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方法文章

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

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DOI：

10.3791/62175

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2021年8月21日

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。

摘要

细胞持续暴露于各种DNA损伤因子中，从而引发不同的细胞应答。运用生化与遗传学方法对于揭示DNA损伤位点处DNA修复复合物的招募与组装相关细胞事件至关重要。近年来，已开发出多种强大的工具以诱导位点特异性的DNA损伤。此外，一些新颖且具有里程碑意义的技术使我们能够在单细胞分辨率水平上，利用固定细胞和活细胞研究这些过程。尽管这些技术已被用于研究多种生物学过程，但本文重点介绍DNA修复领域中最常用的两种实验方案：荧光免疫染色（IF）和染色质免疫沉淀（ChIP）。将这两种方法与基于核酸内切酶的位点特异性DNA损伤技术相结合，可分别以定向且可控的方式可视化并量化DNA修复因子在基因组上的占据情况。这些技术为研究人员提供了强有力的手段，用以鉴定结合于受损基因组位点的新蛋白，以及这些蛋白在DNA修复过程中实现精细调控所必需的翻译后修饰。

引言

我们的基因组 constantly 面临着各种 DNA 损伤因子的挑战。这些损伤可能来源于环境因素，例如紫外线或辐射，也可能来源于内源性因素，例如氧化应激产生的代谢副产物或复制错误1,2。这些损伤可影响一条或两条 DNA 链的完整性，若产生的错误持续存在，常会导致染色体易位和基因组不稳定性，进而可能引发肿瘤发生3,4。为了维持基因组完整性，进化过程中已发展出多种修复系统。根据特定类型 DNA 损伤的化学和物理特性，可激活不同的修复机制。错配、无碱基位点、单链断裂以及 8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）可通过错配修复或碱基切除修复途径予以清除5,6。由紫外线诱导的光产物和大体积加合物所造成的损伤，则可通过核苷酸切除修复（NER）或 DNA 双链断裂修复（DSBR）过程进行修复7,8。NER 包含两个主要的亚通路：转录偶联 NER（TC-NER）和全基因组 NER（GG-NER）。在细胞周期的不同阶段，DNA 双链断裂发生后可激活两条亚通路：非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）1,9。NHEJ 是静止期细胞中的主要修复通路，可在细胞周期的所有阶段被激活，代表了一种较快但易出错的修复方式10。相反，HR 是一种无错修复通路，其通过姐妹染色单体间的序列同源性搜索来修复双链断裂，因此主要存在于 S 期和 G2 期11。此外，微同源介导的末端连接（MMEJ）是另一种不同于上述机制的双链断裂修复方式，它依赖于对断裂 DNA 末端侧翼的微同源序列进行切除后，以 KU70/80 和 RAD51 非依赖的方式重新连接。因此，MMEJ 被认为是易错且高度致突变的12。在 DNA 修复过程中，双链断裂可诱导 DNA 损伤应答（DDR），导致检查点激酶的激活，从而在修复期间阻滞细胞周期进程13,14,15。DDR 的激活是由于修复过程中的关键起始因子被募集至损伤位点并广泛扩散，进而促进修复焦点的形成。在此早期信号级联中，ATM（共济失调毛细血管扩张突变）激酶发挥着关键作用，它催化组蛋白变体 H2AX 在 Ser139 位点的磷酸化（称为 γH2AX），该修饰发生在损伤位点周围16。这一早期事件负责募集其他修复因子，并启动下游修复过程。尽管目前对修复焦点处募集蛋白的确切功能尚未完全阐明，但多个实验室已对修复焦点的形成及其动态变化进行了研究。这些标志物被广泛用于监测修复动力学，但其在修复过程中的精确作用仍不明确。由于 DNA 修复相关细胞过程具有重要意义但理解尚浅，迄今已开发出多种方法用于诱导并可视化 DDR。

已建立多种方法和系统用于诱导特定类型的DNA损伤。例如，某些试剂[如新制癌菌素（neocarzinostatin, NCS）、博来霉素（phleomycin）、博莱霉素（bleomycin）、γ射线照射、紫外线]可在基因组非特定位点随机诱导大量DNA断裂，而另一些方法（如内切核酸酶AsiSI、I-PpoI或I-SceI，以及激光条带照射）则可在已知的基因组位点诱导DNA断裂17,18,19,20,21。本文重点介绍目前用于研究哺乳动物和酵母细胞DNA损伤应答（DDR）的基于内切核酸酶的技术。除了阐述这些技术的基本原理外，我们还强调了它们各自的优点与局限性。

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方案

1. 特异性蛋白质的免疫检测

  1. 细胞培养与实验设置的准备
    1. 将U2OS细胞在添加了10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌溶液的DMEM培养基中以单层形式培养。
      注意：为避免系统渗漏，在基于核酸内切酶诱导DNA损伤时，应使用经活性炭处理或无类固醇的培养基。
    2. 将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润环境中培养至80%汇合度，每2–3天更换一次培养基。
    3. 吸除培养基，并用1× PBS洗涤细胞。使用胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱离。当细胞脱落后，加入培养基以终止胰蛋白酶活性，获得细胞悬液。
    4. 使用细胞计数板对细胞进行计数。将2 × 104 个细胞/mL/孔接种于24孔板中，每孔内放置无菌的12 mm圆形盖玻片。
    5. 将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育24小时，使其充分贴附于盖玻片上。
    6. 通过直接将损伤试剂加入培养基中，用10 ng/mL的新制癌菌素（NCS）处理细胞。在含NCS的培养基中孵育15分钟后，用1× PBS洗涤细胞，并向细胞中加入新鲜的完全培养基。或者，使用适当的试剂（如4-OHT）通过基于核酸内切酶的系统诱导双链断裂（DSB），此时无需更换培养基22。
      注意：也可选择使用辐照诱导DNA损伤，恢复时间可从30分钟至8小时不等，采用2–20 Gy的中子通量23。
    7. 将细胞在37 °C、含5% CO2的湿润环境中继续孵育1–8小时，以追踪DNA修复的动力学过程。
  2. 细胞固定
    ​注意：在以下步骤（步骤1.2–1.5）中，每个孔应使用300–500 µL溶液，以充分覆盖所有细胞。每次孵育和洗涤步骤（抗体孵育除外）均应在旋转摇床上轻柔振荡下进行。
    1. 在诱导双链断裂并完成细胞孵育后，移除贴壁细胞的培养基，并用1× PBS洗涤一次。
    2. 使用4%多聚甲醛-PBS溶液在25 °C下固定细胞20分钟。
  3. 细胞通透化
    1. 移除固定液，并用1× PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
    2. 移除PBS，加入溶于PBS中的0.2% Triton X-100，样本孵育20分钟。
  4. 封闭非特异性结合位点
    1. 用1× PBS洗涤细胞三次。
    2. 使用5% BSA（牛血清白蛋白V组分）溶于PBST（含0.1% Tween-20的1× PBS）中封闭非特异性结合位点，并将通透化后的样本至少孵育20分钟。
  5. 免疫荧光染色
    1. 将适量的一抗（如抗-γH2AX、抗-DNA-PKcs）用1% BSA-PBST溶液稀释后加入。将每张盖玻片倒置，覆盖在石蜡膜上预先滴加的10 µL稀释后抗-γH2AX抗体液滴上。
      注意：若进行共免疫染色，应将两种一抗适当稀释后共同加入同一份1% BSA-PBST溶液中。
    2. 将样本置于湿盒中，在4 °C下孵育1.5小时。
      注意：也可在4 °C下过夜孵育。
    3. 将盖玻片重新正面向上放回24孔板中，并用1× PBS洗涤三次，每次5分钟。
    4. 将适量的二抗用1% BSA-PBST溶液稀释后加入。将每张盖玻片倒置，覆盖在石蜡膜上预先滴加的10 µL稀释后二抗液滴上。
    5. 将样本置于湿盒中，在4 °C下孵育1小时。
    6. 将盖玻片重新正面向上放回24孔板中，并用1× PBS洗涤三次，每次5分钟。
    7. 在移除最后一次PBS洗涤液前，用镊子和针头小心取出盖玻片，将其倒置放置于载玻片上的封片剂液滴（含DAPI）上。
      ​注意：避免产生气泡。当封片剂干燥后，建议用指甲油密封盖玻片边缘，以防止样本皱缩。

2. 染色质免疫沉淀

  1. 细胞收集、交联、细胞与核裂解及DNA片段化
    1. 每个样品在150 mm培养皿中培养约5 x 106 个细胞/mL。
    2. 移除培养基，用预冷的1x PBS洗涤细胞两次。
    3. 用1%甲醛-PBS溶液固定细胞，将培养皿置于旋转摇床上，轻轻振荡20分钟。
      注意：甲醛具有挥发性，应始终新鲜配制工作液。某些甲醛溶液中可能含有甲醇以稳定其性质，但建议使用无甲醇的溶液，以避免对后续反应产生干扰。
    4. 加入125 mM甘氨酸终止固定反应，在旋转摇床上轻轻振荡，25 °C孵育5分钟。
    5. 将培养皿置于冰上，用预冷的1x PBS洗涤两次。
    6. 用预冷的1x PBS刮取细胞，并转移至15 mL锥形管中。
    7. 在4 °C下以2,500 x g离心5分钟。
    8. 小心吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL细胞裂解缓冲液[5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC（蛋白酶抑制剂混合物）]中，冰上孵育10分钟。
    9. 在4 °C下以2,500 x g离心5分钟。
    10. 小心弃去上清液，将沉淀重悬于500–1,500 µL核裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC）中，冰上孵育30–60分钟。将裂解物转移至适合超声处理的聚苯乙烯锥形管中。
      注意：由于核裂解缓冲液含有SDS，其在冰上会析出，溶液呈白色。超声处理后溶液应变为透明。
    11. 对裂解物进行超声处理，使DNA剪切至平均片段大小为300–1,000 bp。
      注意：超声处理的循环次数和条件应根据细胞类型和超声设备进行优化。片段小于200 bp不适合ChIP实验，因为可能导致核小体-DNA相互作用被破坏。
  2. 交联逆转、测定超声后片段大小
    1. 取100 µL超声处理后的样品用于验证染色质片段大小。剩余染色质应保存于−80 °C。
    2. 向每份100 µL样品中加入0.5 mg/mL RNase A，在37 °C孵育20分钟以激活RNase。
    3. 在65 °C孵育过夜。
    4. 次日，向每份样品中加入500 µg/mL蛋白酶K和0.5% SDS，在50 °C孵育3小时。
    5. 向每份样品中加入0.5体积酚和0.5体积氯仿-异戊醇混合液（24:1）。
    6. 涡旋振荡1分钟。
    7. 在13,000 x g下离心10分钟。
    8. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
    9. 向每份样品中加入1体积氯仿-异戊醇混合液（24:1）。
    10. 涡旋振荡1分钟。
    11. 在13,000 x g下离心10分钟。
    12. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
    13. 加入2.5体积96%乙醇和0.1体积3 M醋酸钠（pH 5.2）。
    14. 在−80 °C孵育至少20分钟。
    15. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
    16. 弃去乙醇，用400 µL 70%乙醇洗涤沉淀。
    17. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
    18. 弃去乙醇，将沉淀空气干燥。
    19. 将沉淀重悬于10 µL TE缓冲液中。
    20. 在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。超声处理后的染色质片段大小应在约500 bp左右。
      注意：应使用不含溴酚蓝的上样缓冲液，因为该染料大小约为500 bp，可能干扰染色质片段的准确检测。建议使用含二甲苯青腈的上样缓冲液，其迁移大小约为3,000 bp。
    21. 若染色质片段大小符合要求，将步骤2.1中冻存的染色质样品用3体积稀释缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EGTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC）稀释，并在4 °C下旋转混合10分钟。
      ​注意：此步骤旨在稀释核裂解缓冲液中的SDS，以避免其对后续反应（包括染色质浓度测定）产生干扰。
    22. 使用分光光度计在260/280 nm处测定染色质样品的DNA浓度。
  3. 磁珠准备、预清除及免疫沉淀
    1. 为预清除和免疫沉淀步骤准备磁珠（羊抗兔或羊抗鼠IgG）。用RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl和1X PIC）在4 °C下洗涤磁珠两次，每次10分钟。
    2. 将磁珠重悬于与步骤2.3.1中相同体积的RIPA缓冲液中。
    3. 每份样品取25–30 µg染色质，加入4 µL磁珠，在4 °C下旋转1–2小时进行预清除。
      注意：向每份染色质样品中加入RIPA缓冲液至终体积500 µL，以确保样品在旋转过程中充分混合。每组样品均需预留NAC（无抗体对照）和TIC（总输入对照）样品。TIC样品终体积最多为200 µL即可。
    4. 用磁力架沉淀磁珠，将上清液转移至新的微量离心管中。
    5. 向每份染色质样品（NAC和TIC除外）中加入适量抗体，在4 °C下旋转孵育过夜。
    6. 次日，向每份样品（TIC除外）中加入40 µL洗涤后的磁珠，在4 °C下旋转孵育过夜。
  4. 洗涤
    1. 用300 µL低盐缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC）在4 °C下旋转洗涤10分钟。
    2. 用300 µL高盐缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 1x PIC）在4 °C下旋转洗涤10分钟。
    3. 用300 µL LiCl缓冲液（250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8.0, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC）在4 °C下旋转洗涤10分钟。
    4. 用300 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0）旋转洗涤两次，每次10分钟，第一次在4 °C，第二次在25 °C。
  5. 洗脱
    1. 向磁珠中加入200 µL洗脱缓冲液（1% SDS和100 mM NaHCO3），在65 °C的温控振荡器中孵育15分钟，持续振荡（约400 RPM）。将上清液转移至新管中，再用200 µL洗脱缓冲液重复洗脱一次。合并两次洗脱液（终体积400 µL）。
    2. 向每份样品中加入NaCl至终浓度200 mM。TIC样品补充200 µL洗脱缓冲液，并同样加入NaCl。
      ​注意：从本步骤起，TIC样品应与其他样品在相同条件下处理。
    3. 在65 °C（不振荡）孵育至少6小时。
    4. 向每份样品中加入1 mL预冷的100%乙醇，轻轻翻转混匀两次，在−80 °C沉淀DNA过夜。
    5. 次日，在4 °C下以13,000 x g离心30分钟。
    6. 弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀。
    7. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
    8. 弃去上清液，将沉淀空气干燥。
    9. 将沉淀重悬于100 µL TE缓冲液中，每份样品加入0.5 mg/mL RNase A，在37 °C孵育20分钟以激活RNase。
  6. 交联逆转
    1. 加入500 µg/mL蛋白酶K和0.5% SDS，50 °C孵育2小时。
      注意：若后续进行ChIP-seq，应避免使用酚-氯仿抽提，因其会抑制下游NGS流程。建议使用市售试剂盒（参见材料表）。
    2. 向每份样品中加入0.5体积酚和0.5体积氯仿-异戊醇混合液（24:1）。
    3. 涡旋振荡1分钟。
    4. 在13,000 x g下离心10分钟。
    5. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
    6. 向每份样品中加入1体积氯仿-异戊醇混合液（24:1）。
    7. 涡旋振荡1分钟。
    8. 在13,000 x g下离心10分钟。
    9. 将上层水相转移至新的微量离心管中。
  7. DNA提取
    1. 加入2.5体积96%乙醇和0.1体积3 M醋酸钠（pH 5.2）。
    2. 在−80 °C孵育至少20分钟。
    3. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
    4. 弃去乙醇，用400 µL 70%乙醇洗涤沉淀。
    5. 在4 °C下以13,000 x g离心10分钟。
    6. 弃去乙醇，将沉淀空气干燥。
    7. 将沉淀重悬于50 µL TE缓冲液中。

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结果

可通过稳定转染或瞬时转染在细胞中研究定点诱导的双链断裂（DSB）修复过程。但需注意，稳定转染可确保获得均一的细胞群体，从而产生一致且更为可靠的细胞反应；而瞬时转染仅能使细胞群体中的一小部分细胞摄取并维持质粒，从而为实验引入异质性。建立基于ER-I-PpoI或ER-AsiSI核酸内切酶的细胞系统时，需使用50%汇合度的细胞群体，此类细胞对编码核酸内切酶的质粒转染效率更高。转染可采用市售的转染试剂，或基于病毒感染的方法。若需应用显微成像技术且采用瞬时转染，则可在转染后24小时加入4-羟基他莫昔芬（4-OHT）以诱导定点DSB，4-OHT可结合ER融合的核酸内切酶，促使其转入细胞核并诱导DSB形成。为确定最适时间点，可在4-OHT处理后的不同时间点，通过免疫荧光显微镜观察及Western blot检测γH2AX的表达水平。在生理条件下，每个细胞中通常可检测到最多10–15个γH2AX灶；而通过核酸内切酶（或其他未在此讨论的技术，如激光微辐照）可诱导形成明显的修复灶。典型的I-PpoI核酸内切酶通过在核糖体DNA（rDNA）区域诱导DSB，导致核仁周围出现增强的γH2AX信号。若DSB通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HR）途径修复，则...

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讨论

尽管DNA修复是一个相对较新的研究领域，但借助各种生物化学和显微技术，我们对这一领域的认识正在迅速扩展。保持遗传信息的完整性对细胞至关重要，因为参与修复过程的基因若发生突变，是导致肿瘤发生的主要原因之一，因此阐明DNA修复通路中的关键步骤具有重要意义。

生化技术（例如蛋白质印迹、免疫沉淀、质谱分析等）需要大量细胞，而所研究的修复过程仅代表目标细胞群体的某一瞬间状态。染色质免疫沉淀（ChIP）实验操作繁琐且存在诸多难点，在设计用于研究DNA双链断裂（DSB）修复过程的特定实验时，必须充分考虑多个关键因素。以下是一些具体示例：（I）细胞应充分裂解；强烈建议采用两步裂解法，即分别使用细胞裂解缓冲液和核裂解缓冲液，以确保染色质组分具有更高的可及性；（II）染色质的超声处理应避免过度或不足；超声条件需根据每种细胞类型预先优化；（III）应确定纯化抗体的合适用量，因为不同公司生产的针对同一蛋白的抗体具有不同的特性；（IV）为实现高效的免疫沉淀，每个实验条件下应使用25–30 µg的初始染色质；（V）应优化固定时间，因为过度固定可能导致远距离蛋白复合物发生交联，从而产生假阳性结果，而固定不足则可...

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致谢

本研究由匈牙利国家研究、开发与创新办公室资助，项目编号为GINOP-2.3.2-15-2016-00020、GINOP-2.3.2-15-2016-00036、GINOP-2.2.1-15-2017-00052、EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009、NKFI-FK 132080，匈牙利科学院János Bolyai研究奖学金BO/27/20，ÚNKP-20-5-SZTE-265，EMBO短期奖学金8513，以及Tempus基金会提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-OHTSigma AldrichH7904
琼脂糖Lonza50004
抗生素-抗真菌溶液（100×），稳定化Sigma AldrichA5955
抗γH2A.X（磷酸化S139）抗体Abcamab26350
牛血清白蛋白第五组分BioseraPM-T1725
TrackIt™ 蓝/黄上样缓冲液赛默飞世尔科技10482035
含1.0 g/L葡萄糖、不含L-谷氨酰胺的DMEMLonza12-707F
多西环素Sigma AldrichD9891
Dynabeads™ M-280 羊抗小鼠IgGInvitrogen11202D
Dynabeads™ M-280 羊抗兔IgGInvitrogen11204D
EDTASigma AldrichE6758
EGTASigma AldrichE3889
乙醇摩尔化学品02910-101-340
胎牛血清（南美来源），符合欧盟标准GibcoECS0180L
甲醛 37% 溶液，无酸Sigma Aldrich1.03999
GlutaMAX™ 补充材料赛默飞世尔科技35050038
甘氨酸Sigma Aldrich50046
IPure试剂盒 v2DiagenodeC03010015
异戊醇Sigma AldrichW205702
LiClSigma AldrichL9650
NaClSigma AldrichS5886
Na-DOCSigma AldrichD6750
NaHCO₃Sigma AldrichS5761
链霉菌卡津素产生的新生霉素Sigma AldrichN9162
NP-40Sigma AldrichI8896
不含 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 PBS 粉末Sigma AldrichL182-50-BC
苯酚Sigma AldrichP4557
PIPESSigma AldrichP1851
聚山梨酯20（Tween 20）摩尔化学试剂09400-203-190
KClSigma AldrichP5405
ProLong™ 含DAPI的金抗荧光淬灭封片剂赛默飞世尔科技P36935
蛋白酶抑制剂混合物套装 I罗氏11873580001
蛋白酶KSigma AldrichP2308
P-S2056 DNAPKcs 抗体Abcamab18192
RNase A罗氏10109169001
CH3COONaSigma AldrichS2889
SDSSigma AldrichL3771
Tris乙酸盐-EDTA缓冲液Sigma AldrichT6025
Tris-HClSigma Aldrich91228
TRITON X-100摩尔化学品09370-006-340
猪胰蛋白酶Sigma AldrichT4799
胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红Gibco15400054

参考文献

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