可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

摘要

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。

摘要

细胞持续暴露于各种DNA损伤因子中，从而引发不同的细胞应答。运用生化与遗传学方法对于揭示DNA损伤位点处DNA修复复合物的招募与组装相关细胞事件至关重要。近年来，已开发出多种强大的工具以诱导位点特异性的DNA损伤。此外，一些新颖且具有里程碑意义的技术使我们能够在单细胞分辨率水平上，利用固定细胞和活细胞研究这些过程。尽管这些技术已被用于研究多种生物学过程，但本文重点介绍DNA修复领域中最常用的两种实验方案：荧光免疫染色（IF）和染色质免疫沉淀（ChIP）。将这两种方法与基于核酸内切酶的位点特异性DNA损伤技术相结合，可分别以定向且可控的方式可视化并量化DNA修复因子在基因组上的占据情况。这些技术为研究人员提供了强有力的手段，用以鉴定结合于受损基因组位点的新蛋白，以及这些蛋白在DNA修复过程中实现精细调控所必需的翻译后修饰。

引言

我们的基因组 constantly 面临着各种 DNA 损伤因子的挑战。这些损伤可能来源于环境因素，例如紫外线或辐射，也可能来源于内源性因素，例如氧化应激产生的代谢副产物或复制错误^1,2。这些损伤可影响一条或两条 DNA 链的完整性，若产生的错误持续存在，常会导致染色体易位和基因组不稳定性，进而可能引发肿瘤发生^3,4。为了维持基因组完整性，进化过程中已发展出多种修复系统。根据特定类型 DNA 损伤的化学和物理特性，可激活不同的修复机制。错配、无碱基位点、单链断裂以及 8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）可通过错配修复或碱基切除修复途径予以清除^5,6。由紫外线诱导的光产物和大体积加合物所造成的损伤，则可通过核苷酸切除修复（NER）或 DNA 双链断裂修复（DSBR）过程进行修复^7,8。NER 包含两个主要的亚通路：转录偶联 NER（TC-NER）和全基因组 NER（GG-NER）。在细胞周期的不同阶段，DNA 双链断裂发生后可激活两条亚通路：非同源末端连接（NHEJ）和同源重....

方案

1. 特异性蛋白质的免疫检测

1. 细胞培养与实验设置的准备
   1. 将U2OS细胞在添加了10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基中以单层形式培养。
      注意：为避免系统渗漏，在基于核酸内切酶诱导DNA损伤时，应使用经活性炭处理或无类固醇的培养基。
   2. 将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养至80%汇合度，每2–3天更换一次培养基。
   3. 吸除培养基，并用1× PBS洗涤细胞。使用胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱离。当细胞脱落后，加入培养基以终止胰蛋白酶活性，获得细胞悬液。
   4. 使用细胞计数板对细胞进行计数。将2 × 10⁴ 个细胞/mL/孔接种于24孔板中，每孔内放置无菌的12 mm圆形盖玻片。
   5. 将细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中孵育24小时，使其充分贴附于盖玻片上。
   6. 通过直接将损伤试剂加入培养基中，用10 ng/mL的新制癌菌素（NCS）处理细胞。在含NCS的培养基中孵育15分钟后，用1× PBS洗涤细胞，并向细胞中加入新鲜的完全培养基。或者，使用适当的试剂（如4-OHT）通过基于核酸内切酶的系统诱导双链断裂（DSB），此时无需更换培养基²²。
      注意：也可选择使用辐照诱导....

结果

可通过稳定转染或瞬时转染在细胞中研究定点诱导的双链断裂（DSB）修复过程。但需注意，稳定转染可确保获得均一的细胞群体，从而产生一致且更为可靠的细胞反应；而瞬时转染仅能使细胞群体中的一小部分细胞摄取并维持质粒，从而为实验引入异质性。建立基于ER-I-PpoI或ER-AsiSI核酸内切酶的细胞系统时，需使用50%汇合度的细胞群体，此类细胞对编码核酸内切酶的质粒转染效率更高。转染可采用市售的转染试剂，或基于病毒感染的方法。若需应用显微成像技术且采用瞬时转染，则可在转染后24小时加入4-羟基他莫昔芬（4-OHT）以诱导定点DSB，4-OHT可结合ER融合的核酸内切酶，促使其转入细胞核并诱导DSB形成。为确定最适时间点，可在4-OHT处理后的不同时间点，通过免疫荧光显微镜观察及Western blot检测γH2AX的表达水平。在生理条件下，每个细胞中通常可检测到最多10–15个γH2AX灶；而通过核酸内切酶（或其他未在此讨论的技术，如激光微辐照）可诱导形成明显的修复灶。典型的I-PpoI核酸内切酶通过在核糖体DNA（rDNA）区域诱导DSB，导致核仁周围出现增强的γH2AX信号。若DSB通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）途径修复，则.......

讨论

尽管DNA修复是一个相对较新的研究领域，但借助各种生物化学和显微技术，我们对这一领域的认识正在迅速扩展。保持遗传信息的完整性对细胞至关重要，因为参与修复过程的基因若发生突变，是导致肿瘤发生的主要原因之一，因此阐明DNA修复通路中的关键步骤具有重要意义。

生化技术（例如蛋白质印迹、免疫沉淀、质谱分析等）需要大量细胞，而所研究的修复过程仅代表目标细胞群体的某一瞬间状态。染色质免疫沉淀（ChIP）实验操作繁琐且存在诸多难点，在设计用于研究DNA双链断裂（DSB）修复过程的特定实验时，必须充分考虑多个关键因素。以下是一些具体示例：（I）细胞应充分裂解；强烈建议采用两步裂解法，即分别使用细胞裂解缓冲液和核裂解缓冲液，以确保染色质组分具有更高的可及性；（II）染色质的超声处理应避免过度或不足；超声条件需根据每种细胞类型预先优化；（III）应确定纯化抗体的合适用量，因为不同公司生产的针对同一蛋白的抗体具有不同的特性；（IV）为实现高效的免疫沉淀，每个实验条件下应使用25–30 µg的初始染色质；（V）应优化固定时间，因为过度固定可能导致远距离蛋白复合物发生交联，从而产生假阳性结果，而固定不足则可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
琼脂糖	Lonza	50004
抗生素-抗真菌溶液（100×），稳定化	Sigma Aldrich	A5955
抗γH2A.X（磷酸化S139）抗体	Abcam	ab26350
牛血清白蛋白第五组分	Biosera	PM-T1725
TrackIt™ 蓝/黄上样缓冲液	赛默飞世尔科技	10482035
含1.0 g/L葡萄糖、不含L-谷氨酰胺的DMEM	Lonza	12-707F
多西环素	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™ M-280 羊抗小鼠IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™ M-280 羊抗兔IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
乙醇	摩尔化学品	02910-101-340
胎牛血清（南美来源），符合欧盟标准	Gibco	ECS0180L
甲醛 37% 溶液，无酸	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™ 补充材料	赛默飞世尔科技	35050038
甘氨酸	Sigma Aldrich	50046
IPure试剂盒 v2	Diagenode	C03010015
异戊醇	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO₃	Sigma Aldrich	S5761
链霉菌卡津素产生的新生霉素	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS 粉末	Sigma Aldrich	L182-50-BC
苯酚	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
聚山梨酯20（Tween 20）	摩尔化学试剂	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™ 含DAPI的金抗荧光淬灭封片剂	赛默飞世尔科技	P36935
蛋白酶抑制剂混合物套装 I	罗氏	11873580001
蛋白酶K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs 抗体	Abcam	ab18192
RNase A	罗氏	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris乙酸盐-EDTA缓冲液	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	摩尔化学品	09370-006-340
猪胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T4799
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红	Gibco	15400054