本文描述了利用荧光脂质探针和脂质体来确定某种蛋白质是否提取并转运磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇4-磷酸的实验方案 体外.
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方法文章
基于荧光的膜间磷脂酰丝氨酸/磷脂酰肌醇-4-磷酸交换测量方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
近年来，人们发现进化上保守的氧化固醇结合蛋白（oxysterol-binding protein, OSBP）相关蛋白（ORP）/OSBP同源蛋白（Osh）家族中的多个成员代表了一类新型的脂质转移蛋白（lipid transfer protein, LTP），可在酵母和人类细胞中将磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）从内质网（endoplasmic reticulum, ER）转移至质膜（plasma membrane, PM）。 通过 PS/磷脂酰肌醇4-磷酸（PI(4)P）交换循环。该发现有助于更深入理解对信号传导过程至关重要的PS在细胞内的分布方式，以及这一过程与磷脂酰肌醇（PIP）代谢之间关联的研究。新型基于荧光的实验方案的开发在这一新细胞机制的发现与表征过程中发挥了关键作用。 体外 在分子水平上。本文描述了两种荧光标记脂质探针 NBD-C2 的制备与应用乳糖 和 NBD-PHFAPP，用于检测某种蛋白质提取磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）的能力，以及在人工膜之间转移这些脂质的能力。首先，本方案描述了如何制备、标记并获得这两种构建体的高纯度样品。其次，本文阐述了如何结合荧光酶标仪使用这些传感器，以Osh6p为实例，检测目标蛋白是否能够从脂质体中提取PS或PI(4)P。最后，本方案展示了如何利用标准荧光分光光度计，通过荧光共振能量转移（FRET）技术，精确测定由特定脂质组成脂质体之间的PS/PI(4)P交换动力学，并计算脂质转移速率。
引言
真核细胞不同膜之间及膜内脂质的精确分布1,2 具有深远的生物学意义。解析LTPs的功能机制是细胞生物学中的一个重要课题3,4,5,6，以及 体外 这些方法在解决这一问题方面具有重要价值7,8,9,10,11。在此，一种 体外, 提出了一种基于荧光的策略，该策略在证实多种ORP/Osh蛋白介导细胞膜间磷脂酰丝氨酸（PS）与磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）交换的过程中发挥了关键作用12 从而构成一类新的LTPs。PS是一种阴离子型甘油磷脂，在真核细胞膜脂质总量中占2-10%13,....
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方案
1. NBD-C2Lact 的纯化
注意：尽管本方案详细描述了使用细胞破碎仪裂解细菌的方法，但也可修改为采用其他裂解策略（例如， 使用高压匀浆器）。在纯化初期，必须使用新鲜脱气、过滤并添加了2 mM二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液，以防止半胱氨酸氧化。然而，在蛋白质标记步骤中，必须彻底去除DTT。许多操作步骤需在冰上或冷室中进行，以避免蛋白质降解。在实验方案的不同阶段，需采集30 µL体积的样品用于分析 使用15%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以检测纯化过程的进展。将足量的变性Laemmli上样缓冲液与各等份样品混合，于95 °C加热。待冷却后，于-20 °C冻存管中，直至分析。
- GST-C2 的表达乳糖 在 大肠杆菌
- 将20 µL BL21 Gold感受态细胞与18 µL无菌水混合。然后加入2 µL pGEX-C2质粒DNA乳糖 质粒（约65 ng/µL）与细菌混合，通过电穿孔法进行转化。用150 µL高压灭菌的Lennox Lysogeny-Broth重悬细菌 (LB) 培养基（10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 酵母提取物，5 g/L NaCl 溶于去离子水，不含葡萄糖）。将细菌置于 2 mL 带盖微量离心管中，在 37 °C 下培养 1 小时。 ....
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结果
图1：荧光脂质传感器的描述及 体外 检测方法 (ANBD-C2的三维模型乳糖 和 NBD-PHFAPP 基于牛乳粘素C2结构域的晶体结构（PDB ID: 3BN6）48）以及人源FAPP1蛋白PH结构域的NMR结构（PDB ID: 2KCJ）46）。一个 N,N'-二甲基-N-(硫代乙酰基)-N'-(7-硝基苯并.......
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讨论
这些检测的结果直接依赖于荧光脂质传感器的信号。因此，将这些探针以1:1的比例与NBD标记，并确保不含游离NBD荧光染料污染的纯化步骤，是本方案中的关键环节。同时，必须检测待研究的脂质转移蛋白（LTP）是否正确折叠且未发生聚集。在提取检测中所使用的LTP量必须等于或高于可及的磷脂酰丝氨酸（PS）或磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI(4)P）分子的数量，以准确评估该LTP是否能有效提取这些脂质。事实上，NBD-C2Lact和NBD-PHFAPP分别与PS和PI(4)P结合，其结合曲线符合经典的饱和结合模式。鉴于它们各自对PS和PI(4)P的亲和力，即使脂质体中含有微量残留的这些配体，这些探针仍会大量结合在脂质体上。这可能导致错误结论，即某种LTP无法有效提取这些脂质。本方案采用标准且可商业获得的磷脂酰胆碱（PC）、PS和PI(4)P亚型，分别为18:1/18:1-PC、16:0/18:1-PS和16:0/16:0-PI(4)P。 如先前报道所述，使用具有其他酰基链组成的脂质种类进行实验可能会得到不同的结果12,
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢 A. Cuttriss 博士对本文手稿的仔细校对。本工作由法国国家研究署资助项目 ExCHANGE（ANR-16-CE13-0006）以及法国国家科学研究中心（CNRS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| L-半胱氨酸 ≥97%（FG） | Sigma | W326305-100G | 用去离子水配制10 mM的L-半胱氨酸储备液。分装后于-20 °C保存 |
| 2 mL 棕色小瓶，带PTFE/橡胶内衬，用于CHCl3中脂质的储存 | Wheaton | W224681 | |
| 直径4 mm玻璃珠 | Sigma | Z265934-1EA | |
| 50 mL 锥形离心管 | Falcon | ||
| ÄKTA 纯化仪 | GE healthcare | FPLC | |
| 铝箔 | |||
| Amicon Ultra-15 超滤离心管，截留分子量为3 kDa和10 kDa | Merck | UFC900324, UFC901024 | |
| Amicon Ultra-4 超滤离心管，截留分子量为3 kDa和10 kDa | Merck | UFC800324, UFC801024 | |
| 氨苄青霉素 | 用过滤除菌的水配制50 mg/mL的储备液，并于-20 °C保存 | ||
| 亮肽素（Bestatin） | Sigma | B8385-10mg | |
| BL21 Gold 感受态细胞 | Agilent | ||
| C16:0 Liss （Rhod-PE）溶于CHCl3（1 mg/mL） | Avanti Polar Lipids | 810158C-5MG | |
| C16:0/C16:0-PI(4)P | Echelon Lipids | P-4016-3 | 将1 mg C16:0/C16:0-PI(4)P粉末溶于250 µL甲醇和250 µL CHCl3中，再用CHCl3补至1 mL，溶液应变为澄清 |
| C16:0/C18:1-PS（POPS）溶于CHCl3（10 mg/mL） | Avanti Polar Lipids | 840034C-25mg | |
| C18:1/C18:1-PC（DOPC）溶于CHCl3（25 mg/mL） | Avanti Polar Lipids | 850375C-500mg | |
| CaCl2 | Sigma | 用去离子水配制10 mM的CaCl2储备液 | |
| 细胞破碎仪 | Constant Dynamics | ||
| 氯仿（CHCl3），RPE-ISO级 | Carlo Erba | 438601 | |
| 不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail） | Roche | 5056489001 | |
| 去离子水（Milli-Q水） | |||
| 二甲基甲酰胺（DMF），无水，>99%纯度 | |||
| 重组DNA酶I，无RNA酶，粉末状 | Roche | 10104159001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | 用Milli-Q水配制1 M的DTT储备液。 分装为1 mL每管，于-20 °C保存 |
| Econo-Pac层析柱（1.5 × 12 cm） | Biorad | 7321010 | |
| 2 mm电穿孔比色皿 | Ozyme | EP102 | |
| Eppendorf 2510电穿孔仪 | Eppendorf | ||
| 固定角转子Ti45及Ti45离心管 | Beckman | 用于细菌裂解液的离心 | |
| 玻璃注射器（10、25和50 µL），用于荧光实验 | Hamilton | ||
| 玻璃注射器（25、100、250、500和1000 µL），用于处理脂质储备液 | Hamilton | 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN | |
| 谷胱甘肽Sepharose 4B珠 | GE Healthcare | 17-0756-05 | |
| 甘油（99%纯度） | Sigma | G5516-500ML | |
| 带盖溶血管 | |||
| HEPES，>99%纯度 | Sigma | H3375-500G | |
| Illustra NAP 10脱盐柱 | GE healthcare | GE17-0854-02 | |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Euromedex | EU0008-B | 用Milli-Q水配制1 M的IPTG储备液。分装为1 mL每管，于-20 °C保存 |
| 乙酸钾（K-Acetate） | Prolabo | 26664.293 | |
| 不含葡萄糖的Lennox LB培养基 | 用Milli-Q水配制并高压灭菌 | ||
| 液氮 | Linde | ||
| 甲醇（MeOH）≥99.8% | VWR | 20847.24 | |
| MgCl2 | Sigma | 配制2 M的MgCl2溶液，用0.45 µm滤膜过滤 | |
| 96孔黑色非结合型聚苯乙烯微孔板 | Greiner Bio-one | 655900 | |
| Mini-Extruder，配有两个1 mL气密型Hamilton注射器 | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| 基于单色仪的荧光酶标仪 | TECAN | M1000 Pro | |
| N,N'-二甲基-N-(碘乙酰基)-N'-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)乙二胺（IANBD酰胺） | Molecular Probes | 将25 mg IANBD溶于2.5 mL二甲基亚砜（DMSO）中，分装为25管，每管100 µL，置于1.5 mL螺口管中。盖子不要完全拧紧。然后用冻干机除去DMSO，每管得到1 mg干燥的IANBD。将管子密封后避光保存于-20 °C | |
| NaCl | Sigma | S3014-1KG | |
| PBS | 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM NaH2PO4，1.8 mM KH2PO4，高压灭菌后于4 °C保存 | ||
| 梨形玻璃烧瓶（25 mL，14/23，Duran玻璃） | Duran Group | ||
| 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin） | Sigma | p5318-25mg | |
| pGEX-C2LACT 质粒 | 可向本实验室申请获取 | ||
| pGEX-PHFAPP质粒 | 可向本实验室申请获取 | ||
| 苯甲基磺酰氟（PMSF）≥98.5%（GC） | Sigma | P7626-25g | 用异丙醇配制200 mM的PMSF储备液 |
| 磷酰胺（Phosphoramidon） | Sigma | R7385-10mg | |
| 聚碳酸酯滤膜（直径19 mm），孔径0.2 µm | Avanti Polar Lipids | 610006 | |
| Poly-Prep层析柱（床体积0–2 mL，带10 mL储液槽） | Biorad | 7311550 | |
| 预滤器（直径10 mm） | Avanti Polar Lipids | 610014 | |
| PyMOL | http://pymol.org/ | 构建蛋白质的三维模型（图1A） | |
| 用于紫外/可见光荧光检测的石英比色皿（最小体积600 µL） | Helma | ||
| 石英比色皿 | Helma | ||
| 冷冻离心机 Eppendorf 5427R | Eppendorf | ||
| 旋转蒸发仪 | Buchi | B-100 | |
| 螺口微量离心管（1.5 mL） | Sarsted | ||
| 小型聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子（5 × 2 mm） | |||
| 快封微量离心管（0.5、1和2 mL） | Eppendorf | ||
| SYPRO Orange | 用于SDS-PAGE凝胶中蛋白质的荧光染色 | ||
| 恒温混匀仪（Thermomixer） | Starlab | ||
| 人血浆凝血酶（THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA） | Sigma | 10602400001 | 将20单位溶于1 mL Milli-Q水中，分装为25 µL每管，置于0.5 mL Eppendorf管中。冻干后于-80 °C保存 |
| Tris，超纯 | MP | 819623 | |
| 超速离心机 L90K | Beckman | ||
| 紫外/可见光吸收分光光度计 | SAFAS | ||
| 带温控样品池和搅拌装置的紫外/可见光荧光分光光度计 | Jasco 或 Shimadzu | Jasco FP-8300 或 Shimadzu RF-5301PC | |
| 真空室 | |||
| 水浴锅 | Julabo | ||
| XK 16/70层析柱，填充Sephacryl S200HR | GE healthcare |
参考文献
- Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
- Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....
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