1小时。
  12. 将足够量的杂交液加热至60 °C，按每张载玻片200 μL分装至微量离心管中，随后加热至85 °C并维持10分钟。
  13. 向各杂交液管中加入适量的cRNA探针（每种探针终浓度为1 μg/mL），在85 °C下变性5分钟。
  14. 进行杂交：依次从湿盒中取出一张载玻片，吸干后置于60 °C加热板上。每张载玻片加入200 μL含核糖探针的杂交液，并加盖玻璃盖玻片。在60 °C湿盒中孵育12–16小时。
    注意：预杂交后切勿让载玻片冷却。每种探针的杂交温度需通过实验确定；60 °C可作为起始温度，通常适用于长度为1 kb的探针。
  15. 将不同瓶中的SSC洗涤液加热至55 °C，并将其置于相应温度的水浴中备用。
  16. 杂交完成后，将载玻片放入盛有55 °C 5× SSC溶液的水浴中，轻轻取下盖玻片。将每张载玻片水平持于温热的SSC溶液中，待盖玻片脱落时倾斜载玻片，使其自然滑落至容器底部。
  17. 在载玻片染色缸中用2× SSC溶液于55 °C洗涤30分钟。
  18. 在载玻片染色缸中用0.2× SSC溶液于55 °C洗涤20分钟。
  19. 在载玻片染色缸中用0.1× SSC溶液于55 °C洗涤20分钟。
  20. 转移至23–26 °C的0.1× SSC溶液中，在载玻片染色缸中孵育3分钟。
  21. 在载玻片染色缸中用PTw缓冲液洗涤10分钟。
  22. 在载玻片染色缸中用TN缓冲液洗涤两次，每次5分钟。
  23. 每张载玻片加入600 µL TNB封闭缓冲液，在23–26 °C下孵育3小时。
  24. 每张载玻片加入500 µL一抗溶液（以TNB缓冲液按1:400稀释的辣根过氧化物酶标记抗DIG抗体），小心覆盖一层热塑性实验室薄膜，于4 °C孵育12–16小时。
  25. 在载玻片染色缸中用TNT缓冲液轻轻搅拌洗涤6次，每次5分钟。
  26. 每张载玻片加入100 µL酪胺-生物素工作液，加盖热塑性实验室薄膜盖片，在23–26 °C下孵育12分钟。
    注意：此孵育步骤应分批进行（每批2–3张载玻片），以便精确控制孵育时间。酪胺孵育时间可能需要根据cRNA探针的灵敏度和浓度进行优化。
  27. 在载玻片染色缸中用TNT缓冲液轻轻搅拌洗涤6次，每次5分钟。
  28. 每张载玻片加入200 µL含辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP，以TNB缓冲液按1:100稀释）的溶液，加盖热塑性实验室薄膜盖片，在23–26 °C下孵育1小时。
  29. 在载玻片染色缸中用TNT缓冲液轻轻搅拌洗涤6次，每次5分钟。
  30. 每张载玻片加入100 μL酪胺-Alexa 488工作液，加盖热塑性实验室薄膜盖片，在避光条件下于23–26 °C孵育12分钟。
  31. 在载玻片染色缸中用TNT缓冲液轻轻搅拌洗涤6次，每次5分钟。
  32. 在载玻片染色缸中用3% H2O2/1× PBS溶液孵育1小时，以灭活前步反应中残留的过氧化物酶。
  33. 在载玻片染色缸中用TNT缓冲液轻轻搅拌洗涤6次，每次5分钟。

6. pS6 免疫染色

  1. 向每张载玻片上加入 500 μL 的 4% 多聚甲醛/1× PBS 溶液，在 23–26 °C 下孵育 15 分钟，以固定组织切片。
  2. 向每张载玻片上加入 500 μL 的 1× PBS/0.1% Triton X-100 溶液，孵育 5 分钟，以通透组织切片。
  3. 在载玻片染色缸中用 1× PBS 洗涤两次。
  4. 每张切片加入 2–3 滴商品化的酪胺信号放大封闭液 B（材料表），在 23–26 °C 下孵育 1 小时。
  5. 向每张载玻片上加入 400 μL 免疫组织化学封闭液，在 23–26 °C 下孵育 30 分钟，以封闭组织切片。
  6. 向每张载玻片上加入 200 μL 兔抗 pS6 一抗溶液（用免疫组织化学封闭液按 1:200 稀释；终浓度为 1 μg/mL），覆盖一层热塑性实验室封口膜，于 4 °C 孵育 12–16 小时。
  7. 在载玻片染色缸中用 1× PBS/0.1% Triton X-100 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  8. 每张载玻片加入 2–3 滴商品化的辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗溶液（材料表），在 23–26 °C 下孵育 1.5 小时。
  9. 在载玻片染色缸中用 1× PBS/0.1% Triton X-100 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  10. 吸干载玻片，每张加入 100 至 200 μL 酪胺-Alexa 555 工作液，覆盖一片热塑性实验室封口膜，在避光条件下孵育 7 分钟。
  11. 在载玻片染色缸中用 1× PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
  12. 向每张载玻片上加入 500 μL 核染色液（溶于 1× PBS 中），在 23–26 °C 下孵育 30 分钟。
  13. 在载玻片染色缸中用 1× PBS 于 23–26 °C 洗涤两次，每次 5 分钟。
  14. 用抗荧光淬灭封片剂封片，并在避光条件下静置 24 小时使封片剂固化。
  15. 将载玻片储存在适当温度下直至成像，以避免荧光淬灭。

7. 显微成像

  1. 使用配备适用于所用荧光染料滤光片的落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察切片。

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结果

本方案旨在获取显微图像，其中实验者关注的目的基因与神经元活性标志物 pS6 均实现荧光标记。所描述的方法采用酪酰胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification），可产生清晰且强烈的标记信号，背景几乎无干扰。pS6 免疫染色呈现为胞质荧光信号，通常充满整个神经元胞体，而 原位 嗅觉受体神经元的杂交信号表现为细胞质染色。pS6 是嗅觉神经元激活的瞬时标志物，因此在感觉器官固定前1小时内被激活的细胞中，相应的免疫染色信号会更强。只要使用适当的带通显微滤光片，pS6 与受体染色之间的荧光串扰不应出现。

通过标记区域可以评估两种染色之间的共定位，从而识别出在所研究的激活神经元群体中表达的基因。图2A、B显示了暴露于猫气味的小鼠的犁鼻器图像，其中A4分支V2R受体与pS6信号发生共定位，表明表达这些嗅觉受体的神经元被所使用的刺激激活。相反，当激活的神经元不表达待研究的嗅觉受体时，则预期不会出现信号之间的共定位（图2...

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讨论

本方案通过结合嗅觉受体（OR）或犁鼻器受体（VR）的原位检测与神经元活动间接标志物——磷酸化核糖体蛋白S6（pS6）的免疫检测，可靠地鉴定嗅觉系统中被化学信号激活的感觉神经元。实验人员必须格外注意保持组织学完整性，并在杂交前的所有步骤中严格采用无RNase的条件操作，否则可能导致mRNA降解，影响核苷酸探针的标记效果。在解剖嗅觉器官时需格外小心，因为未固定的组织极为脆弱，容易受损。

原位杂交 本方案中的杂交包含两轮信号放大步骤，需注意荧光强度可能受杂交或信号显色相关因素的影响。例如，孵育温度和时间必须通过实验优化。标记信号弱可能源于探针浓度过低、杂交温度过高或酪胺标记时间过短；相反，背景过高可能由杂交温度过低或酪胺孵育步骤中显色过度所致。这些参数需调整至获得最佳信噪比（详见表1中的系统性故障排查讨论）。

类似地，pS6 免疫检测可能导致荧光强度较低或背景染色较高。这些问题通常源于酪胺孵育步骤时间不当、封闭不充分或内源性过氧化物酶淬灭不充分（Table 1）。...

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披露

作者声明不存在任何竞争性利益。

致谢

感谢 GAG Pereira 和 JA Yunes 提供的资源，APF Ferreira 和 WO Bragança 提供的行政与技术支持，以及圣保罗州立大学生命科学核心设施（LaCTAD-UNICAMP）工作人员在共聚焦显微镜方面的帮助。本研究由圣保罗研究基金会（FAPESP；项目编号 2009/00473-0 和 2015/50371-0，授予 F.P.）、圣保罗州立大学研究与研究生事务处（PRP/UNICAMP；项目编号 2969/16、725/15、348/14 和 315/12，授予 F.P.）提供资助。V.M.A.C. 获 FAPESP 博士后基金（项目编号 2014/25594-3、2012/21786-0、2012/01689-0），T.S.N. 获 FAPESP 博士后基金（项目编号 2012/04026-1）及巴西高等教育人员改进协调机构（CAPES）博士后基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x 磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20倍扩增稀释液（反应缓冲液来自 Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40923 或 B40922在酪胺-Alexa 488 或酪胺-Alexa 555 信号扩增的工作溶液中称为扩增缓冲液 A
20x SSC默克（Calbiochem）8310-OPn/a
30% 牛血清白蛋白（BSA）默克（Sigma-Aldrich）A9576n/a
30% 过氧化氢（H2O2)默克（Sigma-Aldrich）H1009n/a
乙酸酐默克（Sigma-Aldrich）320102n/a
琼脂糖默克（Sigma-Aldrich）A9539n/a
扩增稀释液（来自 TSA Biotin 试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA工作溶液中用于酪胺-生物素信号扩增的扩增缓冲液B
抗-pS6（Ser 244/247）兔多克隆抗体Thermo Fisher Scientific货号 44-923G，RRID:AB_2533798n/a
封闭缓冲液1x（来自Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40923 或 B40922在酪胺信号放大步骤中称为封闭液B
封闭试剂（来自TSA Biotin试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EA在TNB缓冲液配方中称为A型封闭试剂
DAPI 核染色Thermo Fisher ScientificD1306n/a
Denhardt's 溶液（50x）默克（Sigma-Aldrich）D9905n/a
去离子甲酰胺默克（Sigma-Aldrich）F9037n/a
右旋糖酐硫酸钠溶液（50%）默克（Chemicon）S4030n/a
乙二胺四乙酸（EDTA）默克（Sigma-Aldrich）E9884n/a
Hoechst 33342 核染色Thermo Fisher ScientificH1399n/a
盐酸（HCl）默克（Sigma-Aldrich）320331n/a
嗅觉刺激n/aPapes 等（2010），Carvalho 等（2015），Nakahara 等（2016），Carvalho 等（2020）n/a
多聚甲醛默克（Sigma-Aldrich）P6148n/a
辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛抗体（Fab 片段）默克（罗氏）11207733910; RRID:AB_514500称为辣根过氧化物酶偶联的抗DIG抗体
辣根过氧化物酶偶联的抗兔二抗（辣根过氧化物酶多聚体偶联的山羊抗兔试剂，来自 Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40922n/a
辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（来自TSA生物素试剂盒）Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36934抗荧光淬灭封片剂
无RNase超纯水Thermo Fisher Scientific10977015n/a
氯化钠（NaCl）默克（Sigma-Aldrich）S9888n/a
十二烷基硫酸钠（SDS）默克（Sigma-Aldrich）436143n/a
氢氧化钠（NaOH）默克（Sigma-Aldrich）S8045n/a
蔗糖默克（Sigma-Aldrich）S0389n/a
三乙醇胺默克（Sigma-Aldrich）T58300n/a
Triton X-100默克（Sigma-Aldrich）X100n/a
Trizma盐酸盐（Tris-Cl）默克（Sigma-Aldrich）T5941n/a
Tween-20默克（Sigma-Aldrich）822184n/a
Tyramide-Alexa 488 偶联物（来自 Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Tyramide-Alexa 555 偶联物（来自 Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒）Thermo Fisher ScientificB40923n/a
TSA 生物素试剂盒中的酪胺-生物素偶联物Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
酵母tRNA默克（罗氏）10109495001n/a
关键商业试剂盒与实验动物
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost 试剂盒Thermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA标记试剂盒（SP6/T7）默克（罗氏）11175025910n/a
高灵敏度RNA ScreenTape分析试剂（缓冲液、标准品和胶带）安捷伦5067-5580、5067-5581 和 5067-5579称为自动电泳系统
小鼠：C57BL/6J 近交系杰克逊实验室货号： 000664; RRID:IMSR_JAX:000664n/a
ProbeQuant G-50 Micro 柱Cytiva 生物科学28903408称为基于凝胶过滤的纯化试剂盒
QIAquick 凝胶回收试剂盒Qiagen28506称为基于微型柱的凝胶纯化试剂盒
RNeasy MinElute 纯化试剂盒Qiagen74204被称为基于微型柱的RNA纯化试剂盒
TSA Biotin试剂盒Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
寡核苷酸
5’ – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5’ – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5’ – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATGGGAGCTCTAAATCAAACAA
GAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5’ – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1512
5’ – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5’ – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5’ – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5’ – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5’ – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5’ – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTG
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5’ – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5’ – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5’ – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5’ – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5’ – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5’ – GGTGACCCATATTCTCTGTATAA
CTGT – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5’ – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5’ – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5’ – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3’Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5’ – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5’ – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
5’ – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5’ – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3’		Integrated DNA Technologiesn/a
重组DNA
pGEM-T-Easy 载体PromegaA1360推荐的PCR克隆载体
其他材料
1 mL 注射器Fisher Scientific14-829-10Fn/a
锥形管（15 mL 和 50 mL）Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
考普林罐Fisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
冷冻切片机Leica BiosystemsCMS 1850n/a
解剖工具和镊子RobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
干浴器n/an/an/a
电泳设备Fisher Scientific09-528-110Bn/a
精细尖头画笔Winsor & 牛顿10269097n/a
荧光或共聚焦显微镜Leica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
加热板Fisher ScientificHP88850200n/a
加湿室（若在较高温度下使用，需将其密封于塑料保鲜盒内）Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
无尘实验室擦拭纸Kimberly-Clark34120称为无绒实验室擦拭纸
微型离心机Eppendorf5401000013n/a
小鼠笼具InnoViveM-BTM，MVX1n/a
PCR热循环仪Thermo Fisher Scientific4375786n/a
移液器 p1000、p200 和 p20 一次性吸头Fisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
塑料组织学包埋模具Thermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 氟光计Thermo Fisher ScientificQ33238被称为高灵敏度荧光测定法
剃须刀片或手术刀Fisher Scientific12-640n/a
RNA 毛细管电泳仪或 BioAnalyzer安捷伦4200 TapeStation 系统或 2100 Bioanalyzer 仪器n/a
无RNase的玻璃或塑料量筒和烧杯Fisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
体视显微镜Leica MicrosystemsM80n/a
SuperFrost Plus 显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific12-550-15称为带正电荷的显微镜载玻片
ParafilmBemis CompanyPM999称为热塑性实验室膜
水浴锅Thermo Fisher ScientificTSCIR19n/a

参考文献

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神经元激活小鼠嗅觉系统磷酸化S6蛋白化学刺激检测G蛋白偶联受体嗅觉行为犁鼻器受体

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