可视化和量化基于内分泌酶的站点特定DNA损伤

Summary

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的基本步骤。这些协议通常用于研究DNA损伤相关的细胞过程，并可视化和量化与DNA修复有关的蛋白质的招募。

Abstract

细胞不断暴露在各种DNA损伤剂中，诱导不同的细胞反应。应用生化和遗传方法对于揭示与DNA损伤现场DNA修复复合物的招募和组装相关的细胞事件至关重要。在过去几年中，已经开发出几个强大的工具来诱导特定地点的DNA损伤。此外，新的开创性技术使我们能够使用固定细胞和活细胞在单细胞分辨率水平上研究这些过程。虽然这些技术已被用于研究各种生物过程，但在此我们提出了DNA修复、荧光免疫染色 （IF） 和色度素免疫沉淀 （ChIP） 领域使用最广泛的协议，这些协议结合了基于内分泌酶的特定部位 DNA 损伤，从而能够以定向和调节的方式可视化和量化 DNA 修复因子的基因组占用率， 分别。这些技术为研究人员提供了强大的工具，以识别与受损基因组细胞落结合的新型蛋白质，以及它们在DNA修复过程中微调调节所需的转化后修饰。

Introduction

我们的基因组不断受到各种DNA破坏剂的挑战。这些攻击可能来自环境来源，如紫外线或辐照，以及内源源，如代谢副产品造成的氧化应激或复制错误^1，2。这些病变会影响一个或两个DNA链的完整性，如果生成的错误变得持久，它经常导致转移和基因组不稳定，这可能导致肿瘤^3，4。为了保持基因组完整性，在进化过程中开发了多个修复系统。根据特定类型DNA损伤的化学和物理特性，可以激活多个修复机制。不匹配，基本站点，单线断裂，和8-牛瓜氨酸（8-oxoG）可以通过不匹配修复或基切除修复路径^5，6去除。由紫外线诱发的光产品和笨重的副产品引起的病变可以通过核苷酸切除修复 （NER） 或 DNA 双链断裂修复 （DSBR） 过程^7，8来修复。NER 由两个主要子通路组成:转录耦合 NER （TC-NER） 和全球基因组 NER （GG-NER）。关于细胞周期阶段，在DNA双链断裂诱导后，可以激活两个子通路:非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）1，9。

Protocol

1. 特定蛋白质的免疫检测

1. 细胞培养和实验设置的准备
   1. 在DMEM培养基的单层中保持U2OS细胞，辅以10%胎儿小腿血清、2mM谷氨酰胺和1%抗生素抗菌溶液。
      注意:对于基于内分泌酶的DNA损伤诱导，使用木炭处理或无类固醇介质，以避免系统泄漏。
   2. 在潮湿的 5% CO₂ 环境中在 37 °C 至 80% 的汇合度下生长细胞，每 2-3 天更新一次介质。
   3. 吸气介质，用1倍PBS清洗细胞。分离细胞与特林-EDTA解决方案。当细胞分离时，通过在细胞中加入培养介质来停止试金素活性，从而产生细胞悬浮。
   4. 使用细胞计数室计算细胞。板 2 x 10⁴ 细胞/mL/井在 24 井板上，每个井有无菌的 12 mm 圆形覆盖唇。
   5. 在潮湿的 5% CO 2 大气中，在 37 °C 下孵育₂₄ 小时的细胞，以便附着在覆盖唇上。
   6. 用10纳克/mL的新卡齐诺他汀（NCS）治疗细胞，将有害剂直接输送到培养的介质上。用含有NCS的介质孵育细胞15分钟，然后用1x PBS清洗它们，并在细胞中加入新鲜的补充培养介质。否则，使用适当的代理（即4-OHT）通过基于内分泌酶的系统诱导DSB，而不刷新介质^22。
      注意:或者，使用辐照诱导DNA损伤，从30分钟到8小时的恢复时间....

Results

研究细胞中由现场指导的DSB诱导修复过程可以通过稳定或瞬态瞬时感染来实现。然而，应该指出的是，稳定的转染确保了同质细胞群，从而提供了统一的、因此更可靠的细胞反应。在瞬态瞬态感染的情况下，只有一小部分细胞群占据并维持质粒，这为实验带来了多样性。建立ER-I-PpoI或ER-AsiSI内分泌酶细胞系统需要50%的汇流细胞群，这更有效地通过编码内分泌酶的质粒进行感染。对于转染，也可使用市售的转染试剂或基于病毒感染的方法。如果要应用微观可视化技术，并且需要瞬态瞬态变异，则定向 DSB 可在转染后 24 小时通过 4-OHT 添加诱导，该技术与 ER 融合的内核糖核结合，并允许核转移和 DSB 诱导。为了确定最合适的时间点，可以在4-OHT治疗后，在不同的时间点进行基于免疫荧光的显微镜和西式斑点检测。在生理条件下，每个细胞最多可检测到10-15+H2AX foci，并且可以通过内核糖（或这里未讨论的各种其他技术，例如激光微辐射）触发强修复foci的形成。典型的 I-PpoI 内分泌酶通过诱导核糖体 DNA （rDNA） 中的 DSB，导致在核细胞周围形成高架 +H2AX 信号。如果中断由 NHEJ 或 HR 修复，则修复的 foci 数量会随着时.......

Discussion

虽然DNA修复是一个相对较新的研究领域，但我们的知识正在各种生化和微观方法的帮助下迅速扩展。保存遗传信息对细胞至关重要，因为参与修复过程的基因发生突变是肿瘤的主要原因之一，因此阐明DNA修复途径的关键步骤至关重要。

生化技术（即西斑、免疫沉淀、质谱等）需要大量的细胞，所研究的修复过程是所需细胞群的快照。执行 ChIP 实验是费力的，麻烦和许多考虑，当设计特定的实验，以研究DSB修复的过程。以下步骤是一些示例:（I） 细胞应正确解解:强烈建议采用两步裂解法，使用单独的细胞和核裂解缓冲器，以确保色质分数（II）的可及性更高，不应过度或过低音速:应事先将适当的声波条件优化到每个细胞类型（III），确定适当数量的纯化抗体，因为针对不同公司相同蛋白质的抗体表现出非相同的特性（IV），用于有效的免疫沉淀，25-30微克初始染色质应在每个条件下使用（V），应优化适当的固定时间， 由于过度修复可以通过交叉连接遥远的蛋白质复合物而产生误报结果，而不足可以防止基于应用抗体的DNA与所需蛋白质（VI）之间的适当交叉连接，因此在洗涤过程中应仔细确定珠子（蛋白质A或G）的类型（VII），应彻底保持洗涤缓冲器.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-OHT	Sigma Aldrich	H7904
琼脂糖	Lonza	50004
抗生素 - 抗真菌溶液（100 次;），稳定的	Sigma Aldrich	A5955
抗 γ H 2 A。X（磷酸化 S139）抗体	Abcam	ab26350
牛血清组分 V 白蛋白	Biosera	PM-T1725
TrackIt™青色/黄色上样缓冲液	Thermo Fisher Scientific	10482035
DMEM，含 1.0 g/L 葡萄糖，不含 L-谷氨酰胺	Lonza	12-707F
多西环素	Sigma Aldrich	D9891
Dynabeads™M-280 绵羊抗小鼠 IgG	Invitrogen	11202D
Dynabeads™M-280 绵羊抗兔 IgG	Invitrogen	11204D
EDTA	Sigma Aldrich	E6758
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
乙醇	摩尔化学品	02910-101-340
胎牛血清（南美洲来源），欧盟批准的	Gibco	ECS0180L
甲醛 37% 溶液，无酸	Sigma Aldrich	1.03999
GlutaMAX™补充剂	Thermo Fisher Scientific	35050038
甘氨酸	Sigma Aldrich	50046
IPure 试剂盒 v2	Diagenode	C03010015
异戊醇	Sigma Aldrich	W205702
LiCl	Sigma Aldrich	L9650
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
Na-DOC	Sigma Aldrich	D6750
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761
来自卡兹诺链霉菌的新卡津他丁	Sigma Aldrich	N9162
NP-40	Sigma Aldrich	I8896
PBS 粉末，不含 Ca2+、Mg2+	Sigma Aldrich	L182-50-BC
苯酚	Sigma Aldrich	P4557
PIPES	Sigma Aldrich	P1851
聚山梨酯 20 （吐温 20）	摩尔化学品	09400-203-190
KCl	Sigma Aldrich	P5405
ProLong™含 DAPI 的金抗淬灭封片剂	Fisher Scientific	P36935
蛋白酶抑制剂混合物套装 I	罗氏	11873580001
蛋白酶 K	Sigma Aldrich	P2308
P-S2056 DNAPKcs 抗体	Abcam	ab18192
RNase A	罗氏	10109169001
CH3COONa	Sigma Aldrich	S2889
SDS	Sigma Aldrich	L3771
Tris乙酸-EDTA缓冲液	Sigma Aldrich	T6025
Tris-HCl	Sigma Aldrich	91228
TRITON X-100	摩尔化学品	09370-006-340
猪胰腺胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T4799
胰蛋白酶-EDTA （0.5%），无酚红	Gibco	15400054