本实验方案的目的是利用活体成像技术，观察氧化损伤对果蝇（Drosophila）卵巢中亚细胞结构定位和动态变化的影响。
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摘要
摘要
活体成像 黑腹果蝇 卵巢在理解发育过程中多种基本细胞过程方面发挥了重要作用，包括核糖核蛋白颗粒的移动、mRNA的定位、细胞器的运动以及细胞骨架动态。目前已开发出多种活体成像方法。由于每种方法均涉及将单个卵管解剖后置于培养基或卤代烃油中，随着时间推移，缺氧和/或物理操作不可避免地会造成细胞损伤。缺氧的一个下游效应是增加细胞内的氧化损伤。本实验方案的目的是利用活体成像技术，观察氧化损伤对亚细胞结构定位与动态的影响 果蝇 在诱导可控的细胞损伤后对卵巢进行观察。本文中，我们使用过氧化氢诱导细胞氧化损伤，并举例说明此类损伤对两种亚细胞结构——线粒体和Clu bliss颗粒的影响。然而，该方法适用于任何亚细胞结构。其局限性在于，过氧化氢只能添加到水相介质中，因此不适用于使用卤代烃油的成像实验。该方法的优势在于，过氧化氢易于获取且成本低廉，作用迅速，其浓度可调节，且氧化损伤能够较好地模拟缺氧以及因操作引起的普遍组织损伤。
引言
在离体组织的实验培养和操作过程中，可能会产生多种不同的细胞应激因素，包括热休克、氧化应激、渗透压应激、营养应激以及毒性条件。活体成像是一种强大的工具，可用于观察离体组织在实验处理和操作后发生的实时变化。精细的组织解剖与操作需要经验积累，从解剖到成像所需的时间也可能因操作者的熟练程度而异。本方法的建立基于以下考虑：组织活体成像前的制备过程可能在解剖和成像准备阶段引发细胞应激。这对于细胞代谢和氧气供应水平变化敏感的过程尤其成问题，例如线粒体功能。尽管设置平行的野生型样本作为对照非常重要，但仍有可能观察到的某些甚至全部亚细胞结构变化是由解剖造成的损伤或细胞应激所致，而非反映正常的生理状态或所研究的处理措施或基因突变的真实效应。
为解决这一潜在问题，我们在活体成像过程中添加过氧化氢，以诱导细胞氧化损伤1该方法的目的是通过诱导组织损伤，以监测其对亚细胞结构的影响。本方案适用于两个目的：1）确定目标结构的亚细胞定位变化是否由不熟练的解剖操作所造成的应激引起；2）在研究者已熟练掌握所述解剖技术后，用于监测可控应激对目标结构的影响。本文展示了氧化损伤增加导致两种亚细胞结构——线粒体和Clu bliss颗粒发生变化的两个示例。为实现此目的，我们使用了 果蝇 卵巢是活体成像研究的常用模型。第一个示例考察线粒体的定位。根据我们的经验，雌性生殖细胞中线粒体的正常定位对扰动极为敏感，可作为细胞应激的早期指标。雌性生殖细胞中的线粒体在 黑腹果蝇 雌性生殖细胞通常均匀分布在细胞质中2过氧化氢的加入会导致细胞器迅速错位并聚集，其表现与多种突变引起的效应相似3,4,5第二个例子是由Clueless（Clu）形成的bliss颗粒。Clu是一种核糖核蛋白，在细胞质中广泛弥散分布；然而，在适宜的细胞条件下，它也会形成与线粒体相关的颗粒。5由于Clu颗粒的存在依赖于健康的细胞状态，我们将其称为 "幸福" 颗粒3,5,6加入过氧化氢后，这些颗粒会迅速在细胞质中分散并变得均匀5在我们的研究过程中，观察到这两种亚细胞结构的定位均发生了变化，但只有在进行活细胞成像研究后，才充分认识到细胞应激和氧化损伤对线粒体及bliss颗粒定位与动态行为的影响。
该方案作为已有或替代方法的补充，其适用性取决于多个因素。首先，成像方案必须允许添加药物。如果样品被置于盖玻片下并浸没在卤代烃油中，则此方法将无法实施7。H2O2的添加会引起氧化损伤的迅速增加，因此该时间尺度可能并不合适。虽然氧化损伤可被用作缺氧的替代指标，但它可能过于剧烈或过于广泛，无法作为某些亚细胞组分损伤的适当对照。最后，对于持续数小时的成像实验（例如追踪发育过程的实验），H2O2的添加可能作用过强（例如8）。通过测试浓度梯度可能克服这一局限性。
方案
1. 解剖和成像介质的制备
注意：本活体成像实验最适合的培养基为含15%热灭活胎牛血清、0.6x青霉素-链霉素和200 µg/mL牛胰岛素的Schneider's果蝇培养基，下文简称完全Schneider's培养基。
- 在无菌条件下进行培养基制备，以确保其不受污染。该培养基旨在长期支持果蝇（Drosophila）卵巢管的生长9。
- 向Schneider培养基中加入15%热灭活胎牛血清、0.6×青霉素-链霉素溶液以及200 µg/mL牛胰岛素。
- 充分混匀内容物，并在4 °C下过夜保存。
注意：胰岛素在完全配制的Schneider培养基中不会完全溶解，您会观察到沉淀物沉降至管底。 - 将培养基分装成小份，注意保留沉淀物，因其可能干扰成像。
注意：若将分装后的溶液在4 °C保存，可在一个月内使用。
2. 样本采集 果蝇 用于解剖
注意：详细的黑腹果蝇（Drosophila）采集与解剖操作步骤也可参见 Weil 等人10 和 Parker 等人11 的研究。
- 为了获得最佳的雌性生殖细胞成像效果，首先准备一个含有标准玉米粉果蝇培养基的试剂瓶，并加入一小滴质地类似花生酱的湿酵母糊。这可确保雌性果蝇营养充足，能够产生所有卵泡发育阶段，便于成像观察。
- 为了获得健康状态最佳的果蝇，收集0-1日龄的雌蝇，并与雄蝇一同转移到含有湿酵母糊的果蝇培养基试剂瓶中。
注意：确保麻醉后的果蝇不与酵母糊接触，以免粘附其上。 - 喂养果蝇3-7天，每天更换试剂瓶和酵母糊。
注意：确保酵母糊与果蝇培养基接触，以防止其干燥。
3. Drosophila 卵巢解剖
注意：必须新鲜配制培养基溶液，因为过氧化氢易被氧化，且 TMRE 会随时间推移而降解。
- 在解剖前，于完全Schneider培养基中，新鲜配制2 µM H2O2溶液、46 nM四甲基罗丹明乙酯（TMRE）溶液，以及含2 µM H2O2的46 nM TMRE溶液，各取一份备用。
- 进行卵巢解剖时，使用两把精细镊子和一对电解 sharpened 钨针12。解剖卵巢前，将2-3个玻璃底解剖皿（表面皿）的孔中加入已预热至室温的完全Schneider培养基。
- 用二氧化碳麻醉装有肥大果蝇的瓶子，并挑选出所需数量的雌蝇进行分离。用镊子将单只果蝇放入培养基中。
- 在解剖显微镜下，用一把精细镊子轻轻夹住果蝇的胸部，用另一把镊子夹住其后端，轻柔拉扯以取出卵巢。
注意：若使用此方法无法顺利取出卵巢，可先将整个腹部从果蝇体上移除，再用镊子从腹部两端轻轻挤压，将卵巢挤出。 - 去除多余的表皮或其他组织，然后将卵巢转移至含有新鲜培养基的新孔中。此时卵巢应仍因周围肌鞘的存在而保持活动状态。
4. 准备用于成像的卵管
- 使用锋利的钨针轻轻分离卵巢管，注意去除周围的肌鞘（图1）。
- 轻轻剥离附着在分离卵巢管上的任何肌鞘和神经纤维（图2）。
注意：如果未去除肌鞘，卵巢管会发生抽搐和移动，导致图像采集困难（视频1）。 - 如果目标亚细胞结构已进行内源性标记，则继续进行步骤4.4；如果目标结构需用荧光染料标记，则进入第5节。
- 待卵巢管完全解剖后，用移液器将其转移至玻璃底培养皿的凹槽中，置于100 µL完整Schneider's成像培养基液滴内。单个卵巢管将沉降至液滴底部。
- 进入第6节进行成像。
注意：对线粒体和Clu bliss颗粒进行成像时，从解剖开始至成像结束的时间不应超过5至10分钟。
5. 使用 TMRE 染色线粒体
注意：有关使用荧光染料对线粒体进行活体染色的更多详细步骤，可参见 Parker 等人 2017 年的研究。
- 完成步骤4.3后，将分离的卵管转移至玻璃底培养皿的凹槽中，置于100 µL含46 nM TMRE的培养液滴内。单个卵管将沉降至液滴底部。
- 在室温下孵育20分钟。将盖子盖在玻璃底培养皿上，并将培养皿放入加盖的盒子中以避光，整个实验过程中保持此状态。
注意：孵育后，样品无需洗涤，可直接进行成像。 - 重复步骤5.1–5.2，制备至少两皿标记TMRE的卵管，其中一皿作为实验组，另一皿作为对照组。
6. 活细胞图像采集
- 将卵管安装好后，将其中一片玻璃底培养皿放置于显微镜上，并根据需要设置成像参数。本实验所用TMRE的最佳激发/发射波长为549 nm/574 nm。
- 找到目标视野后，根据需要对一个或多个卵管采集静态图像或短时视频，以记录处理前的状态。
7. 成像过程中过氧化氢的添加
- 暂停活体成像，取下玻璃底培养皿的盖子，若正在成像内源性标记的结构，则使用微量移液器小心向培养皿中加入 100 µL 的 2 µM H2O2 溶液。若正在成像线粒体，则使用微量移液器小心向培养皿中加入含 46 nM TMRE 和 2 µM H2O2 的 100 µL 溶液（视频 2）。
- 避免破坏现有培养基液滴的表面，或加入溶液过快，以免使沉在培养皿底部的卵管发生移位（视频 2）。
- 重新盖上培养皿盖（培养皿盖），如有需要，重新定位并调整目标视野的焦距，然后恢复成像（视频 3、视频 4、图 3、图 4）。
- 在加入 H2O2 后应尽快恢复成像，因为实验处理具有时间敏感性（视频 5）。
- 根据需要获取一个或多个卵管的静态图像或短片段视频。这将作为处理后状态的记录。
- 对于对照组，将第二个玻璃底培养皿放置于显微镜上，并重复第 6 节操作。
- 重复步骤 7.1，此次向培养皿中加入 100 µL 仅含 TMRE 的培养基。若正在成像内源性标记的结构，则加入 100 µL 仅含完全 Schneider 培养基的溶液。
- 重复步骤 7.2 和 7.3，以获取对照组的数据。
注意：在成像线粒体和 Clu bliss 颗粒时，从加入过氧化氢到开始成像的时间不应超过三至五分钟。
结果
所述方案可用于在活体成像 Drosophila 卵巢过程中研究过氧化氢的作用。如图3、图4、视频3和视频4所示，该方法可有效实现实验处理后组织变化和动态过程的实时可视化。重要的是，本方案专为在成像过程中向卵管中添加H2O2而设计；但也可根据需要调整用于外源性添加其他感兴趣的药物或试剂。此外，在成像前可使用任何感兴趣的荧光染料对卵泡进行标记（例如四甲基罗丹明乙酯（TMRE）、溶酶体示踪剂（LysoTracker））（视频3）。获得清晰成像结果最关键的步骤包括：1）正确解剖并分离出所有收缩元件均已去除的单个卵管（图1和图2）；2）添加过氧化氢后尽快恢复成像的速度。视频4展示了一个解剖良好的卵泡，在整个成像过程中保持稳定，相比之下，视频1则展示了一个解剖不佳的卵泡在成像过程中移出视野。视频5展示了一种情况：由于添加H2O2后等待时间过长，TMRE标记的线粒体已发生明显变化，导致成像开始前效应已进展。与视频3相比（在加入过氧化氢后立即恢复成像（时间为0），仍可见完整且分散的线粒体），视频5中的线粒体在成像恢复时已明显聚集并丧失膜电位。该问题主要归因于添加H2O2过程中样本位置的扰动，可通过采用保持成像培养基和样本位置稳定的技巧加以改善（视频2）。值得注意的是，在未向培养基中添加H2O2的对照实验中，卵泡内的线粒体保持正常分散状态，且TMRE染料仍被有效保留在线粒体内。
图1：分离单个卵管 果蝇 卵巢 (A) 示意图显示一对卵巢，以及一条卵巢管（箭头），其顶端为卵原区（箭头尖端），并可见包绕卵巢管的两种肌鞘（棕色，上皮性）和包绕卵巢的肌鞘（棕色，腹膜性）。(B解剖分离 果蝇 卵巢。 (C) 将解剖的卵巢进一步分离为单个的卵巢管（箭头所示）。比例尺 = 100 μm。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：从单个卵管中去除神经纤维和收缩性成分。 （A）单个卵管，仍附着有神经组织残余和肌鞘（箭头所示）。（B）轻柔地去除A图中卵管上附着的所有残留组织（箭头所示）。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：H2O2 引发线粒体错位定位。（A-A″）一只营养充足的 cluCA06604（Clu::GFP 果蝇）卵泡的活体成像静止画面。加入 H2O2 后，在成像过程中线粒体出现聚集现象。线粒体的 TMRE 标记显示，在时间 0 时线粒体初始呈弥散分布（A），加入 H2O2 后线粒体开始聚集（A′）。在较晚的时间点，由于线粒体失去膜电位，从而丧失了富集染料的能力，TMRE 标记呈现斑点状（A″）。白色 = TMRE（A-A″）。比例尺：A-A″5 中（A）为 10 µm。请点击此处查看此图的放大版本。
图 4：H2O2 导致 Clu 分散。（A-A″）来自正常喂养的 cluCA06604 卵泡的活体成像静止画面。加入 H2O2 后，在成像过程中，颗粒逐渐分散并在细胞质中趋于均匀分布。白色信号 = Clu::GFP（A-A″）。比例尺：40 µm，适用于（A）中的 A-A″5。请点击此处查看该图的放大版本。
视频 1：来自 cluCA06604 雌性果蝇的卵泡。如图 2所述，若未能将神经纤维的收缩元件从单个卵巢管中彻底清除，则在成像过程中会导致卵巢管明显漂移和移动，进而无法对成像数据进行有效分析。白色 = Clu::GFP。请点击此处下载该视频。
视频 2： 正确添加 H2O2 取样至培养皿。 应使用适当量程的微量移液器将过氧化氢加入样品皿中。分装 H2O2 避免破坏成像培养基的表面。在添加过氧化氢时，需注意不要破坏成像培养基的液面，以尽量减少样品漂移。 请点击此处下载此视频。
视频 3： H2O2 成像TMRE标记的卵泡时的添加步骤。 卵泡来自一个 cluCA06604 经 TMRE 染色的雌性。H2O2 导致线粒体错位 果蝇 卵泡。白色 = TMRE 染料。每 15 秒拍摄一帧，持续 20 分钟，视频为每秒 10 帧。5. 请点击此处下载此视频。
视频 4：对 Clu::GFP 卵泡成像过程中添加 H2O2。来自 cluCA06604 雌性的卵泡。H2O2 可使 Clu 颗粒分散，如图 4所述。白色 = Clu::GFP。每 15 秒采集一帧，共成像 15 分钟，视频播放速率为每秒 10 帧。5 请点击此处下载该视频。
视频 5：添加 H2O2 后延迟成像。来自 cluCA06604 雌性果蝇的卵泡。向卵泡中添加过氧化氢是一种对时间敏感的处理方式。本视频中，由于在添加 H2O2 时样品发生位移，导致成像重启被延迟。在时间 0 重启成像时，线粒体已开始明显聚集并丧失膜电位（与视频 3 中的时间 0 相比）。若处理后未能迅速恢复成像，将导致早期实验效应在成像前即被遗漏，从而获得不准确且无法使用的实验结果。白色 = TMRE。每 15 秒采集一帧，持续 20 分钟，视频播放速度为每秒 10 帧。请点击此处下载该视频。
讨论
该方案可作为任何活体成像实验中用于排除因卵巢解剖和组织孵育所致假象的有用对照。关键步骤与其他活体成像方案中的类似。掌握完整解剖 Drosophila 卵巢的技术需要练习；然而，使用合适的解剖工具通常可以较快掌握该技能。更难掌握的是去除包裹卵巢及每个卵管的肌肉层13。必须完成此操作，以确保肌肉收缩不会干扰图像采集。若使用 sharpened tungsten needles（锋利钨针）操作不成功，可用镊子夹住卵管末端的生殖腺（germarium），将卵管从肌肉鞘中拉出。然而，若需观察最早期的发育阶段，该技术存在问题，因为这些早期结构可能因此受损。另一个关键步骤是在添加 H2O2 时，避免扰动沉在培养皿底部的卵管。所有活体成像共有的一个重要方面是：研究人员应在处理前确保目标结构已通过荧光标记清晰显示。本实验所用的培养皿（材料表）常用于活体成像；但任何底部带有玻璃盖玻片的培养皿或载玻片，甚至较大的玻璃盖玻片均可使用，只要能够覆盖液滴以防止培养基蒸发即可。尽管我们使用特定的显微镜，但任何配备足够放大倍数物镜以观察目标亚细胞结构、并配有具备足够分辨率和图像采集速率相机的倒置显微镜均可适用。
尽管我们的实验室主要关注线粒体功能，但该方法也可用于研究任何亚细胞结构或细胞器的动力学与定位，例如细胞核、细胞骨架或内质网。然而，该方法存在局限性。为了加入过氧化氢，组织必须处于水性培养基中。另一种活体成像方法是使用卤代烃油，该方法在描述果蝇（Drosophila）卵管中的许多重要过程方面发挥了关键作用，包括在模式生物中首次观察到GFP的动态运动7,14。此外，向培养基中添加过氧化氢会导致广泛的氧化损伤，这种损伤可能过于非特异性，难以针对特定细胞过程提供有意义的信息，尤其是在研究发育等较长时间实验中。尽管由于这种快速、广泛且可能不可逆的氧化损伤，长时间连续观察细胞的实验可能难以实施，但我们发现，所描述的急性过氧化氢处理适用于大多数卵子发生阶段，因为在成像时间段内我们能够在大多数阶段观察到相似的效应。鉴于该方案成本低且操作简便，它可作为损伤对照，并可用于固定及抗体标记前的预处理。
在我们的实验中，H2O2 处理能够模拟我们在多种 Drosophila 突变体中观察到的线粒体错位和 Clu bliss 颗粒弥散的变化。该处理也能模拟实验室中新研究人员学习解剖技术时所观察到的结果。因此，该方法明确揭示了样本制备和普遍的细胞应激可导致线粒体错位及 bliss 颗粒出现的意外且此前未被解释的变化。为进一步优化该技术，可使用更高或更低浓度的过氧化氢进行调节。若在较低浓度下观察到细胞效应，则通过更换为完全 Schneider 培养基，可能使应激表型发生逆转。其他细胞应激因素，如羰基氰化物-间氯苯腙（CCCP）、亚砷酸盐或简单的热激，可能适用于研究其他亚细胞结构的普遍细胞应激反应。由于离体组织的活体成像需要人工操作并在不同培养基中孵育，因此这一对照实验的加入将有助于确保所有观察结果尽可能接近正常生理状态。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Jeremy Smyth 博士在成像方面的支持，以及 Ann C. Shenk 在插图、制作和视频拍摄方面的贡献。本工作由美国国立卫生研究院（1R01GM127938，授予 R.T.C.）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 活性干酵母 | Red Star® | ||
| CO2 气体 | 纯度99.9% | ||
| CO2 垫片 | |||
| 解剖显微镜，Nikon SMZ645 型号 | Nikon | ||
| 解剖针 - PrecisionGlide 针头 | BD | 305165 | B-D 21G1 规格 |
| 解剖针 - PrecisionGlide 注射器 | BD | 309657 | 鲁尔锁扣式尖端，3 mL 规格 |
| 解剖针 - 钨丝 | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
| Dumont #5 镊子（2 对） | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| NI-150 高强度照明器 | Nikon Instruments Inc. | ||
| Gibco 胎牛血清，经热灭活 | Fisher Scientific | 10082-147 | |
| Gibco Schneider's 果蝇培养基 | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
| 过氧化氢溶液，30% (w/w) 水溶液 | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| 牛胰岛素 | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | Nikon | 也可使用等效型号的显微镜 | |
| Lonza BioWhittaker 抗生素：青霉素-链霉素混合液 | Fisher Scientific | 17-602E | |
| MatTek Corporation 玻底培养皿，35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
| 适当规格的微量移液器及吸头 | Eppendorf | ||
| 微量离心管，1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
| 四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐（TMRE） | AnaSpec | AS-88061 | |
| w[1118] | Bloomington 果蝇品系保藏中心 | 5905 | 野生型果蝇 |
| y w; clu[CA06604] | 可根据要求提供。 | Clu::GFP 捕获果蝇 |
参考文献
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