方法文章

两种用于研究非致死性毒力表型的感染实验方法 白色念珠菌 使用 秀丽隐杆线虫

DOI：

10.3791/62170

⸱

2021年5月17日

 ,  , 
1Graduate Program in Genetics & Molecular Biology, Emory University, 2Department of Biology, Emory University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

真菌机会性病原体可引起危及生命的严重感染以及轻微感染，但在研究毒力时，非致死表型常被忽视。因此，我们建立了一种线虫模型，通过同时监测宿主的存活和繁殖情况来研究真菌毒力。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

尽管病原体可能对人类具有致命性，但其中许多病原体引起的感染类型表现型并不致命。Candida albicans 是一种人类机会性真菌病原体，是医院内感染的第四大常见原因，导致约40%的死亡率。然而，其他 C. albicans 感染症状较轻，极少致命，包括影响约75%女性的外阴阴道念珠菌病，以及主要影响婴儿、艾滋病患者和癌症患者的口咽念珠菌病。虽然小鼠模型最常用于研究 C. albicans 的致病机制，但这些模型主要评估宿主存活率，且成本高、耗时长，重复性有限。因此，已开发出多种微型模型系统，包括 Drosophila melanogaster、Danio rerio、Galleria mellonella 和 Caenorhabditis elegans，用于研究 C. albicans。这些微型模型非常适合筛选 C. albicans 的突变体文库或不同遗传背景。本文中，我们描述了两种利用 C. elegans 研究 C. albicans 感染的方法。第一种是繁殖力测定法，用于测量宿主的繁殖能力并监测单个宿主的存活情况；第二种是谱系扩增测定法，用于测量 C. albicans 感染对宿主种群在多代期间种群增长的影响。这两种方法共同提供了一种简单、经济高效的方式，可快速评估 C. albicans 的毒力。

引言

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Candida albicans 是一种机会性人类真菌病原体，可定植于多种生态位点，包括口腔、胃肠道和泌尿生殖道1。虽然通常以共生状态存在，C. albicans 仍可引起黏膜感染和血流感染，其中后者可能致命。C. albicans 感染的严重程度取决于宿主的免疫功能，免疫功能低下者比健康个体更易受感染1。除宿主相关因素外，C. albicans 还具备多种毒力特征，包括菌丝形成、生物膜形成、分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）的产生，这些因子有助于 C. albicans 黏附并侵入宿主上皮细胞2，以及一种细胞溶解性肽类毒素——白色念珠菌溶素（candidalysin）3,4。综上表明，C. albicans 的毒力是一种复杂的表型，源于病原体与其宿主环境之间的相互作用。因此，相较于体外 研究方法，使用可作为宿主环境的模式生物来研究其毒力更为适宜。

多种宿主模型，包括脊椎动物和无脊椎动物，已被开发用于研究 C. albicans 感染。小鼠模型被认为是金标准，常因其适应性与先天免疫系统，以及能够在全身和特定器官中监测疾病进展的能力而被使用。5然而，该宿主模型存在显著局限性，包括维持成本高、后代数量少，以及因样本量小而导致的统计效能降低和可重复性下降5因此，其他更简单的模式生物，例如斑马鱼（Danio rerio），果蝇（黑腹果蝇），蜡螟（Galleria mellonella）和线虫（秀丽隐杆线虫已开发出这些非哺乳动物模型生物，它们体型更小，所需实验室维护更少，且可实现更大的样本量，从而在统计效力和可重复性方面优于小鼠模型。在选择感染模型时，需考虑每种模型各自特有的优势与局限性。 G. mellonella 提供了与人类生理环境最为相似的条件，因其可在37 °C下培养，并含有多种吞噬细胞7此外，该模型允许直接注射特定的接种物7然而，目前尚无完整的测序基因组，也未建立有效的突变菌株构建方法。类似于 G. mellonella，该 D. rerio 模型允许直接注射特定的接种物5,7它同时具有适应性免疫系统和固有免疫系统5，这是该非哺乳动物模型所特有的，但需要使用水生养殖箱进行维持。 D. melanogaster 和 秀丽隐杆线虫 具有相似的优缺点，包括基因组已完全测序、易于操作以及可方便地构建突变菌株7 但不具有适应性免疫或细胞因子7在所有这些非哺乳动物模型中秀丽隐杆线虫 具有最快的生命周期，可通过自体受精产生大量遗传上完全相同的后代，并且最适合进行大规模筛选6,7,8. 秀丽隐杆线虫 在抗真菌药物的高通量筛选中已表现出极强的效能9,10，毒力因子的表征7，以及鉴定 白色念珠菌-特异性宿主防御网络11先天免疫系统在 秀丽隐杆线虫 具有与人类高度保守的多个组分12宿主的先天防御包括抗菌肽的产生13 （抗菌肽）和活性氧物种14,15,16.

C. albicans 感染的严重程度主要通过宿主存活率来衡量，但无法捕捉非致死性的毒力表型。宿主适应性中一个常被忽视的方面是繁殖能力，但多项研究表明，C. albicans 会通过降低精子活力影响繁殖能力17,18，提示这可能是研究宿主适应性的一个重要方面。因此，研究 C. albicans 感染对宿主繁殖力的影响，是研究非致死性毒力表型的有效方法。我们已开发出两种利用 C. elegans 的感染检测方法，用于研究健康宿主的存活和繁殖表型19,20。本文中，我们描述了繁殖力检测和谱系扩增检测两种方法。繁殖力检测可同时测量单个宿主产生的后代数量及其存活情况，而谱系扩增检测则评估感染在三代宿主中的累积效应。我们展示了如何利用这些检测方法筛选 C. albicans 基因敲除突变株，以捕捉致死性和非致死性毒力表型中显著或细微的差异。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 实验的准备工作

  1. 准备中 C. albicans 和 大肠杆菌 培养物
    注意：本研究中使用的小鼠品系列于 表1.
    1. 维持 C. albicans 和 E. coli 菌株以甘油保存液形式保存于 −80 °C。
    2. 使用无菌牙签，划线接种所需菌株 C. albicans 用固体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，1.5% 琼脂，0.004% 腺嘌呤，0.008% 尿苷）进行涂布，于 30 °C 培养过夜。
      ​注意：如果 白色念珠菌 菌株为营养缺陷型，需在培养基中补充必要的氨基酸。
    3. 使用无菌接种环或牙签，接种单个 C. albicans 将菌落接种至2 mL液体YPD培养基中，30 °C振荡培养24 h。
    4. 使用无菌牙签划线接种 E. coli （OP50）涂布于Luria肉汤（LB；10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L琼脂）琼脂平板上，30 °C过夜培养。
    5. 将单个OP50菌落接种至50 mL LB培养基中，30 °C振荡培养过夜。
  2. 线虫生长培养基制备
    1. 在2 L的烧瓶中，加入29 g线虫生长培养基粉末（NGM；17.5 g/L 琼脂，3.0 g/L 氯化钠，2.5 g/L 蛋白胨，0.005 g/L 胆固醇）至1 L水中，并用磁力搅拌子混匀。
    2. 为了抑制 E. coli 过度生长并允许 C. albicans 高压灭菌后，在NGM增殖培养基中添加0.2 g/L硫酸链霉素。
      ​注意：若使用NGM进行线虫培养，则无需添加链霉素。
  3. 维持线虫种群
    1. 铺加300 µL过夜培养的菌液 E. coli 使用金属涂布棒将菌液接种至制备好的NGM琼脂平板上。该技术称为接种。
    2. 让平板在室温（RT）下干燥。在30 °C条件下过夜培养平板。
    3. 每隔3-4天将线虫群体转移至新接种的NGM平板上以维持种群培养 E. coli储存于 20 °C。分块法是一种用于将线虫随机群体快速转移至新接种平板的技术，可使群体得以增殖。操作时，使用无菌刮铲从 NGM 琼脂平板上切取一小块正方形区域（1 英寸 × 1 英寸），小心地将该琼脂块转移至新的接种 NGM 平板，确保带有线虫的一面朝下，与新琼脂表面接触。8.
      注意： 秀丽隐杆线虫 在20 °C条件下培养约48小时后将产生后代 在同步线虫群体时值得考虑的因素。 秀丽隐杆线虫 在25 °C条件下培养的种群发育和繁殖速度更快，而在15 °C条件下培养的种群生长较慢。
  4. 线虫种群同步化
    1. 从在NGM/OP50上维持的现有线虫种群开始。
    2. 将约 3 mL M9 缓冲液加入含有线虫的 NGM 平板中。用缓冲液冲洗线虫卵，并用移液器尖端轻轻刮取琼脂表面的卵（卵容易粘附）。使用 P1000 移液器将含有卵和线虫的液体转移至 15 mL 锥形管中。为评估平板上残留卵的数量，使用解剖显微镜观察琼脂表面。
    3. 在 279 × g 和室温下将锥形管离心 2 分钟。
    4. 移除上清液，注意不要扰动线虫沉淀。
    5. 加入3 mL 25%次氯酸钠溶液（"警告" 操作时）
    6. 将管子倒置2分钟。使用解剖显微镜检查线虫是否死亡——死亡的线虫会呈笔直僵硬状且无运动能力。
      注意：此步骤仅能杀死现有的线虫，对卵的完整性无影响。
    7. 在279 × g、室温下离心2分钟。
    8. 去除上清液，将沉淀重悬于3 mL M9中。
    9. 在279 × g、室温下离心2分钟。
    10. 移除上清液，并将沉淀重悬于 300 µL M9 中。
    11. 使用解剖显微镜，用移液器吸取5 µL卵液置于小型培养皿中，检查卵的浓度。理想浓度应在20–100个卵之间。若培养液过稀，可通过离心并去除上清液来浓缩；若浓度过高，则加入更多M9缓冲液直至 达到所需浓度。
  5. 准备 C. albicans 和 E. coli 用于线虫感染的培养（接种）。
    1. 制备空白溶液。在比色皿中加入 900 µL ddH₂O。2O 和 100 µL 液体 YPD。
    2. 将比色皿插入分光光度计中。使用上箭头将波长设置为600纳米。点击按钮 "0 吸光度 100% 透光率" 设定空白溶液。
    3. 在新的比色皿中，加入 900 µL ddH₂O2O 和 100 µL 过夜酵母培养物。将空白溶液从分光光度计中取出，放入含有酵母溶液的比色皿。记录屏幕上显示的光密度值（不要按任何按钮）。将读数乘以 10（所测酵母溶液为 1 比 10 的稀释液）。
    4. 将培养物浓度调整至3.0 OD600/毫升，使用ddH₂O2在1.5 mL微量离心管中。1 OD600 约为 3 × 10-7 CFU/mL21.
      ​注意：如果 OD600 读数为6.7，3 OD/6.7 OD = 0.447 mL，加入447 µL的 C. albicans 将培养物转移至微量离心管中。以最大速度（16,873 × g）离心30秒。弃上清，加入1 mL ddH₂O重悬。2O.
    5. 转移过夜培养物 E. coli 将培养物转移至50 mL锥形管中。
    6. 在室温下以 279 x g 离心 2 分钟。
    7. 吸出大部分上清液，保留约 1 mL。
    8. 将沉淀物用剩余的上清液重悬，并转移至已预称重的1.5 mL微量离心管中。
    9. 将微量离心管以最大速度离心30秒。
    10. 使用1000 μL移液器吸除上清液，并称量最终沉淀物的质量。
    11. 稀释 大肠杆菌 至 200 mg/mL 于 ddH₂O 中2O.
    12. 使用主混合液计算（表2）并进行适当放大。

2. 繁殖力测定

注：代表性数据见补充表1，示意图见图1A。

  1. 获取或准备以下物品：35 mm × 10 mm 培养皿，添加 0.2 g/L 硫酸链霉素的 NGM 培养基大肠杆菌 OP50 培养物，LB，白色念珠菌 培养，YPD，金属接种针，M9缓冲液（3.0 g/L KH2PO4，6.0 g/L Na2HPO4，0.5 g/L NaCl，1.0 g/L NH4Cl），15 mL 圆锥形管。
    实验前两天
  2. 接种 C. albicans 在 2 mL YPD 中的菌株 E. coli 在50 mL LB培养基中接种OP50，30 °C过夜培养。
  3. 准备35 mm × 10 mm的NGM培养皿，NGM中添加0.2 g/L硫酸链霉素。所制备的培养皿数量应满足整个实验需求。建议每个处理设置10个重复。对于10个重复，共需使用70个培养皿。1 L NGM培养基可制备约250个培养皿。
    实验前一天
  4. 在第0天和第2天，接种含有链霉素的35 mm × 10 mm NGM琼脂平板 & 第3天，按照上述接种方案，使用主混合液浓度（表2）。将适量的预混液用移液器加至平板中央。无需涂布培养物，因为单个微生物生长斑点足以供宿主取食，并可使我们易于识别种子以外的宿主。室温下避光孵育平板过夜。
    注意：第0天的预混液包含50 µL的 "种子" 每次实验处理每个重复样本。第2至7天包含10 µL "种子" 每个实验处理组每份重复。由于线虫在同步接种到第0天培养板后48小时才会发育至L4期，因此没有第1天培养板。当线虫发育至L4期后，将单条线虫转移至第2天培养板。
对于1个重复E. coli (OP50) 对照条件C. albicans & E. coli (细菌菌株OP50)处理条件
OP50H2O总计OP50C. albicansH2O总计
第0天6.25 μl43.75 μl50 μl6.25 μl1.25 μl42.5 μl50 μl
第2至7天1.25 μl8.75 μl10 μl1.25 μl0.25 μl8.5 μl10 μl

表2：用于线虫繁殖力测定实验中感染线虫所需的 E. coli 和 C. albicans 培养物的总反应体系体积。

实验当天（第0天）

  1. 同步线虫，并将约50个卵接种至每块对照组平板（仅含OP50）和处理组平板的第0天重复组上C. albicans + OP50）。在 20 °C 下培养 48 小时。
    第2天
  2. 挑取单个L4期线虫进行转移8 从第0天的培养板转移至每块重复的第2天接种板。L4期宿主可通过其背部中央的一个微小凹陷来识别。22将从相同类型接种平板上孵化并成熟的线虫转移（例如，D0对照平板上的L4线虫必须转移至第2天对照平板）。
  3. 接种 C. albicans 在2 mL YPD中所需的培养物 E. coli （OP50 菌株）于 50 mL LB 培养基中
    第3天
  4. 将线虫从第2天的培养板转移到第3天的接种板上，注意记录每个重复组（即第2天的重复组A必须转移至第3天的重复组A培养板）。
  5. 将仅含卵的第2天和含单个成虫的第3天培养板在20 °C下孵育24 h。
  6. 在第4天，将35 mm × 10 mm含链霉素的NGM平板接种 & 5，每孔使用10 µL预混液（表2）并在室温下孵育平板24小时。
    第4天
  7. 将线虫从第3天的培养板转移至第4天接种的培养板。
  8. 将第3天和第4天的培养皿在20 °C下孵育24 h。
  9. 使用解剖显微镜，统计每个第2天培养板上的可存活子代数量。记录已死亡或不再存在于培养板上的重复样本（删失数据）。记录子代数量后，弃置第2天的培养板。
    注意：删失（censored）指线虫在培养板上消失的情况。这可能由于线虫爬离培养板所致。尽管在24小时观察窗口内较为少见，但死亡线虫的尸体也可能解体并融入琼脂中，从而导致删失。删失数据不纳入最终的子代数量和存活率数据分析。
  10. 接种新的培养物 白色念珠菌 在 2 mL YPD 中的菌株 E. coli （OP50）于50 mL LB培养基中。
    第5天
  11. 将线虫从第4天的培养板转移至第5天接种的培养板。
  12. 将第4天和第5天的培养皿在20 °C下孵育24 h。
  13. 统计每块第3天培养板上的可存活后代数量，记录已死亡或不再存在于板上的重复样本（删失数据）。记录后代数量后，弃置第3天的培养板。
  14. 在第6天，将35 mm × 10 mm含链霉素的NGM平板接种 & 7，每孔使用 10 µL 主混合液（表2）并在室温下孵育平板24小时。
    第6天
  15. 将线虫从第5天的培养板转移到第6天的接种培养板。
  16. 将第5天和第6天的培养板在20 °C下孵育24 h。
  17. 统计每个第4天培养板上的可存活子代数量。记录任何已死亡或不再存在于培养板上的重复样本（删失数据）。记录子代数量后，弃置第4天的培养板。
    第7天
  18. 将线虫从第6天的培养板转移至第7天接种的培养板。
  19. 将第6天和第7天的培养板在20 °C孵育24 h。
  20. 统计每个第5天培养板中的可存活子代数量。记录任何已死亡或不再存在于培养板上的重复样本（删失数据）。记录子代数量后，弃置第5天的培养板。
    第8天
  21. 统计每块第6天培养板上的可存活子代数量。记录已死亡或不再存在于培养板上的重复样本（删失数据）。记录子代数量后，弃置第6天的培养板。
    第9天
  22. 统计每个第7天培养板上的可存活子代数量。不要计入最大的线虫（亲代）。记录任何已死亡或不再存在于培养板上的重复样本（删失）。记录子代数量后，丢弃第7天的培养板。
    ​注意：该实验也可用于评估存活率。记录每条线虫的死亡时间。实验结束时，可比较各处理组在七天实验期间存活的线虫百分比。线虫有时会爬离食物/病原体来源，并试图攀爬培养皿的侧壁。在进行下一步操作前，应检查培养皿的所有区域。死亡的线虫通常会留下尸体。对于无法找到的线虫应予以删失处理，不得将其计为死亡个体。在子代数量和存活率的最终分析中，不得包含删失的数据。
  23. 使用 GraphPad Prism 软件，根据数据集的正态性，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或 Kruskal-Wallis 检验分析子代数量和晚期繁殖数据，并进行事后 Tukey 或 Dunn 多重比较检验，以确定处理组之间的显著差异。使用 Wilcoxon log-rank 检验检测生存曲线之间的差异。

3. 谱系扩增实验

注意：代表性数据见补充表2，示意图见图2A。

  1. 获取或准备以下材料：含有添加了0.2 g/L硫酸链霉素的NGM琼脂的100 mm × 15 mm培养皿、大肠杆菌（E. coli）OP50菌种、LB培养基、白色念珠菌（C. albicans）菌种、YPD培养基、M9缓冲液、金属接种针、15 mL锥形管。
    第 -2 天
  2. 将白色念珠菌（C. albicans）菌株接种于2 mL YPD培养基中，将大肠杆菌（E. coli）OP50接种于50 mL LB培养基中，于30 °C过夜培养。
    第 -1 天
  3. 在添加了链霉素的100 mm × 15 mm NGM琼脂平板上，每板加入300 µL主混合液（表3），使用无菌金属涂布器将主混合液均匀涂布于平板表面。于30 °C过夜培养。建议每个处理设置六个重复。因此，每个处理需准备七块平板（一块用于同步化的线虫，六块用于每组成年线虫）。
E. coli (OP50) 对照条件C. albicans & E. coli (OP50) 处理条件
对于1个重复样本OP50H2O总计OP50C. albicansH2O总计
1.25 μl8.75 μl10 μl37.5 μl7.5 μl255 μl300 μl

表3： 用于线虫谱系扩增实验感染所需的 E. coli 和 C. albicans 菌液主混合物体积。

线虫种群增长：第0天

  1. 同步线虫，并在每个对照组（仅 OP50）和处理组（C. albicans + OP50）的单个平板上接种 10–25 个卵，在 20 °C 下培养 48 小时。
    第 2 天：
  2. 从每个对照组和处理组第 0 天的平板中挑取一条 L4 期线虫，转移至相同处理条件的接种平板上。L4 期宿主可通过其身体背侧中央的一个微小囊状结构进行识别22。
  3. 在 20 °C 下继续培养 5 天（自同步起总计一周）。
    第 7 天：
  4. 使用 p1000 移液器，加入 5 mL M9 缓冲液冲洗每个平板上的全部线虫群体，并转移至 15 mL 圆底离心管中。
  5. 在 4 °C 下静置 1 小时，使线虫充分沉降，便于计数。
  6. 用 M9 缓冲液将每根离心管中的体积定容至 10 mL。
  7. 对每个生物学重复，取 20 µL 等分试样，计数其中的线虫数量。每个生物学重复重复计数 6 次，以获得 6 个技术重复。反向计算以确定总群体数量。若样品浓度过低（即每次计数少于 10 条线虫），则将线虫群体浓缩至更小体积的 M9 缓冲液中。
    注意：离心活体线虫不会对其造成损伤。
    示例计算：
    70 条宿主           =               X（总宿主数）
    20 µL（等分试样）                  10,000 µL（总体积）
  8. 根据数据集的正态性，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）或 Kruskal-Wallis 检验分析谱系扩增数据，并结合 GraphPad Prism 软件进行事后 Tukey 或 Dunn 多重比较检验，以识别处理组之间的显著差异。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们介绍两种用于测量的检测方法 C. albicans 使用非致死表型评估毒力 秀丽隐杆线虫 作为感染模型. 第一个检测是繁殖力检测，用于监测 C. albicans 感染影响单个宿主的子代产生与存活。第二个检测方法——谱系扩增，用于测量如何 C. albicans 感染对多代种群增长产生影响。

繁殖力测定实验包含多个衡量宿主适应性的指标 C. albicans 感染。为了评估如何 C. albicans 感染影响宿主适应性的两个不同指标——存活率和繁殖力，因此我们建立了繁殖力测定方法19，用于监测单个宿主。简言之，将单个宿主分离至对照平板（未感染）或 C. albicans 处理平板，每天观察并记录存活情况，持续七天，并记录每天产生的子代数量（图1A）。由于该检...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了两种用于测量真菌毒力的简单实验方法。这两种实验均利用 C. elegans 作为宿主系统，可同时监测宿主的致死性和非致死性表型。例如，繁殖力实验通过检测单个感染宿主的生殖能力，同时记录其个体存活情况。每日监测不仅可获得总子代数量，还可获取生殖时间及死亡时间。谱系扩增实验是在繁殖力实验基础上发展出的一种简化版本，操作更为便捷，因所需宿主转移次数和每日计数较少而减轻了工作量。该实验提供了一种多代、定量的综合指标，整合了宿主适应性的多个方面。这些实验方法可高效快速地筛选 C. albicans 菌株的毒力，包括突变菌株和多种临床分离株。此外，由于感染实验操作简便——宿主以病原体作为食物来源进行培养——该方法易于推广应用至其他微生物病原体，用于评估其毒力。

需要注意三个主要的技术要点。首先，在同步宿主种群以收集卵时，必须通过显微镜下观察宿主运动和/或宿主形态（死亡的宿主将不再呈正弦状）来密切监控漂白步骤的时间。一旦 L1 至成虫阶段的宿主死亡，应迅速离心并去除漂白液，以确保卵的完整性。其次，在进行繁殖力和谱系扩增实验时，关键是在同步化后 48 ...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Dorian Feistel、Rema Elmostafa 和 McKenna Penley 在实验方法开发和数据收集过程中提供的帮助。本研究由美国国家科学基金会（NSF）DEB-1943415 项目（MAH）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL Eppendorf 微量离心管 3810XMillipore SigmaZ606340
100 mm × 15 mm 培养皿Sigma-AldrichP5856-500EA
15 mL Falcon 锥形离心管Fisher Scientific14-959-70C
50 mL Falcon 锥形离心管Fisher Scientific14-432-22
腺嘌呤Millipore SigmaA8626
琼脂（颗粒状，细菌学级）Apex BioResearch Produces20-248
铝丝（95% 铂，32 号规格）Genesee Scientific59-1M32P
氯化铵Millipore Sigma254134
细菌涂布棒SP Scienceware21TP50
蛋白胨Fisher BioReagantsBP1420-500
一次性培养管（20 × 150 mm）FisherBrand14-961-33
解剖显微镜（NI-150 高强度照明器）Nikon Instrument Inc.
大肠杆菌秀丽隐杆线虫遗传中心OP50
葡萄糖Millipore Sigma50-99-7
中型培养皿（35 × 10 mm）Falcon353001
金属刮刀SP Scienceware8TL24
线虫生长培养基（NGM）Dot ScientificDSN81800-500
磷酸二氢钾SigmaP0662-500G
氯化钠Fisher ScientificBP358-1
磷酸钠Fisher ScientificBP332-500
硫酸链霉素Thermo-Fisher Scientific11860038
胰蛋白胨Millipore Sigma91079-40-2
尿苷Millipore SigmaU3750
野生型 C. elegans秀丽隐杆线虫遗传中心N2
酵母提取物Millipore Sigma8013-01-2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Underhill, D. M., Iliev, I. D. The mycobiota: interactions between commensal fungi and the host immune system. Nature Reviews Immunology. 14 (6), (2014).
  2. Ibrahim, A. S., Filler, S. G., Sanglard, D., Edwards, J. E., Hube, B. Secreted Aspartyl Proteinases and Interactions of Candida albicans with Human Endothelial Cells. Infection and Immunity. 66 (6), 3003-3005 (1998).
  3. Calderone, R. A., Fonzi, W. A. Virulence factors of Candida albicans. Trends in Microbiology. 9 (7), 327-335 (2001).
  4. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  5. Chin, V., Lee, T., Rusliza, B., Chong, P. Dissecting Candida albicans Infection from the Perspective of C. albicans Virulence and Omics Approaches on Host-Pathogen Interaction: A Review. International Journal of Molecular Sciences. 17 (10), 1643(2016).
  6. Elkabti, A., Issi, L., Rao, R. Caenorhabditis elegans as a Model Host to Monitor the Candida Infection Processes. Journal of Fungi. 4 (4), 123(2018).
  7. Arvanitis, M., Glavis-Bloom, J., Mylonakis, E. Invertebrate models of fungal infection. Biochimica et biophysica acta. 1832 (9), 1378-1383 (2013).
  8. Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. Journal of Visualized Experiments. (128), e56487(2017).
  9. Breger, J., et al. Antifungal Chemical Compounds Identified Using a C. elegans Pathogenicity Assay. PLoS Pathogens. 3 (2), 18(2007).
  10. Okoli, I., et al. Identification of antifungal compounds active against Candida albicans using an improved high-throughput Caenorhabditis elegans assay. PloS one. 4 (9), 7025(2009).
  11. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans Infection of Caenorhabditis elegans Induces Antifungal Immune Defenses. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002074(2011).
  12. Kim, D. H., Ausubel, F. M. Evolutionary perspectives on innate immunity from the study of Caenorhabditis elegans. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 4-10 (2005).
  13. Kim, D. H., et al. A Conserved p38 MAP Kinase Pathway in Caenorhabditis elegans Innate Immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  14. van der Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generated Reactive Oxygen Species Trigger Protective SKN-1 Activity via p38 MAPK Signaling during Infection in C. elegans. PLoS Pathogens. 7 (12), 1002453(2011).
  15. van der Hoeven, R., Cruz, M. R., Chávez, V., Garsin, D. A. Localization of the Dual Oxidase BLI-3 and Characterization of Its NADPH Oxidase Domain during Infection of Caenorhabditis elegans. PLOS ONE. 10 (4), 0124091(2015).
  16. Chávez, V., Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 Generates Reactive Oxygen Species as a Protective Innate Immune Mechanism in Caenorhabditis elegans. Infection and Immunity. 77 (11), 4983-4989 (2009).
  17. Vander, H., Prabha, V. Evaluation of fertility outcome as a consequence of intravaginal inoculation with sperm-impairing micro-organisms in a mouse model. Journal of Medical Microbiology. 64, Pt_4 344-347 (2015).
  18. Castrillón-Duque, E. X., Suárez, J. P., Maya, W. D. C. Yeast and Fertility: Effects of In Vitro Activity of Candida spp. on Sperm Quality. Journal of Reproduction & Infertility. 19 (1), 49-55 (2018).
  19. Feistel, D. J., et al. A Novel Virulence Phenotype Rapidly Assesses Candida Fungal Pathogenesis in Healthy and Immunocompromised Caenorhabditis elegans Hosts. mSphere. 4 (2), (2019).
  20. Feistel, D. J., Elmostafa, R., Hickman, M. A. Virulence phenotypes result from interactions between pathogen ploidy and genetic background. Ecology and Evolution. 10 (17), 9326-9338 (2020).
  21. Mitchell, B. M., Wu, T. G., Jackson, B. E., Wilhelmus, K. R. Candida albicans Strain-Dependent Virulence and Rim13p-Mediated Filamentation in Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (2), 774-780 (2007).
  22. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook - Introduction. WormAtlas. , (2006).
  23. Yuan, X., Mitchell, B. M., Hua, X., Davis, D. A., Wilhelmus, K. R. The RIM101 Signal Transduction Pathway Regulates Candida albicans Virulence during Experimental Keratomycosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (9), 4668-4676 (2010).
  24. Davis, D., Edwards, J. E., Mitchell, A. P., Ibrahim, A. S. Candida albicans RIM101 pH Response Pathway Is Required for Host-Pathogen Interactions. Infection and Immunity. 68 (10), 5953-5959 (2000).
  25. Chamilos, G., et al. Candida albicans Cas5, a Regulator of Cell Wall Integrity, Is Required for Virulence in Murine and Toll Mutant Fly Models. The Journal of Infectious Diseases. 200 (1), 152-157 (2009).
  26. Bruno, V. M., et al. Control of the C. albicans Cell Wall Damage Response by Transcriptional Regulator Cas5. PLoS Pathogens. 2 (3), 21(2006).
  27. Davis, D. Adaptation to environmental pH in Candida albicans and its relation to pathogenesis. Current Genetics. 44 (1), 58(2003).
  28. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A Pathogenesis Assay Using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans Reveals Novel Roles for Yeast AP-1, Yap1, and Host Dual Oxidase BLI-3 in Fungal Pathogenesis. Eukaryotic Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  29. De, A., Sahu, A. K., Singh, V. Bite size of Caenorhabditis elegans regulates feeding, satiety and development on yeast diet. bioRxiv. , 473256(2018).
  30. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M. Immune defense mechanisms in the Caenorhabditis elegans intestinal epithelium. Current Opinion in Immunology. 24 (1), 3-9 (2012).
  31. Smith, A. C., Hickman, M. A. Host-Induced Genome Instability Rapidly Generates Phenotypic Variation across Candida albicans Strains and Ploidy States. mSphere. 5 (3), 00433(2020).
  32. Palominos, M. F., Calixto, A. Quantification of Bacteria Residing in Caenorhabditis elegans Intestine. BIO-PROTOCOL. 10 (9), (2020).
  33. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a Model Organism for Investigating Immunity. Applied and Environmental Microbiology. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  34. Liberati, N. T., et al. Requirement for a conserved Toll/interleukin-1 resistance domain protein in the Caenorhabditis elegans immune response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6593-6598 (2004).

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