鸡胚作为一种经典的发育模型，被我们实验室用于评估暴露于各种环境污染物后引起的发育性心脏毒性。本文描述了已建立的暴露方法以及形态学和功能评估方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
鸡胚是发育研究中的经典模型。在鸡胚发育过程中，心脏发育的时间窗口明确，且可通过多种方法相对容易地实现精确且及时的暴露。此外，鸡胚心脏发育过程与哺乳动物相似，最终均形成四腔心脏，因此在评估发育性心脏毒性方面具有重要的替代价值。在本实验室中，鸡胚模型被常规用于评估多种环境污染物（包括全氟和多氟烷基物质（PFAS）、颗粒物（PMs）、柴油机尾气（DE）以及纳米材料）暴露后引起的发育性心脏毒性。暴露时间可根据需要自由选择，从发育起始（胚胎发育第0天，ED0）直至孵化前一天均可。主要暴露方法包括气室注射、直接显微注射以及气室吸入法（本实验室首创），目前可检测的终点指标包括心脏功能（心电图）、形态学（组织学评估）以及分子生物学评估（免疫组织化学、qRT-PCR、蛋白质印迹等）。当然，鸡胚模型也存在自身局限性，例如可用抗体种类有限。然而，随着越来越多实验室开始采用该模型，其在发育性心脏毒性研究中将发挥重要作用。
引言
鸡胚是一种经典的发育生物学模型，已使用了两百多年1。与传统模型相比，鸡胚模型具有多种优势。首先，早在70多年前，Hamburger-Hamilton分期指南中就已非常清晰地描述了鸡胚的正常发育过程2，该指南定义了鸡胚发育过程中的46个分期，每个阶段均具有精确的时间节点和形态学特征，便于检测异常发育。此外，鸡胚模型还具有成本相对较低、数量充足、暴露剂量控制相对准确、在蛋壳内形成独立封闭的系统以及易于对发育中的胚胎进行操作等优点，这些特性均使其具备成为强大毒理学评估模型的潜力。
在心脏毒性研究中，鸡胚具有四腔心脏，与哺乳动物心脏相似，但心壁更厚，便于进行形态学评估。此外，鸡胚可用于发育阶段的吸入暴露实验，而这是哺乳动物模型无法实现的：在发育后期，鸡胚将从内呼吸转变为外呼吸（通过肺获取氧气）；后者需要鸡胚用喙刺破气室膜，开始呼吸空气3，从而使气室成为一个微型吸入暴露腔室。利用这一现象，无需专用的吸入暴露仪器，即可评估气体污染物对心脏（及其他器官）的毒理学效应。
本文描述了多种暴露/终点评估方法，这些方法均使其成为评估环境污染物暴露后发育性心脏毒性的有力工具。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有实验操作均经青岛大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在本实验室中，鸡蛋被放置于两台孵化器中进行孵化。鸡蛋在孵化器内直立放置，并随机分布于各层架上。孵化条件如下：孵化温度起始于37.9 °C，随着孵化进程逐渐降低至37.1 °C；湿度起始于50%，并逐渐升高至70%。
1. 暴露方法
注意：可通过多种方式使鸡胚暴露于环境污染物。本节将详细描述三种常规使用的方法。
- 气室注射（图1）
注意：这是鸡胚暴露的经典方法4,5,6，适用于多种物质，可在非常宽的时间窗口内进行，从发育初期（胚胎发育第0天，ED0）一直到出壳前一天（ED20）。以葵花籽油作为溶剂。先前的研究表明，未处理的胚胎与注射葵花籽油的胚胎在死亡率、孵化率或体重方面均未观察到显著差异7。- 准备以下必要的试剂/工具：75%乙醇、纸巾、金属探针（可用任何尖锐的金属针/棒/锥替代）、熔化的石蜡、毛刷、聚维酮碘溶液、移液器、移液器吸头、照蛋灯、给药混合液。使用葵花籽油配制给药混合液（推荐）
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
暴露结果
气室注射
气室注射可有效使发育中的鸡胚暴露于多种物质，这些物质随后可在收集的鸡胚或出壳雏鸡样本（如血清、组织等）中被检测到。以下是一个示例：通过气室注射全氟辛酸（PFOA），然后采用超高效液相色谱-质谱法测定血清中PFOA的浓度。血清中的PFOA浓度与注射剂量相对应，表明该方法的有效性（图6）。
显微注射
显微注射可使发育中的胚胎暴露于某些无法有效穿透内膜或作用时间较短的试剂中，例如慢病毒。以下是一个示例：采用该方法在胚胎发育第2天注射慢病毒后，在胚胎发育第15天的心脏中观察到明显的绿色荧光，表明慢病毒转染具有有效性（图7）。
气室灌注
气室灌注是一种新型方法，可能在外部呼吸起始阶段用于少量气体/气溶胶吸入暴露。以下是一个示例：在胚胎发育第18天和第19天将柴油尾气灌注至气室，导致心脏及肺组织出现显著的纤维化改变（图8
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
鸡胚作为发育研究的经典模型已有200年的历史1。本文所介绍的方法已成功用于评估多种环境污染物，包括全氟辛酸、颗粒物和柴油机尾气等5, 7,8,9,10,11,12。利用这些方法，能够以经济有效且清晰的方式指示发育性心脏毒性。此外，将鸡胚暴露于其他感兴趣的化合物并评估其潜在的发育性心脏毒性也并不困难。
气室注射法是一种经典方法，先前已在许多研究中使用13,14<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（项目编号：91643203、91543208、81502835）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 磷酸盐缓冲甲醛固定液 | Biosharp，中国合肥 | 货号：BL539A | |
| 75% 乙醇 | 国药，中国上海 | CAS：64-17-5 | |
| Biosignaling 监测仪 BL-420E+ | 泰盟，中国成都 | BL-420E+ | |
| 照蛋灯 | 振威，中国德州 | WZ-001 | |
| 一次性注射器 | 致远，中国江苏 | ||
| 孵蛋器 | 科宇，中国德州 | KFX | |
| 电子天平 | OHAUS，中国上海 | AR 224CN | |
| 电热恒温培养箱 | 申贤，中国上海 | DHP-9022 | |
| 无水乙醇 | 国药，中国上海 | CAS：64-17-5 | |
| 受精鸡胚 | 佳诺，中国济宁 | ||
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 碧云天，中国北京 | C0105 | |
| 组织学石蜡 | 阿拉丁，中国上海 | P100928-500g | 熔点 52~54°C |
| 组织学石蜡 | 阿拉丁，中国上海 | P100936-500g | 熔点 62~64°C |
| 静脉留置导管 | KDL，中国浙江 | 导管必须为柔软的塑料材质。 | |
| 慢病毒 | 吉凯基因，中国上海 | 慢病毒由吉凯基因分别设计/合成。 | |
| 马松三色染色试剂盒 | 索莱宝，中国北京 | G1340 | |
| 金属探针 | 金诺泰，中国北京 | ||
| 微量注射器（5 µL） | 安亭，中国上海 | ||
| 显微镜 | CAIKON，中国上海 | XSP-500 | |
| 切片机 | Leica，德国 | HistoCore BIOCUT | |
| 切片机刀片 | Leica，德国 | Leica 819 | |
| 戊巴比妥钠 | 亿泰科技有限公司， 中国武汉 | CAS：57-33-0 | |
| 移液器（10 µL） | Sartorius，德国 | ||
| 聚维酮碘 | 龙跃泉，中国泰安 | ||
| 剪刀 | 安其生，中国苏州 | ||
| 无菌生理盐水 | 科伦，中国成都 | ||
| 葵花籽油 | 美之嘉，中国江苏 | 任何市售供人食用的葵花籽油均可使用 | |
| 胶带 | M&G，中国上海 | ||
| 特氟龙 PVF 袋（5 L） | 德林，中国大连 | ||
| 涡旋混合器 | SCILOGEX，美国康涅狄格州罗基希尔 | MX-F | |
| 二甲苯 | 国药，中国上海 | CAS：1330-20-7 |
参考文献
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respir....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
