神经元发育过程中的活性氧活细胞成像

摘要

本方案描述了在培养的斑马鱼神经元和幼体中使用基因编码的过氧化氢（H₂O₂）生物传感器，以评估H₂O₂在神经系统发育过程中生理信号传导的作用。该方法可应用于不同类型的细胞，并可通过实验处理进行改良，以研究活性氧（ROS）在一般发育过程中的作用。

摘要

活性氧（ROS）是公认的信号分子，在正常发育、稳态维持和生理功能中具有重要作用。在各类活性氧中，过氧化氢（H₂O₂）因其相对稳定的化学性质和跨膜扩散能力，成为重要的氧化还原信号传导分子。₂O₂）在细胞信号传导中的作用最为明确。H₂O₂ 在多个物种的发育过程中均牵涉其中。例如，H₂O₂ 在受精后的最初几天内，已在斑马鱼胚胎中检测到。此外，耗竭一种重要的细胞H₂O₂ 来源，NADPH 氧化酶（NOX），会损害神经系统发育，例如视网膜神经节细胞（RGCs）的分化、轴突生长和导向，两者均 在 体内 和 体外. 本文介绍一种用于成像细胞内H₂O₂ 使用基因编码的H在培养的斑马鱼神经元及发育过程中的完整幼体中检测水平₂O₂特异性生物传感器roGFP2-Orp1。该探针可在斑马鱼幼鱼中瞬时或稳定表达。此外，其比率型信号输出可降低因基因表达差异或体积效应导致的假象检测概率。首先，我们展示如何分离并培养瞬时表达roGFP2-Orp1的斑马鱼胚胎来源的视网膜神经节细胞（RGCs）。随后，利用完整幼鱼监测H₂O₂ 组织水平的检测。该传感器已通过添加 H 进行验证₂O₂此外，该方法还可用于测量 H₂O₂ 通过构建在特定组织中表达生物传感器的转基因动物，检测特定细胞类型和组织中的信号水平。由于斑马鱼便于进行遗传和发育操作，本文展示的方法可作为研究H功能的实验流程₂O₂ 在脊椎动物神经元及一般胚胎发育过程中。

引言

活性氧（ROS）信号通路调控神经系统的发育与功能¹。细胞内重要的活性氧来源之一是NADPH氧化酶（NOX），这是一类跨膜蛋白，可生成超氧阴离子和过氧化氢（H₂O₂）²。NOX酶广泛存在于中枢神经系统（CNS）中，由NOX产生的活性氧参与神经元的发育过程^3,4,5,6。研究表明，神经干细胞的维持与分化、神经元极性的建立、神经突起的生长以及突触可塑性均依赖于适当水平的活性氧^7,8,9,10,11。另一方面，NOX酶过度产生活性氧则与多种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、多发性硬化症和创伤性脑损伤^12,13

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南，在2020年7月24日获得普渡大学动物护理与使用委员会（PACUC）的伦理审查和批准，批准协议号为2006002050。

1. 溶液的配制

1. E2 培养基（1x）
   1. 通过混合 表 1 中列出的所有组分，配制 100x E2A（500 mL）、500x E2B（100 mL）和 500x E2C（100 mL）溶液。对 E2A、E2B 和 E2C 溶液进行高压灭菌，4 °C 保存。
   2. 配制 1x E2 培养基：取 5 mL 100x E2A、1 mL 500x E2B 和 1 mL 500x E2C，用无菌水定容至 500 mL，调节 pH 至 7.0–7.5。
   3. 将 1x E2 培养基分装为 50 mL 份量，-20 °C 保存以长期储存。但解冻时可能出现沉淀，请确保使用前沉淀完全溶解。

溶液

组分

量

结果

培养的斑马鱼RGCs在1天内延伸出轴突。一幅代表性的405/480比率图像显示了H₂O₂-生物传感器如图所示 图 4A细胞体、轴突和生长锥在单个神经元中清晰可见。这些神经元可在不同时间点接受不同处理，以监测 H₂O₂ 变化。我们先前发现，添加 100 µM H₂O₂ 向培养基中添加物质会提高比值，表明该系统能够检测到实时变化（图4)²⁴.

讨论

在整个实验方案中，有几个关键步骤需要 特别注意。我们认为，考虑这些要点将有助于改善实验流程。对于原代视网膜神经节细胞（RGC）培养而言，ZFCM(-) 培养基的无菌性非常重要，因为该培养基不含抗生素，在成像前或成像过程中可能发生污染。为避免污染，我们建议仅在生物安全柜内配制和使用 ZFCM(-)，并定期新鲜配制 ZFCM(-) 培养基（步骤 1.5）。此外，层粘连蛋白（laminin）储备液应保存在 -80 °C。解冻后的层粘连蛋白应始终存放于 4 °C，切勿将其置于室温下或反复冻融，否则会降低该蛋白促进神经突生长的活性。

在适当的时间解剖斑马鱼视网膜对于获得足够数量并能延伸轴突的视网膜神经节细胞（RGCs）至关重要。斑马鱼RGCs在受精后28小时（hpf）生成，并从32至36 hpf开始延伸轴突离开视网膜。因此，为确保RGCs充分分化，关键是要在28 hpf之后接种RGCs，最好在32至36 hpf之间进行。若在更早的时间点制备培养物，可能无法获得足够数量的RGCs，或所得RGCs在接种后24小时内可能无法延伸轴突。建议在成像时间超过30分钟时更换ZFCM(-)培养基，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 毫米培养皿	Sarstedt	83-3900
35 毫米玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-10-C
琼脂糖	Fisher Scientific	BP160-500
硼硅酸盐玻璃毛细管	Sutter/Fisher Scientific	NC9029378
二水合氯化钙	Fisher Scientific	C79-500
盖玻片	Corning	2850-22
一次性培养皿（100 × 15 毫米）	VWR	25384-094
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140087
葡萄糖	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
注射模具	Adaptive Science Tools	TU-1
倒置显微镜	Nikon	TE2000
层粘连蛋白	ThermoFisher Scientific	23017-015
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	710
含酚红的 Leibovitz L-15 培养基	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
不含酚红的 Leibovitz L-15 培养基	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
低熔点琼脂糖	Promega	V2111
mMessage mMachine SP6 转录试剂盒	Invitrogen	AM1340
NotI	New England Biolabs	R0189S
PBS	Hyclone/Fisher Scientific	SH3025601
青霉素/链霉素	ThermoFisher Scientific	15140122
酚红	Sigma Aldich	P0290
苯硫脲（PTU）	Sigma Aldich	P7629
气动微量注射泵	World Precision Instruments	PV820
聚-D-赖氨酸（PDL）	Sigma Aldich	P7280
QiaQUICK PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28104
重组小鼠 slit2	R&D Systems	5444-SL-050
丙酮酸钠	Sigma Aldich	P5280
Steritop 0.22 µm 滤器	Millipore	S2GPT05RE
TE 缓冲液	Ambion	AM9860
三卡因甲磺酸盐	Sigma Aldich	E10521
垂直移液器拉制仪	David Kopf Instruments	700C