方法文章

创建禽类前脑嵌合体以评估面部发育

DOI：

10.3791/62183

⸱

2021年2月18日

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

本文内容

摘要

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本文介绍了一种设计用于检测基底前脑信号传导与模式形成特性的组织移植技术。 在颅面发育过程中。

摘要

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鸟类胚胎作为模式系统已被使用了一个多世纪，促进了对脊椎动物发育的基本理解。该模式系统的一个优势在于，可以在嵌合胚胎中直接评估组织之间的效应及其相互作用。我们先前已证明，前脑发出的信号通过调控前鼻外胚层区（FEZ）中音猬因子（SHH）表达区域的形态，参与面部形态发生。本文描述了构建前脑嵌合体的方法，并展示了这些实验结果的图示。

引言

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目前，发育生物学的许多研究重点集中在基因在胚胎形态形成过程中的作用。从遗传学角度研究发育机制已有较为完善的工具。然而，胚胎的构建及其形态发生是组织间相互作用的结果。鸟类系统是一种经典的工具，可用于评估调控发育过程中的多种组织相互作用，原因如下：其胚胎发育过程已被充分阐明，胚胎易于获取，针对鸟类系统的研究工具已相当成熟，且胚胎成本低廉。

近一个世纪以来，禽类移植系统已被广泛用于谱系示踪以及发育过程中组织相互作用的研究1,2,3,4。该系统曾被用于研究调控上颌形态发生的信号中心——前鼻外胚层区（Frontonasal Ectodermal Zone, FEZ）5，此前已有视频发表描述该技术6。除了鹌鹑-鸡嵌合系统外，其他物种也被用于构建嵌合体以分析组织间的相互作用。例如，小鼠的FEZ已从野生型7和突变型小鼠8中移植获得，此外还有研究利用鸭、鹌鹑和鸡系统来评估神经嵴在面部骨骼模式形成中的作用9,10,11,12。

本研究通过在鹌鹑、鸭和鸡胚胎之间相互移植前脑，评估前脑在调控额鼻外胚层（FEZ）基因表达模式中的作用，因为前脑来源的信号是诱导FEZ中Sonic hedgehog表达所必需的。前脑移植在该领域并非首次应用。此前已有研究利用此类移植来评估鹌鹑和鸭胚胎运动功能的发育13，但在那些实验中，同时移植了可形成非神经组织的细胞。在其他研究中，通过前脑移植评估了鸟类的听觉环路14，但这些移植物中包含了神经嵴前体细胞，而神经嵴细胞会影响面部形态9,10，并参与调控FEZ中的SHH表达15。因此，研究人员建立了一种在神经管闭合之前将一种鸟类的腹侧前脑移植到另一种鸟类中的体系，以专门评估大脑在面部形态形成中的作用16（图1A、B）。该方法避免了移植物中神经嵴细胞的污染。本文将图示该技术的操作流程，描述预期结果，并讨论实际操作中可能遇到的挑战。

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方案

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将北京鸭（Anas platyrhynchos）、白来航鸡（Gallus gallus）和日本鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）置于37 °C的加湿培养箱中孵育，直至发育至HH7/8期17。

1. 准备受体组织

注意：试剂和工具的准备以及如何打开鸡蛋以进行实验操作已在文献中描述6。

  1. 准备含有中性红的DMEM培养基、玻璃转移移液管和锋利的钨针。
  2. 暴露胚胎（如文献6所示）。
  3. 从7/8期胚胎前脑基底部的左侧获取组织移植物。使用弯曲的锋利钨针6，轻轻切取一块大小约为0.3 mm长、0.2 mm宽的前脑组织；操作时需将钨针插入前脑下方，使其与神经管轴线平行，以确保不包含深层的内胚层。
  4. 使用玻璃转移移液管从供体胚胎中拾取移植物。
  5. 将移植物转移至含有中性红（0.01% PBS溶液，23 °C）的DMEM中染色2分钟，随后将其放入不含中性红的DMEM中，待移植时使用。

2. 准备受体

  1. 将白来航鸡（Gallus gallus）的受精卵置于37 °C的湿润培养箱中孵育，直至发育至HH7/8阶段17。
  2. 暴露胚胎（如文献6所示）。
  3. 使用 sharpened tungsten needles，通过轻柔切割并移除左侧前脑基底部一块0.3 mm × 0.2 mm的组织，以制备移植物植入位点，操作方式与分离供体组织时相同。
  4. 注意避免过度损伤下方的内胚层，否则卵黄颗粒会从破损处渗出。该操作需要练习，且并非每次尝试都能成功。
  5. 将移植物转移至宿主后6，将其定位以替代宿主被切除的前脑基底部组织。
  6. 用胶带紧密封住开口，并将胚胎放回37 °C培养箱中，孵育适当时间后进行分析。

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结果

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嵌合体及移植物污染的评估
为了评估嵌合体，需明确嵌合程度以及移植物是否被其他细胞类型污染。通过将鹌鹑组织移植到鸡胚中可构建此类嵌合体，从而进行该分析。利用QCPN抗体可以可视化鹌鹑细胞，并将其与宿主组织区分开来（图1 C,D）。在此情况下，仅由前脑腹侧衍生的组织被抗体染色，表明移植物未被包括神经嵴在内的其他细胞类型污染。。 可通过体视学方法对这些切片进行分析，以计数宿主与供体细胞，或评估供体与宿主组织所占面积，从而估算嵌合程度。

形态学与分子结果的评估
本研究旨在评估腹侧前脑对面部形态以及面外侧区（FEZ）中SHH表达的影响。最初，将鹌鹑组织移植到鸭胚胎中，以便利用QCPN检测嵌合情况（如上所述）。然而，由于鹌鹑脑发育较快，导致嵌合体严重畸形（图2），因此该方法无法用于后续实验。...

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讨论

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本方法可用于研究基底前脑与邻近外胚层之间的组织相互作用。该方法与以往的前脑移植技术不同，因为供体组织仅限于前脑腹侧区域，从而避免了神经嵴细胞的移植；已知神经嵴细胞参与面部形态的模式形成9,10。因此，将移植物限定在基底前脑对于评估预定的实验结果至关重要。

在先前采用前脑移植的研究中13,14，额外的非神经组织并未干扰对预设结局指标的解释，因为这些结局指标要么是行为学方面的，要么专门用于检测宿主与供体环境对整体脑发育的影响。在设计使用这些胚胎学方法的实验时，这一点是一个重要的考虑因素，必须在可行性与严谨性之间取得平衡。例如，排除预定神经嵴细胞的要求带来了显著的技术困难。移植必须在神经胚早期的胚胎上进行。在此阶段，内胚层紧邻移植部位，因此必须格外小心以避免损伤内胚层，因为这会降低胚胎存活率。尽管尚不明确内胚层污染移植物是否会影响我们的结局指标，但本研究的...

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披露

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所有作者均无披露事项。

致谢

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本研究的资助来自美国国立卫生研究院下属的国立牙科与颅面研究所，项目编号为 R01DE019648、R01DE018234 和 R01DE019638。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 mm 培养皿Falcon1008
DMEMThermofisher11965084
持针器Fine Science Tools26016-12
中性红Sigma553-24-2
5 号杜蒙特镊子Fine Science Tools11252-20
巴斯德吸管Thermofisher13-678-6B
QCPN 抗体发育研究杂交瘤库，爱荷华大学，爱荷华州，美国
剪刀Fine Science Tools14058-11
钨针Fine Science Tools26000

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
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  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
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Sonic Hedgehog

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