两种用于研究非致死性毒力表型的感染实验方法 白色念珠菌 使用 秀丽隐杆线虫

摘要

真菌机会性病原体可引起危及生命的严重感染以及轻微感染，但在研究毒力时，非致死表型常被忽视。因此，我们建立了一种线虫模型，通过同时监测宿主的存活和繁殖情况来研究真菌毒力。

摘要

尽管病原体可能对人类具有致命性，但其中许多病原体引起的感染类型表现型并不致命。Candida albicans 是一种人类机会性真菌病原体，是医院内感染的第四大常见原因，导致约40%的死亡率。然而，其他 C. albicans 感染症状较轻，极少致命，包括影响约75%女性的外阴阴道念珠菌病，以及主要影响婴儿、艾滋病患者和癌症患者的口咽念珠菌病。虽然小鼠模型最常用于研究 C. albicans 的致病机制，但这些模型主要评估宿主存活率，且成本高、耗时长，重复性有限。因此，已开发出多种微型模型系统，包括 Drosophila melanogaster、Danio rerio、Galleria mellonella 和 Caenorhabditis elegans，用于研究 C. albicans。这些微型模型非常适合筛选 C. albicans 的突变体文库或不同遗传背景。本文中，我们描述了两种利用 C. elegans 研究 C. albicans 感染的方法。第一种是繁殖力测定法，用于测量宿主的繁殖能力并监测单个宿主的存活情况；第二种是谱系扩增测定法，用于测量 C. albicans 感染对宿主种群在多代期间种群增长的影响。这两种方法共同提供了一种简单、经济高效的方式，可快速评估 C. albicans 的毒力。

引言

Candida albicans 是一种机会性人类真菌病原体，可定植于多种生态位点，包括口腔、胃肠道和泌尿生殖道¹。虽然通常以共生状态存在，C. albicans 仍可引起黏膜感染和血流感染，其中后者可能致命。C. albicans 感染的严重程度取决于宿主的免疫功能，免疫功能低下者比健康个体更易受感染¹。除宿主相关因素外，C. albicans 还具备多种毒力特征，包括菌丝形成、生物膜形成、分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）的产生，这些因子有助于 C. albicans 黏附并侵入宿主上皮细胞²，以及一种细胞溶解性肽类毒素——白色念珠菌溶素（candidalysin）^3,4。综上表明，C. albicans 的毒力是一种复杂的表型，源于病原体与其宿主环境之间的相互作用。因此，相较于体外 研究方法，使用可作为宿主环境的模式生物来研究其毒力更为适宜。

多种宿主模型，包括脊椎动物和无脊椎动物，已被开发用于研究 C. albicans 感染。小鼠模型被认为是金标准，常因其适应性与先天免疫系统，....

方案

1. 实验的准备工作

1. 准备中 C. albicans 和 大肠杆菌 培养物
   注意：本研究中使用的小鼠品系列于 表1.
   1. 维持 C. albicans 和 E. coli 菌株以甘油保存液形式保存于 −80 °C。
   2. 使用无菌牙签，划线接种所需菌株 C. albicans 用固体酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，1.5% 琼脂，0.004% 腺嘌呤，0.008% 尿苷）进行涂布，于 30 °C 培养过夜。
      ​注意：如果 白色念珠菌 菌株为营养缺陷型，需在培养基中补充必要的氨基酸。
   3. 使用无菌接种环或牙签，接种单个 C. albicans 将菌落接种至2 mL液体YPD培养基中，30 °C振荡培养24 h。
   4. 使用无菌牙签划线接种 E. coli （OP50）涂布于Luria肉汤（LB；10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L琼脂）琼脂平板上，30 °C过夜培养。
   5. 将单个OP50菌落接种至50 mL LB培养基中，30 °C振荡培养过夜。
2. 线虫生长培养....

结果

在这里，我们介绍两种用于测量的检测方法 C. albicans 使用非致死表型评估毒力 秀丽隐杆线虫 作为感染模型. 第一个检测项目为繁殖力，用于监测 C. albicans 感染影响单个宿主的子代产生与存活。第二个检测方法——谱系扩增，用于测量如何 C. albicans 感染对多代种群增长产生影响。

繁殖力测定实验包含多个衡量宿主适应性的指标 C. albicans 感染。为了评估如何 C. albicans 感染影响宿主适应性的两个不同指标——存活率和繁殖力，因此我们建立了繁殖力测定方法¹⁹，用于监测单个宿主。简言之，将单个宿主分离至对照平板（未感染）或 C. albicans 处理板每天观察一次，持续七天，记录存活情况，并统计每天产生的子代数量（图1A）。由于该.......

讨论

本文介绍了两种用于测量真菌毒力的简单实验方法。这两种实验均利用 C. elegans 作为宿主系统，可同时监测宿主的致死性和非致死性表型。例如，繁殖力实验通过检测单个感染宿主的生殖能力，同时记录其个体存活情况。每日监测不仅可获得总子代数量，还可获取生殖时间及死亡时间。谱系扩增实验是在繁殖力实验基础上发展出的一种简化版本，操作更为便捷，因所需宿主转移次数和每日计数较少而减轻了工作量。该实验提供了一种多代、定量的综合指标，整合了宿主适应性的多个方面。这些实验方法可高效快速地筛选 C. albicans 菌株的毒力，包括突变菌株和多种临床分离株。此外，由于感染实验操作简便——宿主以病原体作为食物来源进行培养——该方法易于推广应用至其他微生物病原体，用于评估其毒力。

需要注意三个主要的技术要点。首先，在同步宿主种群以收集卵时，必须通过显微镜下观察宿主运动和/或宿主形态（死亡的宿主将不再呈正弦状）来密切监控漂白步骤的时间。一旦 L1 至成虫阶段的宿主死亡，应迅速离心并去除漂白液，以确保卵的完整性。其次，在进行繁殖力和谱系扩增实验时，关键是在同步化后 48 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL Eppendorf 微量离心管 3810X	Millipore Sigma	Z606340
100 mm × 15 mm 培养皿	Sigma-Aldrich	P5856-500EA
15 mL Falcon 锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-70C
50 mL Falcon 锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22
腺嘌呤	Millipore Sigma	A8626
琼脂（颗粒状，细菌学级）	Apex BioResearch Produces	20-248
铝丝（95% 铂，32 号规格）	Genesee Scientific	59-1M32P
氯化铵	Millipore Sigma	254134
细菌涂布棒	SP Scienceware	21TP50
蛋白胨	Fisher BioReagants	BP1420-500
一次性培养管（20 × 150 mm）	FisherBrand	14-961-33
解剖显微镜（NI-150 高强度照明器）	Nikon Instrument Inc.
大肠杆菌	秀丽隐杆线虫遗传中心	OP50
葡萄糖	Millipore Sigma	50-99-7
中型培养皿（35 × 10 mm）	Falcon	353001
金属刮刀	SP Scienceware	8TL24
线虫生长培养基（NGM）	Dot Scientific	DSN81800-500
磷酸二氢钾	Sigma	P0662-500G
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1
磷酸钠	Fisher Scientific	BP332-500
硫酸链霉素	Thermo-Fisher Scientific	11860038
胰蛋白胨	Millipore Sigma	91079-40-2
尿苷	Millipore Sigma	U3750
野生型 C. elegans	秀丽隐杆线虫遗传中心	N2
酵母提取物	Millipore Sigma	8013-01-2