小鼠膝状神经节神经元对味觉刺激反应的活体钙成像

摘要

本文介绍了如何暴露一只活体、麻醉状态下的实验小鼠的膝状神经节，并利用钙成像技术记录这些神经元群体对不同味觉刺激的反应，从而实现使用多种刺激物进行多次重复实验。该方法可用于深入比较哪些神经元对哪些味觉物质产生反应。

摘要

在过去的十年中，基因编码钙指示剂（GECIs）的技术进步推动了活体功能成像领域的革命。这些技术以钙信号作为神经元活动的代理指标，能够实时监测大型神经元群体中单个细胞对多种刺激的反应。我们及其他研究者已将这些技术应用于成像活体麻醉小鼠舌部施加味觉刺激后，单个膝状神经节神经元的反应。膝状神经节由支配舌前部和腭部的味觉神经元胞体组成，同时也包含部分支配耳廓的躯体感觉神经元。利用GCaMP对膝状神经节神经元的味觉诱发反应进行成像，不仅提供了有关野生型小鼠中这些神经元调谐特性的关键信息，还为检测基因操作小鼠中外周味觉神经异常连接表型提供了有效手段。本文将演示暴露膝状神经节的手术步骤、GCaMP荧光图像采集、数据分析的初步步骤以及常见问题的解决方法。该技术可结合转基因表达的GCaMP使用，也可通过AAV介导表达GCaMP，并可进一步改造以成像特定遗传标记的神经元亚群（例如通过Cre介导的GCaMP表达）。总体而言，膝状神经节神经元的活体钙成像是一种监测外周味觉神经元活动的强大技术，可为传统的整体神经鼓索神经记录或味觉行为检测提供互补的信息。

引言

哺乳动物外周味觉系统的一个关键组成部分是膝状神经节。除了部分支配耳廓的躯体感觉神经元外，膝状神经节还包含支配舌前部和腭部的味觉神经元胞体。与其他外周感觉神经元类似，膝状神经节神经元为假单极神经元，其长轴突外周投射至味蕾，中枢投射则到达脑干的孤束核¹。这些神经元主要由口腔内味觉刺激物激活味觉受体细胞后释放的ATP所激活^2,3。ATP是味觉信号传导中必不可少的神经递质，而味觉神经节神经元表达的P2rx受体对其激活至关重要⁴。由于味觉受体细胞表达针对特定味觉模式（甜、苦、咸、鲜或酸）的特异性味觉受体，因此有假说认为味觉神经节神经元对味觉刺激的反应也应具有高度选择性⁵。

整体神经记录研究表明，鼓索神经和大岩浅神经均将代表全部五种味觉模式的味觉信号传导至膝状神经节^6,7。然而，这仍留下关于神经元对特定味物质反应特异性的疑问：是否存在味觉模式特异性的神经元、多模态神经元，或两者兼有。单纤维记录可提供更多有关单个纤维活动及其化学敏感性的信息^8,

方案

动物实验方案已通过德克萨斯大学圣安东尼奥分校机构动物护理和使用委员会的审查和批准。

1. 术前准备

注意：此处未涉及设备的初始设置，因为设置方法会根据所使用的泵系统、显微镜、相机和成像软件的不同而有所差异。有关设置说明，请参考设备供应商提供的操作指南。作者所用设备的具体信息，请参见材料表。

1. 确保所有载体液（水）和味觉刺激物管路中有液体流过。若管路堵塞，请断开并用水冲洗。若管路弯折，请揉捏直至液体流通。确保液体能够按指令准时开始和停止流动。
2. 确认所有管路均无堵塞后，运行载体液 10 秒，然后关闭所有阀门。
3. 确保成像软件已准备就绪，并设置好所有必要参数（例如试验时长、文件名、帧率等）。使用开源图像采集软件 µManager，在标有 Exposure Time 的字段中输入 200 ms，以实现每秒 5 帧的采集速度，在 binning 选项下选择 x2，然后点击标有 Live 的按钮。当视频开始播放时，点击左侧标有 ROI 的按钮。这将生成 512x512 的视野范围。

2. 动物的麻醉与固定

注意：以下方案....

结果

根据实验方案，对一只转基因 Snap25-GCaMP6s 动物进行镇静，暴露其膝状神经节，并在舌头上施加味觉刺激物，同时记录视频。本实验的目的是确定每种味觉刺激物可引发哪些细胞产生反应。所使用的味觉刺激物包括：30 mM AceK、5 mM 奎宁、60 mM NaCl、50 mM IMP + 1 mM MPG、50 mM 柠檬酸¹⁸ 用去离子水溶解后，施加于舌头上持续2秒，期间以13秒的去离子水间隔。

图2：使用活体 GCaMP6s 成像技术记录膝状神经节神经元对味觉刺激物的反应。

讨论

本研究描述了一种逐步手术暴露膝状神经节并利用GCaMP6s直观记录其神经元活动的实验方案。该操作流程与先前报道的方法¹⁷非常相似，但存在几处显著差异。首先，使用头部固定装置可在手术过程中方便地调整头部位置。其次，在刺激递送方式上，Wu和Dvoryanchikov的方法通过食管导管输送味觉刺激物¹⁷，而本方案则使用加样针将液体直接递送至口腔内。这两种方法均可有效刺激菌状乳头和腭部味蕾，成功诱发膝状神经节神经元的反应。

关于保持清晰成像视野的注意事项：在打开耳蜗后，窝腔内会持续有液体渗出，包括直接覆盖在膝状神经节上的液体。此外，出血也可能遮蔽膝状神经节。尽管少量液体渗出可能尚不足以影响成像，但即使微量血液也可能完全遮挡神经节。这些问题可通过几种方式加以解决。首先，若渗出量较轻，可在每次实验间隙使用连接吸管并配有钝头给液针的吸液装置清除液体。另外，也可通过将吸水尖端小心地置于第七脑神经后方或侧方，将液体从视野中导出。若液体流动特别严重，可能需要在成像过程中对窝腔持续施加负压吸引。通过精确放置吸.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 把 #5 不锈钢镊子	Fine Science Tools	NC9792102
1 ml 带鲁尔锁的注射器	Fisher Scientific	14-823-30
2 把 #3 不锈钢镊子	Fine Science Tools	M3S 11200-10
27 号钝头分配针	Fisher Scientific	NC1372532
3M Vetbond 组织粘合剂	Fisher Scientific	NC0398332
4-40 机螺螺母（六角）	Fastenere	3SNMS004C
4-40 内六角圆柱头螺钉	Fastenere	3SSCS04C004
吸水尖	Fisher Scientific	50-930-668
乙酰磺胺酸钾	Fisher Scientific	A149025G
人工泪液	Akorn	59399-162-35
BD 过敏原托盘（带永久固定针头）	Fisher Scientific	14-829-6D
钝性牵开器	FST	18200-09
面包板	Thor Labs	MB8
柠檬酸	Fisher Scientific	A95-3
Cohan-Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-02
Contemporary Ortho-Jet 液体材料	Lang	1504
Contemporary Ortho-Jet 粉末材料	Lang	1520
棉签	Fisher	19-062-616
定制头部固定柱支架	eMachineShop		参见附件文件 202410.ems
定制金属头部固定柱	eMachineShop		参见附件文件 202406.ems
直流温度控制器	FHC	40-90-8D
数字相机，sCMOS OrcaFlash4 显微镜安装型	Hamamatsu	C13440
解剖显微镜	Leica	M80
毛发修剪器	Kent Scientific	CL7300-Kit
IMP	Fisher Scientific	AAJ6195906
氯胺酮	Ketaved	NDC 50989-996-06
LED 冷光源	Leica Microsystems	KL300LED
鲁尔锁 1/16" 管路接头	Fisher	01-000-116
显微镜	Olympus	BX51WI
Mini-series 光学支架柱	Thorlabs	MS2R
MPG	Fisher Scientific	AAA1723230
MXC-2.5 可旋转探针夹具	Siskiyou	14030000E
NaCl	Fisher Scientific	50-947-346
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713A
加压空气	Airgas	AI Z300
奎宁	Fisher Scientific	AC163720050
自粘标签带	Fisher Scientific	159015R
硅胶夹管阀管路，1/32" × 1/16" 外径（按英尺计）	Automate Scientific	05-14
Sola SM 光源引擎	Lumencor
Snap25-2A-GCaMP6s-D	JAX	025111
学生用精细剪刀	Fine Science Tools	91460-11
外科探针	Roboz Surgical Store	RS-6067
外科探针支架	Roboz Surgical Store	RS-6061
缝线	Gütermann	02776
BD Intramedic 管路	Fisher Scientific	22-046941
两级气体调节器	Airgas	Y12FM244B580-AG
Tygon 聚氯乙烯管路 - 1/16"	Automate Scientific	05-11
Valvelink8.2 数字/手动控制器	Automate Scientific	01-18
Valvelink8.2 夹管阀灌流系统	Automate Scientific	17-pp-54
赛拉嗪	Anased	NADA# 139-236