基于荧光的测量磷酸酯/磷酸二醇 4-磷酸盐膜之间的交换

Summary

在这里，我们描述协议使用荧光脂质传感器和脂质体，以确定蛋白质提取物和运输磷酸二醇或磷二醇4磷酸盐 体外。

Abstract

进化保存的氧固醇结合蛋白（OSBP）相关蛋白质（ORP）/OSBP同源（Osh）家族的几个成员最近被发现代表了酵母和人类细胞中一种新的脂质转移蛋白（LTP）组。他们 通过 PS/磷脂蛋白4磷酸（PI（4）P）交换周期将磷脂蛋白（PS）从内质质视网膜（ER）转移到等离子体膜（PM）。这一发现有助于更好地了解PS，这对信号过程至关重要，如何在整个细胞中分布，并调查这个过程与磷酸二胺（PIP）代谢之间的联系。新的荧光协议的开发有助于在分子水平上发现和描述这种新的细胞机制 在体外 。本文描述了两个荧光标记脂质传感器NBD-C2_乳酸 和NBD-PH_FAPP的生产和使用，以测量蛋白质提取PS或PI（4）P的能力，并在人造膜之间转移这些脂质。首先，协议描述了如何生产、标记和获取这两种结构的高纯度样品。其次，本文解释了如何使用这些传感器与荧光微板读取器，以确定蛋白质是否可以提取PS或PI（4）P从脂质体，使用Osh6p作为案例研究。最后，本协议展示了如何准确测量定义脂质成分脂质体之间的 PS/PI （4）P 交换，以及使用标准荧光共振能量转移 （FRET） 确定脂质转移速率。

Introduction

不同膜之间和真核细胞膜内脂质的精确分布^1、2具有深远的生物学意义。解密LTP功能如何是细胞生物学中一个重要的问题，3、4、5、6和体外方法对于解决这个问题^有重要^价值。在这里，提出了一种体外、荧光为基础的策略，有助于确定几个ORP/Osh蛋白对PS/PI（4）P细胞膜¹²之间的交换有作用，从而构成一类新的LTP。 PS是一种阴离子血糖磷脂，占真核细胞总膜脂质的2-10%^{13、14、16<....}

Protocol

1. 净化NBD-C2_乳酸

注:虽然此协议详细说明了使用细胞干扰器来分解细菌，但可以修改它以使用其他裂解策略（例如， 法国媒体）。在净化开始时，必须使用新鲜脱气、过滤和补充 2 mM 二恶英 （DTT） 的缓冲器，以防止西斯坦的氧化。然而，对于蛋白质标签步骤，完全去除DTT至关重要。许多步骤必须在冰上或寒冷的房间里进行，以避免任何蛋白质降解。必须按照协议的不同步骤收集 30 μL 体积的样品，以便使用 15% 的丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 使用多乙酰硫化物- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 进行分析，以检查净化进度。将足够变性的Laemmli样品缓冲器与每个阿利奎特混合，并在95°C下加热混合物。 将管子冻结并储存在 -20 °C 下，直到分析。

1. 大肠杆菌中 GST-C2_乳酸的表达
   1. 将 20 μL 的 BL21 金质电池与 18 μL 的消毒水混合。然后，将 2 μL 的 pGEX-C2_乳酸 质粒（在 +65 ng/μL）与细菌混合，并通过电击将其转化。用150微升的自克隆伦诺克斯莱索根-布罗斯（LB）介质（10克/升试剂，5克/升酵母提取物，5克/升NaCl在去离子水中，无葡萄糖）重新使用细菌。让细菌在 2 mL 的夹盖微中心管中以 37 °C 1 h 的速度生长。
   2. 接种 25 mL 的 LB 介....

Results

图1:荧光脂质传感器和 体外 测定说明。 （A） NBD-C2_乳酸 酯和NBD-PH_FAPP 的三维模型基于牛乳酸（PDB ID:3BN6^48）的C2域晶体结构和人类FAPP1蛋白PH域的NMR结构（PDB ID:2KCJ^46）。一个 N， N '二甲基 -N- （硫乙酰） -N '-（7 - 硝基苯甲酸酯 - 2 - oxa - 1， 3 - 二甲苯 - 4 - yl） 乙烯胺莫伊蒂， 手工和能量最小化，嫁接到C352（NBD-C2_乳酸）和C13（.......

Discussion

这些检测的结果直接取决于荧光脂质传感器的信号。因此，这些探针的净化标有与 NBD 的 1:1 比率，并且没有免费的 NBD 氟污染，这是本协议中的关键步骤。还必须检查所检查的 LTP 是否正确折叠而不是聚合。在提取检测中测试的LTP量必须等于或高于可访问的PS或PI（4）P分子，以正确测量该LTP是否有效提取这些脂质。事实上，NBD-C2_乳酸和 NBD-PH_FAPP分别与 PS 和 PI （4）P 结合，遵循经典饱和结合曲线。鉴于它们对PS和PI（4）P的亲和力，即使脂质体含有这些配体的残余痕迹，这些探针仍在很大程度上与脂质体结合。这可能导致错误的结论，即LTP不能有效地提取这些脂质。该协议依赖于标准和商用 PC、PS 和 PI（4）P 亚种，分别为 18:1/18:1-PC、16:0/18:1-PS 和 16:0/16:0-PI（4）P。使用脂质物种与其他乙酰链进行实验可以给出不同的结果，如先前报道的^12，35。

在转移.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-半胱氨酸 >97 % （FG）	Sigma	W326305-100G	在水中制备 10 mM L-半胱氨酸储备液。等分试样储存在 -20 °C;C
2 mL 琥珀色样品瓶，PTFE/Rub Lnr，用于脂质在 CHCL3	Wheaton	W224681
4 mm 直径玻璃珠	Sigma	Z265934-1EA
50 mL 锥形离心管	Falcon
ÄKTA 净化器	GE Healthcare		FPLC
铝箔
Amicon Ultra-15，MWCO 为 3 和 10 kDa	Merck	UFC900324，UFC901024
Amicon Ultra-4，MWCO 为 3 和 10 kDa	Merck	UFC800324，UFC801024
氨苄青霉素			用过滤和灭菌的水制备 50 mg/mL 储备溶液，并将其储存在 -20 和摄氏度。
贝他丁	Sigma	B8385-10mg
BL21 Gold感受态细胞	安捷伦
C16：0 Liss （Rhod-PE） 在 CHCl3 （1 mg/mL） 中	Avanti 极性脂质	810158C-5MG
C16：0/C16：0-PI（4）P	Echelon Lipids	P-4016-3	1 mg C16：0/C16：0-PI（4）P 粉末溶于 250 µL of MeOH 和 250 µCHCl3 的 L。然后用 CHCl3 完成至 1 mL。解决方案必须变得清晰。
C16：0/C18：1-PS （POPS） 在 CHCl3 （10 mg/mL）
C18：1/C18：1-PC （DOPC） 在 CHCl3 （25 mg/mL）	Avanti 极性脂质	850375C-500mg
CaCl2			在水中制备 10 mM CaCl2 储备液。
细胞破坏物	恒定动力学
氯仿 （CHCl3） RPE-ISO	Carlo Erba	438601
不含 EDTA 的完全蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	5056489001
去离子 （Milli-Q） 水
二甲基甲酰胺 （DMF），无水，>99% 纯度
DNAse I 重组，不含 RNAse 的粉末	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	在 Milli-Q 水中制备 1 M DTT 储备液。制备 1 mL 等分试样并储存在 -20 °C 下。
Econo-Pac 层析柱 （1.5 & times; 12 cm）。	Biorad	7321010
电穿孔比色皿 2 mm	Ozyme	EP102
电穿孔仪 Eppendorf 2510	Eppendorf
固定角转子 Ti45 和 Ti45 管	贝克曼	旋转棒状裂解物
玻璃注射器（10、25 和 50 µL） 用于荧光实验	Hamilton
玻璃注射器（25、100、250、500 和 1000 µL） 处理脂质原液	汉密尔顿	1702RNR、1710RNR、1725RNR、1750RN 3 型、1001RN
胱甘肽琼脂糖凝胶 4B 珠子	GE Healthcare	17-0756-05
甘油（99% 纯度）	Sigma	G5516-500ML
带盖
HEPES，>99% 纯度	Sigma	H3375-500G
IllustraNAP 10 脱盐柱	GE Healthcare	GE17-0854-02
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG）	Euromedex	EU0008-B	在 Milli-Qwater 中制备 1 M IPTG 储备溶液。制备 1 mL 等分试样并储存在 -20 °C 下。
K-乙酸	Prolabo	26664.293
Lennox LB 肉汤培养基，不含葡萄糖			用 milli-Q 水制备并高压灭菌。
液氮	Linde
甲醇 （MeOH） ≥99.8%	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		制备 2 M MgCl2 溶液。使用 0.45 µM 过滤器。
微孔板 96 孔 PS F-Botom 黑色非结合	Greiner Bio-one	655900
微型挤出机，带两个 1 mL 气密 Hamilton 注射器	Avanti 极性脂质	610023
基于光栅的荧光读板器	TECAN	M1000 Pro
N，N'-二甲基-N-（碘乙酰基）-N'-（7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基）乙二胺）（IANBD 酰胺）	Molecular Probes		25 mg IANBD 溶于 2.5 mL 二甲基亚砜 （DMSO） 中，并制备 25 份 100 &微量的等分试样;L 溶于 1.5 mL 螺口盖管中。不要完全拧上盖子。然后，在冷冻干燥机中去除 DMSO，每管获得 1 mg 的干燥 IANBD。关闭试管并储存在 -20 °C 在黑暗中。
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM NaH2PO4、1.8 mM KH2PO4，高压灭菌并储存在 4 &°C。
梨形玻璃瓶（25 mL，14/23，杜兰玻璃）	杜兰组
胃蛋白酶抑制剂	Sigma	p5318-25mg
pGEX-C2<亚>LACT  质粒			可根据要求从我们的实验室获得
pGEX-PH<亚>FAPP质粒			可根据要求从我们的实验室获得
苯甲基磺酰氟 （PMSF）≥98.5% （GC）	Sigma	P7626-25g	在异丙醇磷酰胺中制备 200 mM PMSF 储备溶液
Phosphoramidon	Sigma	R7385-10mg
聚碳酸酯过滤器（直径 19 mm），孔径为 0.2 µm	Avanti 极性脂质	610006
Poly-Prep 层析柱（柱床体积为 0-2 mL，储液槽为 10 mL）	Biorad	7311550
预过滤器（直径为 10 mm）。	Avanti Polar Lipids	610014
PyMOL	http://pymol.org/		构建蛋白质的 3D 模型（图 1A）
用于紫外/可见荧光的石英比色皿（最小体积为 600 µL）	Hellma
石英比色皿	Hellma
冷冻离心机 Eppendorf 5427R	Eppendorf
旋转蒸发仪	Buchi	B-100
螺口盖微量离心管 （1.5 mL）	Sarsted
小型磁性 PFTE 搅拌棒 （5 & 2 mm）
卡扣式微量离心管 （0.5、1 和 2 mL）	Eppendorf
SYPRO orange			荧光染色剂检测 SDS-PAGE 凝胶中的蛋白质
Thermomixer	Starlab
凝血酶，来自人血浆	Sigma	10602400001	20 单位溶于 1 mL milli-Q 水中，制备 25 μ;L 等分试样，装在 0.5 mL Eppendorf 管中。然后冷冻并储存在 -80 °C 下。
Tris，超纯	MP	819623
超速离心机 L90K	贝克曼
紫外/可见光吸光度分光光度计	SAFAS
紫外/可见光荧光分光光度计，带温控池支架和搅拌装置	Jasco 或岛津	Jasco FP-8300 或岛津 RF-5301PC
真空室
水浴	Julabo
XK 16/70 色谱柱，填充 Sephacryl S200HR	GE Healthcare