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方法文章

神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

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DOI：

10.3791/62165

⸱

2021年2月9日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Purdue University, 2Purdue Institute for Integrative Neuroscience, Purdue University, 3Bindley Bioscience Center, Purdue University

本文内容

摘要

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H2O2）生物传感器，以评估H2O2在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。

摘要

活性氧（ROS）是公认的信号分子，在正常发育、稳态维持和生理功能中具有重要作用。在各类活性氧中，过氧化氢（H₂O₂）因其相对稳定的化学性质和跨膜扩散能力，成为重要的氧化还原信号传导分子。2O2）在细胞信号传导中的作用最为明确。H2O2 在多个物种的发育过程中均牵涉其中。例如，H2O2 在受精后的最初几天内，已在斑马鱼胚胎中检测到。此外，耗竭一种重要的细胞H2O2 来源，NADPH 氧化酶（NOX），会损害神经系统发育，例如视网膜神经节细胞（RGCs）的分化、轴突生长和导向，两者均 在 体内 和 体外. 本文介绍一种用于成像细胞内H2O2 使用基因编码的H在培养的斑马鱼神经元及发育过程中的完整幼体中检测水平2O2特异性生物传感器roGFP2-Orp1。该探针可在斑马鱼幼鱼中瞬时或稳定表达。此外，其比率型信号输出可降低因基因表达差异或体积效应导致的假象检测概率。首先，我们展示如何分离并培养瞬时表达roGFP2-Orp1的斑马鱼胚胎来源的视网膜神经节细胞（RGCs）。随后，利用完整幼鱼监测H2O2 组织水平的检测。该传感器已通过添加 H 进行验证2O2此外，该方法还可用于测量 H2O2 通过构建在特定组织中表达生物传感器的转基因动物，检测特定细胞类型和组织中的信号水平。由于斑马鱼便于进行遗传和发育操作，本文展示的方法可作为研究H功能的实验流程2O2 在脊椎动物神经元及一般胚胎发育过程中。

引言

活性氧（ROS）信号通路调控神经系统的发育与功能1。细胞内重要的活性氧来源之一是NADPH氧化酶（NOX），这是一类跨膜蛋白，可生成超氧阴离子和过氧化氢（H2O2）2。NOX酶广泛存在于中枢神经系统（CNS）中，由NOX产生的活性氧参与神经元的发育过程3,4,5,6。研究表明，神经干细胞的维持与分化、神经元极性的建立、神经突起的生长以及突触可塑性均依赖于适当水平的活性氧7,8,9,10,11。另一方面，NOX酶过度产生活性氧则与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、多发性硬化症和创伤性脑损伤12,13,14。因此，生理水平的活性氧生成对于维持神经系统健康状态至关重要。

基因编码生物传感器的开发极大地促进了细胞内活性氧（ROS）的检测。基因编码生物传感器的一个重要优势在于其能够显著提高ROS信号的时间和空间分辨率，因为这些传感器可被特异性地靶向至细胞内的不同位置。氧化还原敏感型绿色荧光蛋白（roGFP）即为一类此类ROS生物传感器。其中roGFP2-Orp1变体通过其Orp1结构域特异性地检测H2O2，Orp1是一种来源于酵母的谷胱甘肽过氧化物还原酶家族蛋白15,16。Orp1蛋白的氧化状态会传递至roGFP2，从而改变其构象（图1A）。该探针在约405 nm和480 nm处具有两个激发峰，在515 nm处有一个发射峰。当发生氧化时，激发峰附近的荧光强度发生变化：405 nm激发下的荧光增强，而480 nm激发下的荧光减弱。因此，roGFP2-Orp1是一种比率型生物传感器，H2O2水平通过两种不同波长激发下的荧光强度比值来测定（图1B）。总体而言，roGFP2-Orp1是一种多功能的ROS成像工具，可在活体（in vivo）中高效应用。

Orp1-roGFP2 被 H2O2 氧化；荧光强度变化；氧化还原示意图。
图 1：roGFP2-Orp1 的示意图及激发光谱。（A）在 H2O2 存在下，Orp1 与 roGFP2 之间发生氧化剂转移，导致 roGFP2 构象发生变化。（B）roGFP2-Orp1 的激发光谱在 405 nm 和 480 nm 处呈现两个激发峰，发射峰位于 515 nm。当被 H2O2 氧化后，405 nm 处的激发增强，而 480 nm 处的激发减弱，从而实现对 H2O2 存在的比率型检测。该图已根据 Bilan 和 Belousov（2017）16 以及 Morgan 等人（2011）25 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

Danio rerio（斑马鱼）模型系统在应用基因编码的生物传感器方面具有多项优势。胚胎和幼鱼的光学透明性使得无需侵入即可进行体内活体成像。目前正不断开发新的成像工具，以实现更高的分辨率和更深的组织穿透能力17。此外，已有成熟的遗传操作工具（如异位mRNA表达、Tol2转基因技术等）以及基因组编辑技术（如TALENs、CRISPR/Cas9等），有助于快速构建转基因动物模型18。由于斑马鱼胚胎在母体外发育，该系统可更方便地接触和操作胚胎。例如，单细胞期的显微注射和药物处理均可便捷实施。

此处，我们利用斑马鱼瞬时表达H2O2-特异性生物传感器 roGFP2-Orp1，方法是注射体外转录的mRNA。这些胚胎可用于两者 体外 培养神经元的成像 体内 成像（图2）。我们描述了一种从斑马鱼胚胎中分离和培养视网膜神经节细胞（RGCs）的方案，随后评估H2O2培养神经元中的水平。然后，我们介绍一种方法 体内 使用共聚焦显微镜对表达 roGFP2-Orp1 的胚胎和幼虫进行成像。该方法不仅可用于确定生理状态下的 H2O2水平，还能检测不同发育阶段或条件下的潜在变化。总体而言，该系统为检测H2O2 在活细胞和动物中研究H的作用2O2 在发育、健康与疾病中的作用

基因编辑示意图 roGFP2-orp1 mRNA；体外/体内斑马鱼成像实验。
图2．实验方案示意图。 简言之，收集胚胎后，将 roGFP2-Orp1 mRNA 注射至单细胞期斑马鱼胚胎的卵黄中。发育中的胚胎可用于（A）体外 和（B）体内 成像。（A）选取表达GFP的胚胎，在34小时（hpf）时解剖获取视网膜以收集视网膜神经节细胞（RGC）。分离得到的RGC接种于经PDL/层粘连蛋白包被的盖玻片上，培养基为ZFCM (+) 培养基。接种后6–24小时，当RGC轴突延伸时，可进行生长锥成像。可通过不同处理条件检测H2O2水平的潜在变化。本实验中，我们检测了RGC生长锥内的H2O2水平（红色）。（B）选取表达GFP的胚胎进行体内成像。在目标发育阶段，将胚胎麻醉后置于35 mm玻璃底培养皿中，进行共聚焦成像。本图中，胚胎腹侧朝下放置，以便视网膜成像。示意图展示了斑马鱼视网膜的发育过程。RGC形成节细胞层（GCL），即视网膜最内层。RGC的轴突发育为视神经，穿过中线形成视交叉，随后向背侧生长，在中脑的视顶盖区域形成突触连接。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，在2020年7月24日获得普渡大学动物护理与使用委员会（PACUC）的伦理审查和批准，批准协议号为2006002050。

1. 溶液的配制

  1. E2 培养基（1x）
    1. 通过混合 表 1 中列出的所有组分，配制 100x E2A（500 mL）、500x E2B（100 mL）和 500x E2C（100 mL）溶液。对 E2A、E2B 和 E2C 溶液进行高压灭菌，4 °C 保存。
    2. 配制 1x E2 培养基：取 5 mL 100x E2A、1 mL 500x E2B 和 1 mL 500x E2C，用无菌水定容至 500 mL，调节 pH 至 7.0–7.5。
    3. 将 1x E2 培养基分装为 50 mL 份量，-20 °C 保存以长期储存。但解冻时可能出现沉淀，请确保使用前沉淀完全溶解。
溶液组分量浓度
100X E2A（500 mL）
NaCl43.8 g1500 mM
KCl1.88 g50 mM
MgSO46 g100 mM
KH2PO41.03 g15 mM
Na2HPO40.34 g5 mM
500X E2B（100 mL）
CaCl25.5 g500 mM
500X E2C（100 mL）
NaHCO33 g350 mM
1× E2（500 mL）
100X E2A5 mL1X
500X E2B1 mL1X
500X E2C1 mL1X

表1：斑马鱼细胞培养用1x E2培养基的组分。

  1. E3 培养基（1x）
    1. 按照 表 2 所示，将各组分溶解于 1 L 无菌水中，配制成 100x 储存液。使用无菌水稀释该储存液，得到 1x E3 培养基。
    2. 加入 0.2% 亚甲蓝。对于 20 mL 的 1x E3 培养基，加入 40 µL 亚甲蓝。
    3. 另配制一批不含亚甲蓝的培养基，用于荧光成像。
组分质量 (g)100X 储存液中的浓度 (mM)
NaCl29.22500
KCl1.2617
CaCl2 2H2O4.8533
MgSO4 7H2O8.1333

表2：用于培养斑马鱼胚胎的100倍浓缩E3培养基成分。

  1. 80倍生理盐水储备液
    1. 混合表3中列出的所有组分。加水至总体积100 mL。搅拌至所有组分完全溶解。将溶液储存在4 °C。
组分质量 (g)储存液浓度 (mM)
葡萄糖1.4480
丙酮酸钠0.4440
CaCl2 2H2O0.14810
HEPES6.1256

表3：斑马鱼细胞培养基中80倍浓度盐溶液的组分。

  1. 斑马鱼细胞培养基（ZFCM+）
    1. 按表4所示成分配制250 mL培养基，调节pH至7.5。使用0.22 µm滤器过滤培养基，并于4 °C保存。
组分体积 (mL)体积百分比 %
L-15 培养基（含酚红）212.7585.1
胎牛血清 (FBS)52
青霉素/链霉素10.4
80X 盐溶液3.1251.25
水28.12511.25

表4：含血清和抗生素的斑马鱼细胞培养基成分。

  1. 用于成像的斑马鱼细胞培养基 (ZFCM-)
    1. 按表5所示成分配制250 mL培养基，调节pH至7.5，使用0.22 µm滤器过滤培养基。
    2. 分装为单次使用量（每份50 mL），以避免污染，4 °C保存。
组分体积 (mL)体积百分比
L-15 培养基（无酚红）212.7585.1
80X 盐溶液3.1251.25
水34.12513.65

表5：无血清无抗生素斑马鱼细胞培养基的成分 体外 成像

  1. 注模
    1. 将1.5%琼脂糖溶解于E3培养基中。取约25 mL琼脂糖溶液倒入100 × 15 mm的培养皿中。
    2. 将模具以相对于培养皿表面45°的角度放置在琼脂糖上方，并缓慢轻放使其自然漂浮于琼脂糖表面，以避免产生气泡。将培养皿置于实验台面上静置，使琼脂糖冷却并完全凝固。
    3. 待琼脂糖完全凝固后，缓慢取出模具，防止琼脂糖破裂。加入新鲜E3培养基，并在培养皿周围包裹一层Parafilm以防止液体溢出，置于4 °C保存（图3）。

培养细胞用培养皿中的微流控芯片，显示通道图案
图3：注模图像。（A）用于制备注射板的塑料模具。该模具具有六个斜坡，以及一个90°和一个45°的斜面，用于固定胚胎。（B）琼脂糖凝固并移除模具后的注射板。比例尺 = 1 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

2. roGFP2-Orp1 mRNA 的制备与注射

注意：roGFP2-Orp1 载体由德国 DKFZ 的 Tobias Dick 博士提供。该载体已在普渡大学 Qing Deng 博士实验室中亚克隆至 pCS2+ 载体中。为防止 RNase 降解，必须采取多项预防措施。全程必须使用无 RNase 的试剂和离心管，所有操作步骤均需佩戴手套，或者使用可去除 RNase 的清洁剂擦拭实验材料和表面。

  1. 用 NotI 酶切 3-10 µg 的 pCS2+/roGFP2-Orp1 载体以进行线性化。
  2. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化线性化的质粒。
  3. 根据制造商提供的说明，使用体外转录试剂盒对 roGFP2-Orp1 mRNA 进行体外转录。
    1. 加帽转录反应体系的配制
      1. 将 RNA 聚合酶和已线性化/纯化的 DNA 置于冰上。涡旋 10x 反应缓冲液和 2x NTP/CAP，直至完全溶解。NTP/CAP 保持在冰上，而缓冲液在配制反应体系时保持室温（RT）。打开管子前轻离心所有试剂，以防止污染。
      2. 在无 RNase 的 0.5 mL 离心管中，按室温（RT）下表中所示顺序配制 RNA 合成反应体系。反应终体积为 20 µL。反应体系配制见 表 6。
      3. 向管中加入 10 µL 核糖核苷酸混合液、2x NTP/CAP，以及必要时的无核酸酶水。加入 2 µL 10X 反应缓冲液。加入 1-1.5 µg 线性化 DNA（最多 6 µL）。如需要，加入无核酸酶水使反应体积达到 20 µL。
      4. 盖紧管盖，短暂涡旋，然后轻离心。加入 2 µL 10x SP6 酶混合液。用手指轻弹盖紧，再轻离心。
      5. 将反应体系置于 37 °C 孵育 2-2.5 小时（最长可达 18 小时）。
        ​注意：在本实验中，为获得最佳结果，采用 37 °C 下孵育 16-18 小时（过夜）。
      6. 加入 1 µL DNase 以去除 DNA 模板，轻弹混匀，轻离心，然后在 37 °C 下孵育 15 分钟。
试剂体积 (µL)反应中含量
2X NTP/CAP101X
10X 反应缓冲液21X
模板 DNA最多 61–1.5 µg
无核酸酶水加至 20 µL
10X SP6 酶混合液21X

表6：roGFP2-Orp1 mRNA体外转录的反应体系设置。

  1. RNA 回收
    1. 加入体外转录试剂盒中提供的 25 µL 氯化锂（LiCl）。将样品置于非结霜的 -20 °C 冰箱中，静置至少 30 分钟。
    2. 在 4 °C 条件下，以台式离心机最大转速离心 25 分钟。小心移除并弃去上清液，避免扰动沉淀。加入 25 µL 冷的 75% 乙醇，在 4 °C 离心 5 分钟。
    3. 小心移除并弃去上清液。将沉淀在室温下晾干至少 5 分钟，避免过度干燥。加入 12 µL 无核酸酶的 Tris-EDTA（TE）缓冲液（pH 7.0），并将样品置于冰上保存。
    4. 使用分光光度计测定 RNA 浓度，通常可获得 0.5–1 µg/µL 的浓度。
    5. 将 mRNA 配制成含酚红溶液（0.5% 酚红溶于杜尔贝科磷酸盐缓冲液 -DPBS）中的 100 ng/µL 溶液，并分装为单次使用量（3–5 µL）。将 mRNA 分装样品储存在 -80 °C。
  1. mRNA的显微注射
    1. 注射当天，取一份mRNA等分试样，按照斑马鱼胚胎注射方案，通过卵黄向单细胞期胚胎注射1 nL的mRNA19以下提供简要说明。
    2. 培育成年鱼并按先前所述方法收集胚胎20.
    3. 使用拉针仪制备显微注射针头。用镊子剪断针尖以形成 10 µm 尖端开口
    4. 将胚胎排列在第1.6步中描述的注射模具中。
    5. 使用玻璃显微注射移液管注入1 nL含酚红的mRNA。
    6. 收集胚胎并将其置于 E3 培养基中保存。
    7. 将胚胎置于 27 °C 在E3培养基中孵育至所需发育阶段。注射后的胚胎可用于以下两种实验 体外 （第3节和第4节）以及 体内 成像（第5节）。在实验前，可使用配备荧光光源和蓝/绿滤光片组的常规解剖显微镜对表达roGFP2-Orp1的胚胎进行预筛选。

3. 源自斑马鱼胚胎的原代视网膜神经节细胞培养

注意：本方案改编自先前已发表的方法21。步骤3.1和3.2需在层流罩内进行。

  1. 盖玻片的准备
    1. 每次实验准备4-6个培养板。使用经酸清洗并储存在100%乙醇中的盖玻片（22 × 22 mm方形；厚度0.16–0.19 mm）。
    2. 用镊子从储存容器中取出一张盖玻片，并用火焰灼烧以去除残留的乙醇。
    3. 将盖玻片倾斜放置于35 mm培养皿内，使其在空气中完全干燥。
    4. 用无菌水将10x储存液（5 mg/mL）稀释，制备Poly-D-Lysine（PDL）工作液（1x）。
    5. 在每张盖玻片中央加入100 µL浓度为0.5 mg/mL的PDL溶液，避免溶液扩散至边缘。
    6. 在室温（RT）下孵育20–30分钟，确保PDL溶液不干燥。
    7. 用0.5 mL无菌水洗涤盖玻片三次。让培养板完全干燥。
    8. 用1x PBS将50x储存液（1 mg/mL）稀释，制备层粘连蛋白（laminin）工作液（1x）。
    9. 在每张盖玻片中央加入100 µL浓度为20 µg/mL的PBS配制的层粘连蛋白溶液，避免溶液扩散至边缘。
    10. 将培养板置于37 °C湿化培养箱中孵育2–6小时。避免层粘连蛋白溶液干燥。
  2. 胚胎解剖及视网膜神经节细胞（RGC）接种
    1. 在解剖当天，准备并标记四个35 mm组织培养皿，分别加入4 mL的以下溶液：70%乙醇、“E2培养基1”、“E2培养基2”、“E2培养基3”。将培养皿置于冰箱中保存，直至进行解剖操作。
    2. 当斑马鱼胚胎发育至受精后34小时（hpf）时，从培养箱中取出已包被层粘连蛋白的培养皿，用0.5 mL 1x PBS对盖玻片洗涤三次。
    3. 最后一次洗涤后，向每个培养皿中加入4 mL ZFCM(+)培养基，避免培养皿干燥。
    4. 取出第3.2.1步中准备好的培养皿，使其平衡至室温（RT）。
    5. 向4–6个PCR管中各加入15 µL ZFCM(+)培养基。每张盖玻片接种所需的RGC需用4只眼睛的组织，对应使用一个PCR管。
    6. 从培养箱中取出斑马鱼胚胎，将其浸入含有70%乙醇的35 mm组织培养皿中5–10秒以进行表面消毒。
    7. 使用移液管将胚胎转移至含有无菌E2培养基的E2培养基1培养皿中，以洗去多余的乙醇。
    8. 将胚胎转移至E2培养基2培养皿中，用尖头镊子去除胚胎的绒毛膜（chorion）。
    9. 将胚胎转移至最终的E2培养基3培养皿中，进行解剖操作。
    10. 使用一对精细镊子，按照先前描述的方法解剖出视网膜22。
    11. 用一把镊子固定并夹住胚胎卵黄前方的头部区域，用另一把镊子剪除卵黄囊后方的尾部。
    12. 用镊子夹住颈部并取下头部，使脑组织和眼睛暴露于E2培养基中。注意避免刺破卵黄囊。
    13. 用精细镊子的尖端轻轻滚动眼睛使其脱离头部，同时用第二把镊子固定住颅脑组织。保持眼睛与周围组织碎片分离。
    14. 将4只眼睛转移至一个预先准备好的含有ZFCM(+)培养基的PCR管中。
    15. 使用P20移液器和黄色吸头，轻柔地吹打约45次以解离细胞。避免产生气泡。
    16. 将含有解离细胞的ZFCM(+)培养基转移至盖玻片中央。对其他盖玻片重复步骤10–12。
    17. 将培养物置于22 °C的实验台面上，放置在聚苯乙烯泡沫支架上以吸收振动。
    18. 接种后6–24小时进行成像。
      ​注意：使用移液管将胚胎转移至不同的培养皿中。每次更换溶液时应更换移液管，以防止乙醇残留（步骤6–8）。

4. 体外 培养的RGC神经元的ROS成像

  1. 成像当天（通常为细胞接种后6-24小时），在显微镜下检查细胞，以确认RGC轴突的生长情况。
  2. 进行活细胞成像时，将盖玻片从培养皿转移至活细胞成像腔室。本实验使用一种先前已描述的自制开放式腔室23。
  3. 设置显微镜进行成像。使用配备微分干涉差（DIC）物镜、OG590长通红色滤光片和EM-CCD相机的倒置显微镜。
  4. 成像前，将ZFCM(+)培养基更换为ZFCM(-)培养基。
  5. 使用10倍物镜定位细胞后，采用高数值孔径油浸物镜在60倍放大下获取图像，并额外使用1.5倍放大。
  6. 首先获取DIC图像，然后使用适当的滤光片组对roGFP2-Orp1进行成像。依次使用405/20 nm和480/30 nm激发滤光片激发roGFP2-Orp1，并在发射光通过505DCXR二向色镜后，使用535/30 nm发射滤光片采集图像。
  7. 完成第一组图像采集后，更换为含有不同处理溶液的培养基。为避免pH值和渗透压变化，每30分钟成像期间应更换一次培养基。

5. 体内 发育中胚胎的活性氧成像

  1. 对于 体内 成像时，将胚胎置于含有0.003%苯硫脲（PTU）的E3培养基中，从22-24小时pf开始避甲烯蓝培养。每天更换培养基并移除死亡胚胎。
  2. 在所需时间点，用 0.016% 三卡因麻醉胚胎。将麻醉后的胚胎置于 35 mm 玻璃底培养皿中，以 1% 低熔点琼脂糖固定。根据成像所需观察的区域，可将胚胎以背侧、腹侧或侧卧位定向摆放。
  3. 琼脂糖凝固后，用不含亚甲蓝的E3培养基/0.016%三卡因填充培养皿。
  4. 设置显微镜以进行成像。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜。或者，使用配备水浸物镜的正置共聚焦显微镜对置于琼脂糖液滴顶部的胚胎进行成像。
  5. 依次使用 405 nm 和 488 nm 激发滤光片激发 roGFP2-Orp1，并通过 515–535 nm 发射滤光片范围采集相应的荧光图像。
  6. 获取 z 轴层叠图像 5 µm 通过胚胎目标部位的切片厚度。胚胎可在发育的后续阶段保存用于成像。
  7. 成像后，用精细镊子将胚胎从琼脂糖中取出，并在不含亚甲蓝且添加PTU的培养基中孵育至所需发育阶段。

6. 图像分析与处理

  1. 基于 405/480 比值测定 H2O2 水平
    1. 使用合适的软件进行图像分析。此处使用 ImageJ 软件进行图像分析和处理。
    2. 在 ImageJ 软件中通过拖拽文件或点击 文件 | 打开 来打开 DIC、405/535 和 480/535 图像。如果尚未完成，请点击 图像 | 类型 | 32 位 将图像转换为 32 位。
    3. 使用控制栏中的自由手工具定义感兴趣区域（ROI）（如细胞体、生长锥、视网膜等）。点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 打开 ROI 管理器。在 ROI 管理器 选项卡中点击 添加，以添加已定义的 ROI。
    4. 在 ROI 附近绘制一个区域并作为背景 ROI 添加。在 ROI 管理器选项卡中选择该 ROI 并点击 测量，以测量平均背景值。
    5. 记录测量得到的平均强度值。点击 处理 | 数学 | 减去，从荧光图像中减去平均背景值。对 405/535 和 480/535 图像均执行此步骤。
    6. 在进行比值计算之前，点击 处理 | 数学 | 添加 功能，向 480/535 荧光图像添加数值“1”，以消除“0”值。
    7. 在 ImageJ 中点击 处理 | 图像计算器 | 除法 功能，将 405/535 图像逐像素除以 480/535 图像。选择 405/535 图像作为被除数，480/535 图像作为除数，并选择生成 32 位输出图像。
    8. 将 ROI 应用于比值图像：首先点击比值图像，然后在 ROI 管理器选项卡中点击对应的 ROI。
    9. 在 ROI 管理器选项卡中点击 测量，以测量 405/535 图像与 480/535 图像的平均比值。
    10. 尽可能多地对多个样本重复执行步骤 6.1.2–6.1.9，以便进行适当的统计分析。
  2. 显示比值图像
    注意：本步骤用于减去样本外部的背景，并为图像应用颜色查找表。
    1. 在步骤 6.1.7 中于 ImageJ 内生成比值图像后，点击 文件 | 新建 | 图像 创建一个 32 位黑色图像。
    2. 将用于显示 H2O2 水平的 ROI 应用于新图像：首先点击新图像，然后在 ROI 管理器选项卡中点击相应的 ROI。
    3. 点击 编辑 | 选择 | 创建掩模 生成掩模。
    4. 点击 处理 | 数学 | 除法 并输入 255，将掩模图像除以 255，使 ROI 的值变为“1”，背景值变为“0”。
    5. 点击 处理 | 图像计算器 | 乘法 功能，将掩模与比值图像相乘。结果将得到仅显示 ROI 的灰度比值图像。
    6. 点击 图像 | 查找表 | Fire，将查找表更改为“Fire”模式。
      注意：可通过点击 处理 | 图像 | 乘法 对所有图像应用乘法因子，以更好地可视化比值。
    7. 点击 图像 | 类型 | 8 位，将比值图像转换为 8 位图像。
    8. 点击 分析 | 工具 | 标尺 添加标尺。

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结果

培养的斑马鱼RGCs在1天内延伸出轴突。一幅代表性的405/480比率图像显示了H2O2-生物传感器如图所示 图 4A细胞体、轴突和生长锥在单个神经元中清晰可见。这些神经元可在不同时间点接受不同处理，以监测 H2O2 变化。我们先前发现，添加 100 µM H2O2 向培养基中添加物质会提高比值，表明该系统能够检测到实时变化（图4)24.

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讨论

在整个实验方案中，有几个关键步骤需要 特别注意。我们认为，考虑这些要点将有助于改善实验流程。对于原代视网膜神经节细胞（RGC）培养而言，ZFCM(-) 培养基的无菌性非常重要，因为该培养基不含抗生素，在成像前或成像过程中可能发生污染。为避免污染，我们建议仅在生物安全柜内配制和使用 ZFCM(-)，并定期新鲜配制 ZFCM(-) 培养基（步骤 1.5）。此外，层粘连蛋白（laminin）储备液应保存在 -80 °C。解冻后的层粘连蛋白应始终存放于 4 °C，切勿将其置于室温下或反复冻融，否则会降低该蛋白促进神经突生长的活性。

在适当的时间解剖斑马鱼视网膜对于获得足够数量并能延伸轴突的视网膜神经节细胞（RGCs）至关重要。斑马鱼RGCs在受精后28小时（hpf）生成，并从32至36 hpf开始延伸轴突离开视网膜。因此，为确保RGCs充分分化，关键是要在28 hpf之后接种RGCs，最好在32至36 hpf之间进行。若在更早的时间点制备培养物，可能无法获得足够数量的RGCs，或所得RGCs在接种后24小时内可能无法延伸轴突。建议在成像时间超过30分钟时更换ZFCM(-)培养基，...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了美国国立卫生研究院（资助号 R01NS117701）、美国国家科学基金会（资助号 1146944-IOS）、印第安纳州创伤性脊髓与脑损伤研究基金（资助号 20000289）、普渡大学研究基金会（资助号 209911）以及普渡大学研究与合作伙伴关系执行副校长办公室（资助号 210362）的支持。我们感谢 Cory J. Weaver 博士和 Haley Roeder 建立了斑马鱼视网膜神经节细胞（RGC）培养方案。我们 additionally 感谢 Haley Roeder 提供了图 4 的数据。我们感谢 Leah Biasi 和 Kenny Nguyen 在 RGC 培养方面的帮助。我们感谢 Gentry Lee 对文本的编辑。我们感谢 Tobias Dick 博士提供 roGFP2-Orp1，感谢 Qing Deng 博士提供含有 roGFP2-Orp1 的 pCS2+ 载体。图 2 使用 Biorender.com 制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 毫米培养皿Sarstedt83-3900
35 毫米玻璃底培养皿MatTekP35G-1.5-10-C
琼脂糖Fisher ScientificBP160-500
硼硅酸盐玻璃毛细管Sutter/Fisher ScientificNC9029378
二水合氯化钙Fisher ScientificC79-500
盖玻片Corning2850-22
一次性培养皿（100 × 15 毫米）VWR25384-094
胎牛血清ThermoFisher Scientific26140087
葡萄糖Sigma AldichG7528
HEPESSigma AldichH4034
注射模具Adaptive Science ToolsTU-1
倒置显微镜NikonTE2000
层粘连蛋白ThermoFisher Scientific23017-015
激光扫描共聚焦显微镜Zeiss710
含酚红的 Leibovitz L-15 培养基Gibco/Fisher Scientific11-415-064
不含酚红的 Leibovitz L-15 培养基Gibco/Fisher Scientific21-083-027
低熔点琼脂糖PromegaV2111
mMessage mMachine SP6 转录试剂盒InvitrogenAM1340
NotINew England BiolabsR0189S
PBSHyclone/Fisher ScientificSH3025601
青霉素/链霉素ThermoFisher Scientific15140122
酚红Sigma AldichP0290
苯硫脲（PTU）Sigma AldichP7629
气动微量注射泵World Precision InstrumentsPV820
聚-D-赖氨酸（PDL）Sigma AldichP7280
QiaQUICK PCR 纯化试剂盒QIAGEN28104
重组小鼠 slit2R&D Systems5444-SL-050
丙酮酸钠Sigma AldichP5280
Steritop 0.22 µm 滤器MilliporeS2GPT05RE
TE 缓冲液AmbionAM9860
三卡因甲磺酸盐Sigma AldichE10521
垂直移液器拉制仪David Kopf Instruments700C

参考文献

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