鸡胚作为一种经典的发育模型，被我们实验室用于评估暴露于各种环境污染物后引起的发育性心脏毒性。本文描述了已建立的暴露方法以及形态学和功能评估方法。
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本文内容
摘要
摘要
鸡胚是发育研究中的经典模型。在鸡胚发育过程中，心脏发育的时间窗口明确，且可通过多种方法相对容易地实现精确且及时的暴露。此外，鸡胚心脏发育过程与哺乳动物相似，最终均形成四腔心脏，因此在评估发育性心脏毒性方面具有重要的替代价值。在本实验室中，鸡胚模型被常规用于评估多种环境污染物（包括全氟和多氟烷基物质（PFAS）、颗粒物（PMs）、柴油机尾气（DE）以及纳米材料）暴露后引起的发育性心脏毒性。暴露时间可根据需要自由选择，从发育起始（胚胎发育第0天，ED0）直至孵化前一天均可。主要暴露方法包括气室注射、直接显微注射以及气室吸入法（本实验室首创），目前可检测的终点指标包括心脏功能（心电图）、形态学（组织学评估）以及分子生物学评估（免疫组织化学、qRT-PCR、蛋白质印迹等）。当然，鸡胚模型也存在自身局限性，例如可用抗体种类有限。然而，随着越来越多实验室开始采用该模型，其在发育性心脏毒性研究中将发挥重要作用。
引言
鸡胚是一种经典的发育生物学模型，已使用了两百多年1。与传统模型相比，鸡胚模型具有多种优势。首先，早在70多年前，Hamburger-Hamilton分期指南中就已非常清晰地描述了鸡胚的正常发育过程2，该指南定义了鸡胚发育过程中的46个分期，每个阶段均具有精确的时间节点和形态学特征，便于检测异常发育。此外，鸡胚模型还具有成本相对较低、数量充足、暴露剂量控制相对准确、在蛋壳内形成独立封闭的系统以及易于对发育中的胚胎进行操作等优点，这些特性均使其具备成为强大毒理学评估模型的潜力。
在心脏毒性研究中，鸡胚具有四腔心脏，与哺乳动物心脏相似，但心壁更厚，便于进行形态学评估。此外，鸡胚可用于发育阶段的吸入暴露实验，而这是哺乳动物模型无法实现的：在发育后期，鸡胚将从内呼吸转变为外呼吸（通过肺获取氧气）；后者需要鸡胚用喙刺破气室膜，开始呼吸空气3，从而使气室成为一个微型吸入暴露腔室。利用这一现象，无需专用的吸入暴露仪器，即可评估气体污染物对心脏（及其他器官）的毒理学效应。
本文描述了多种暴露/终点评估方法，这些方法均使其成为评估环境污染物暴露后发育性心脏毒性的有力工具。
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方案
所有实验操作均经青岛大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。在本实验室中，鸡蛋被放置于两台孵化器中进行孵化。鸡蛋在孵化器内直立放置，并随机分布于各层架上。孵化条件如下：孵化温度起始于37.9 °C，随着孵化进程逐渐降低至37.1 °C；湿度起始于50%，并逐渐升高至70%。
1. 暴露方法
注意：可通过多种方式使鸡胚暴露于环境污染物。本节将详细描述三种常规使用的方法。
- 气室注射（图1）
注意：这是鸡胚暴露的经典方法4,5,6，适用于多种物质，可在非常宽的时间窗口内进行，从发育初期（胚胎发育第0天，ED0）一直到出壳前一天（ED20）。以葵花籽油作为溶剂。先前的研究表明，未处理的胚胎与注射葵花籽油的胚胎在死亡率、孵化率或体重方面均未观察到显著差异7。- 准备以下必要的试剂/工具：75%乙醇、纸巾、金属探针（可用任何尖锐的金属针/棒/锥替代）、熔化的石蜡、毛刷、聚维酮碘溶液、移液器、移液器吸头、照蛋灯、给药混合液。使用葵花籽油配制给药混合液（推荐）4。若使用其他稀释剂，需设置溶剂对照组（与未处理胚胎比较）。
- 用聚维酮碘溶液（市售聚维酮碘溶液按1:5比例用去离子水稀释）清洁蛋壳表面，并用纸巾蘸取后轻拭蛋壳使其干燥，切勿用力擦拭，以免破坏蛋壳外层的保护膜。
- 在暗室中照蛋，并用铅笔标记气室位置。剔除蛋壳有裂纹的鸡蛋；剔除气室位于侧面而非钝端的鸡蛋，因其极难正常孵化。
- 用75%乙醇对气室区域进行消毒，然后用金属探针在气室中心钻一个小孔。切勿将探针深入气室内，否则可能损伤内膜，仅需用探针尖端击破蛋壳即可。若孔径不足以插入细小移液器吸头，可在原孔附近再次敲击蛋壳，直至孔径足够容纳10 µL移液器吸头插入。
- 剧烈涡旋混匀给药混合液，立即吸取至移液器吸头中。推荐注射体积为每10克蛋重注射1 µL（例如，50克的蛋注射5 µL），因为较大的注射体积可能导致胚胎缺氧或无氧环境。根据目标剂量（mg/蛋kg）计算给药溶液的浓度。
- 将移液器吸头插入孔中，使其尖端接触内膜。缓慢推出给药混合液，保持至少十秒钟（确保黏稠的油完全排出），然后移出吸头。
- 用毛刷蘸取少量熔化的石蜡封住孔洞。注意避免将熔化的石蜡滴落在内膜上。
- 封孔后，将鸡蛋放入孵育箱中，直至达到所需胚胎发育阶段。对于已开始发育的胚胎，应尽快完成整个操作过程，以防止因环境温度过低导致胚胎丢失。
- 显微注射（图2）
注意：这是一种更直接的暴露方法，可确保目标物质确切地进入胚胎，特别适用于作用时间较短的化合物（如慢病毒），因为传统的气室注射需要化合物穿透内膜所需的时间。若气室注射未能获得满意结果，也可尝试此方法。该方法最适合早期胚胎（至ED2），但也可用于较晚期胚胎（胚胎丢失风险较高）。- 准备以下必要的试剂/工具：75%乙醇、聚维酮碘溶液、微量注射器（5 µL）、金属探针（可用任何尖锐的金属针/棒/锥替代）、精细镊子、胶带。使用无菌生理盐水配制给药混合液，该盐水也可作为注射对照，不会显著影响孵化率。确保生理盐水无菌，因为污染的注射将显著增加死亡率。
- 按照步骤1.1.2所述方法清洁鸡蛋。
- 按照步骤1.1.3所述方法照蛋。
- 用75%乙醇对气室区域进行消毒，然后用金属探针在气室中心钻一个小孔。切勿将探针深入气室内，以免损伤内膜，仅需用探针尖端击破蛋壳。然后使用精细镊子小心扩大孔径至约2 mm，以便肉眼确认内膜。
- 将溶液装入微量注射器（最大注射体积：每10克蛋重0.5 µL，例如50克蛋注射2.5 µL），并将针头小心穿过孔洞插入内膜约2–3 mm。轻柔地释放溶液后撤出针头。操作时尽量使针头垂直于膜面。
- 用一小块胶带封住孔洞。必须完全覆盖孔洞，以防止后续孵育过程中胚胎脱水和死亡。但应避免使用过大的胶带，以防造成缺氧。
- 封孔后，将鸡蛋放入孵育箱中，直至达到所需胚胎发育阶段。对于已开始发育的胚胎，应尽快完成整个操作过程，以防止因环境温度过低导致胚胎丢失。
- 气室吸入法（图3）
注意：这是一种新型吸入暴露方法，利用鸡胚在发育后期通过气室开始呼吸空气的特点。适用于气体或气溶胶暴露，可实现生命早期的早期吸入暴露，并在肺部首次打开时即充满目标气体/气溶胶。- 准备以下必要的试剂/工具：采样袋（PVF袋，用于暴露前储存气体/气溶胶样品）、导管针、注射器、金属探针（可用任何尖锐的金属针/棒/锥替代）、胶带、通风橱。
- 按照步骤1.1.2所述方法清洁鸡蛋，按照步骤1.1.3所述方法照蛋（孵育前无需标记气室），然后将鸡蛋在未处理条件下孵育至ED17。
- 在ED17时照蛋，标记气室区域。
- 在ED18时，从孵育箱中取出一枚鸡蛋，用75%乙醇对气室区域进行消毒，然后在气室两侧小心钻两个小孔。一个用于注入气体/气溶胶，另一个用于排出空气。精确控制孔径，使注入孔刚好能插入导管针，而排气孔稍大（直径约1 mm）。
- 将导管针连接注射器，从注入孔缓慢注入10 mL目标气体/气溶胶。对照组注入空气，其结果应与阴性对照组无显著差异8。适当施加压力于导管针（适度压力可使弹性针紧贴蛋壳），以尽量减少注入孔的泄漏。随后立即用胶带密封两个孔，并将鸡蛋放回孵育箱。
注意：该操作应在通风橱中进行，以防止操作人员吸入气体/气溶胶。 - 一小时后重复上述操作，以进一步确保整个气室充满目标气体/气溶胶（可选）。
- 在ED19时再次重复该操作（可选）。重复暴露有助于确保孵化前持续稳定的暴露水平。记录出壳时间，以大致估算暴露持续时间。
- 完成所需暴露并封孔后，将鸡蛋放回孵育箱进行孵化。尽量减少鸡蛋在孵育箱外停留的时间，以防因环境温度过低导致胚胎死亡。
2. 终点评估方法
注意：在将目标污染物暴露于发育中的胚胎后，可评估多种毒性参数，包括心脏毒性。本节将详细描述两种常用的具体方法。
- 心电图（图4）
注意：由于雏鸡有羽毛，无法进行无创心电图检测。因此必须通过皮下植入电极，并需要麻醉。实验室使用的麻醉剂量为戊巴比妥钠33 mg/kg，经腹腔注射（部分雏鸡可能需要增加剂量至50%）。该方法可在超过90%的动物中获得稳定的心电图信号，可用于心率分析。- 准备以下必要试剂/工具：生理盐水中配制的1%（10 mg/mL）戊巴比妥钠溶液、注射器、电子天平、加热装置（如需要）、连接双通道金属针电极的心电图仪（例如BL-420E+）。
- 用天平称量雏鸡体重，计算所需戊巴比妥钠溶液体积并进行注射。对于体重30 g的雏鸡，需注射0.1 mL戊巴比妥钠溶液。确保注射部位位于腹部侧面，因为卵黄位于腹部中央，此处注射可能无效。
- 等待注射后的雏鸡进入麻醉状态（用手握住雏鸡，若颈部无张力且头部可自由摆动，则表明麻醉充分）。将雏鸡置于手术台上（若室温低于20 °C，则需使用加热装置）。
- 从腹部两侧皮下插入两根针状电极。插入时应轻轻提起皮肤，从提起处进针，以确保针头不进入腹腔。插入后小心向前推进针头，直至到达胸腔侧壁。注意针头不得深入体内或穿出皮肤。
- 使用心电图仪进行测量。也可使用其他具备心电图功能的类似仪器。
- 若需处死雏鸡，可在心电图检测完成后实施安乐死，因其已处于麻醉状态。若需保留雏鸡生命，则将其放回笼中并保温直至苏醒。也可选择将其放回孵育箱。
- 组织形态计量学（图5）
注意：已开发出一种特异性方法，用于评估心脏横切面上右心室壁的厚度。由于右心室形状不规则，通过超声心动图评估其尺寸在形态学上并非完全准确，因此本方法可作为右心室形态评估的良好补充。- 准备以下必要试剂/工具：4%磷酸盐缓冲甲醛、锋利刀片、磷酸盐缓冲液（PBS）、吸水纸、电子天平、小型剪刀、常规组织学处理试剂（梯度乙醇、二甲苯、石蜡）。
- 动物处死后，用水润湿羽毛，以减少打开胸腔时羽毛飞散造成的潜在污染。
- 小心打开胸腔，避免损伤心脏。使用小型剪刀剪断血管，并轻柔地将心脏从胸腔中取出。保留一小段（约1–2 mm）血管连接在心脏上，以便后续操作时便于持握而不损伤心脏。
- 取出心脏后，用冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，以去除血液并松弛心肌。随后将心脏在吸水纸上轻蘸干燥，再称重以获得准确质量读数。将心脏放入10倍体积的固定液（4%磷酸盐缓冲甲醛）中，在室温下固定24小时。固定后的组织可进一步处理成石蜡包埋块，或在4 °C长期保存（若计划进行免疫组织化学染色，则不推荐长期保存）。
- 包埋前，从心尖起算约60%心脏长度处进行切割（图5A），以便后续处理。建议使用切片机刀片快速完成垂直且干净的切口。对于出生超过一天的雏鸡，建议在距心尖约25–30%长度处再做一次切割，以利于石蜡充分渗透，并使组织适配组织包埋盒。
- 按以下条件处理组织（可根据需要调整）：70%乙醇1小时、80%乙醇1小时、95%乙醇1小时×2次、100%乙醇30分钟×2次、二甲苯5分钟×2次、石蜡（熔点52–54 °C）1.5小时、石蜡（熔点62–64 °C）1小时，然后将组织包埋于3:1混合的石蜡中（熔点62–64 °C与52–54 °C石蜡混合）。
- 切片厚度为6 µm。通过确认右心室中一个解剖标志（隔缘肉柱）的存在及其大小，仔细保持各横切面相对位置的一致性。在每张切片上确认具有中等长度的标志结构（图5B，箭头）。
- 使用Logo编程器制作两个电子标尺：标尺1为一条直线，其中点连接7条测量线，相邻测量线之间夹角为22.5°；标尺2为呈T形的两条垂直线（图5B）。
- 使用两种软件程序进行测量：Adobe Photoshop和ImageJ。
- 在Photoshop中，调整标尺1的大小（不得改变形状），使其两端分别置于游离右心室壁的两端，使标尺1上的7条测量线各自与右心室内壁相交。然后使用标尺2从心室内壁至外壁进行垂直测量（图5B）。
- 使用ImageJ对每颗心脏完成7次测量。
- 根据具体需求，分析这7次测量值或取其平均值，以代表右心室壁厚度。为反映特定心室壁厚度变化，可将其归一化为全心重量。
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结果
暴露结果
气室注射
气室注射可有效使发育中的鸡胚暴露于多种物质，这些物质随后可在收集的鸡胚或出壳雏鸡样本（如血清、组织等）中被检测到。以下是一个示例：通过气室注射全氟辛酸（PFOA），然后采用超高效液相色谱-质谱法测定血清中PFOA的浓度。血清中的PFOA浓度与注射剂量相对应，表明该方法的有效性（图6）。
显微注射
显微注射可使发育中的胚胎暴露于某些无法有效穿透内膜或作用时间较短的试剂中，例如慢病毒。以下是一个示例：采用该方法在胚胎发育第2天注射慢病毒后，在胚胎发育第15天的心脏中观察到明显的绿色荧光，表明慢病毒转染具有有效性（图7）。
气室灌注
气室灌注是一种新型方法，可能在外部呼吸起始阶段用于少量气体/气溶胶吸入暴露。以下是一个示例：在胚胎发育第18天和第19天将柴油尾气灌注至气室，导致心脏及肺组织出现显著的纤维化改变（图8
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讨论
鸡胚作为发育研究的经典模型已有200年的历史1。本文所介绍的方法已成功用于评估多种环境污染物，包括全氟辛酸、颗粒物和柴油机尾气等5, 7,8,9,10,11,12。利用这些方法，能够以经济有效且清晰的方式指示发育性心脏毒性。此外，将鸡胚暴露于其他感兴趣的化合物并评估其潜在的发育性心脏毒性也并不困难。
气室注射法是一种经典方法，先前已在许多研究中使用13,14<...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（项目编号：91643203、91543208、81502835）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 磷酸盐缓冲甲醛固定液 | Biosharp，中国合肥 | 货号：BL539A | |
| 75% 乙醇 | 国药，中国上海 | CAS：64-17-5 | |
| Biosignaling 监测仪 BL-420E+ | 泰盟，中国成都 | BL-420E+ | |
| 照蛋灯 | 振威，中国德州 | WZ-001 | |
| 一次性注射器 | 致远，中国江苏 | ||
| 孵蛋器 | 科宇，中国德州 | KFX | |
| 电子天平 | OHAUS，中国上海 | AR 224CN | |
| 电热恒温培养箱 | 申贤，中国上海 | DHP-9022 | |
| 无水乙醇 | 国药，中国上海 | CAS：64-17-5 | |
| 受精鸡胚 | 佳诺，中国济宁 | ||
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | 碧云天，中国北京 | C0105 | |
| 组织学石蜡 | 阿拉丁，中国上海 | P100928-500g | 熔点 52~54°C |
| 组织学石蜡 | 阿拉丁，中国上海 | P100936-500g | 熔点 62~64°C |
| 静脉留置导管 | KDL，中国浙江 | 导管必须为柔软的塑料材质。 | |
| 慢病毒 | 吉凯基因，中国上海 | 慢病毒由吉凯基因分别设计/合成。 | |
| 马松三色染色试剂盒 | 索莱宝，中国北京 | G1340 | |
| 金属探针 | 金诺泰，中国北京 | ||
| 微量注射器（5 µL） | 安亭，中国上海 | ||
| 显微镜 | CAIKON，中国上海 | XSP-500 | |
| 切片机 | Leica，德国 | HistoCore BIOCUT | |
| 切片机刀片 | Leica，德国 | Leica 819 | |
| 戊巴比妥钠 | 亿泰科技有限公司， 中国武汉 | CAS：57-33-0 | |
| 移液器（10 µL） | Sartorius，德国 | ||
| 聚维酮碘 | 龙跃泉，中国泰安 | ||
| 剪刀 | 安其生，中国苏州 | ||
| 无菌生理盐水 | 科伦，中国成都 | ||
| 葵花籽油 | 美之嘉，中国江苏 | 任何市售供人食用的葵花籽油均可使用 | |
| 胶带 | M&G，中国上海 | ||
| 特氟龙 PVF 袋（5 L） | 德林，中国大连 | ||
| 涡旋混合器 | SCILOGEX，美国康涅狄格州罗基希尔 | MX-F | |
| 二甲苯 | 国药，中国上海 | CAS：1330-20-7 |
参考文献
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