使用钙荧光染料标记和纳米颗粒追踪分析法评估人体尿液中的纳米晶体

摘要

本研究的目的是确定纳米颗粒跟踪分析（NTA）是否能够检测并定量健康成人尿液中含钙的纳米晶体。当前研究的结果表明，NTA 可能成为评估肾结石疾病期间尿液纳米晶体的一种潜在工具。

摘要

肾结石在成人和儿童中的发病率正于全球范围内上升。最常见的肾结石类型由草酸钙（CaOx）晶体构成。当尿液中矿物质（如钙、草酸盐、磷酸盐）达到过饱和状态时，便会发生结晶尿，此过程先于肾结石的形成。目前评估结石形成者结晶尿的标准方法包括显微镜检查、过滤和离心。然而，这些方法主要检测微晶，而无法有效检测纳米晶体。已有研究表明，在体外实验中，纳米晶体对肾上皮细胞的损害可能大于微晶。本文描述了纳米颗粒追踪分析（NTA）检测人尿液中纳米晶体的能力。健康成人受试者在接受草酸盐负荷前，先摄入受控的草酸盐饮食，以促进尿液中纳米晶体的生成。在草酸盐负荷前后分别收集24小时尿样。样品经处理后用乙醇洗涤以实现纯化。使用钙结合荧光染料Fluo-4 AM对尿液中的纳米晶体进行染色。染色后，采用NTA测定纳米晶体的粒径和数量。本研究结果表明，NTA能够高效检测健康成人中的纳米结晶尿。这些发现提示，NTA可能成为肾结石疾病患者纳米结晶尿早期检测的一种有价值的方法。

引言

当尿液中的矿物质达到过饱和状态时，会形成尿路结晶。这种情况可能出现在健康个体中，但在肾结石患者中更为常见¹。尿路结晶的存在和积聚会增加患肾结石的风险。具体而言，当结晶附着于兰德尔斑块（Randall's plaque），发生成核、积聚并随时间生长时，便可能导致结石形成^2,3,4。结晶尿先于肾结石的形成，对结晶尿的评估可能对肾结石患者具有预测价值^3,5。特别是，已有研究提出，结晶尿可用于预测既往有草酸钙结石病史的患者结石复发的风险^6,7。

已有研究报道，晶体对肾上皮细胞和循环免疫细胞的功能具有负面影响^8,9,10,11,

方案

本研究中概述的所有实验均经阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）机构审查委员会批准。纳入研究的健康成人（年龄33.6 ± 3.3岁；n=10）需满足以下条件：血液全面代谢检查结果正常、非吸烟者、非妊娠状态、体重指数（BMI）在20-30 kg/m²之间，且无慢性疾病或急性病症。所有健康参与者在研究开始前均签署了书面知情同意书。

1. 临床方案与尿液采集

1. 让受试者在收集尿液（24小时样本）前，连续3天食用由阿拉巴马大学伯明翰分校临床与转化科学中心生物营养核心制备的低草酸饮食，并在收集前一晚开始禁食。
2. 次日，让受试者在摄入草酸负荷（含水果和蔬菜的奶昔，约8 mM草酸）前交回24小时尿液样本（摄入前草酸样本）。随后让受试者收集摄入后的24小时尿液样本（摄入后草酸样本），并于次日交回尿液样本。
3. 所有尿液样本在处理前均应保持在室温（RT）条件下，具体操作如下所述，并如图1所示。

2. 尿液处理

注意：使用的所有材料和设备均列在材料表中。
警告：处理临床样本和试剂时，必须始终佩戴个人防护装备。具体包括手套、面部和眼部护具、呼吸防护装置以及防护服。

1. 测量并记录....

结果

本研究结果表明，纳米颗粒追踪分析（NTA）能够有效检测人尿液中含钙纳米晶体的平均粒径和浓度。该方法通过使用荧光染料 Fluo-4 AM 与纳米颗粒追踪分析相结合实现。Fluo-4 AM 可结合草酸钙（CaOx）和磷酸钙（CaP）晶体。如图3A所示，CaOx 晶体的粒径范围为 50–270 nm，平均浓度为 1.26 × 10⁹ 个颗粒/mL。CaP 晶体的粒径范围为 30–225 nm，平均浓度为 2.22 × 10⁹ 个颗粒/mL（图3B）。为验证 NTA 是否可用于评估人尿液中的纳米晶体，研究人员招募健康成人受试者，先摄入受控草酸盐饮食，随后给予高草酸盐负荷。分别在负荷前后收集24小时尿液样本，用于评估尿液中纳米晶体的粒径和浓度。负荷前尿液样本中已检测到部分纳米晶体，浓度为 1.65 × 10⁸ ± 3.29 × 10⁷ 个颗粒/mL，粒径范围为 110–300 nm（图4

讨论

本研究采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术，利用钙结合探针Fluo-4 AM检测人尿液中的纳米晶体。目前尚无检测尿液中纳米晶体的标准方法。一些研究团队虽已实现尿液中纳米晶体的检测，但依赖于复杂的实验流程或方法，这些方法在样本定量能力方面存在局限性^27,28。本研究展示了一种特异且灵敏的方法，用于检测参与高草酸负荷饮食干预研究的人类受试者尿液中含钙的纳米晶体。所摄入的草酸量相当于实际生活中的草酸摄入水平（例如，½份菠菜沙拉）。

纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种特征明确的高分辨率工具，利用布朗运动来测量溶液中的颗粒³⁰。该方法已被用于评估多种生物样本中的生物纳米颗粒^31,32,33。此外，NTA 能够准确预测任何类型生物样本中颗粒的尺寸和浓.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
台式离心机	Jouan 离心机	CR3-12
一水合草酸钙	实验室合成，方法如前所述29。		室温保存；储备液浓度为 10 mM
磷酸钙晶体（羟基磷灰石纳米粉末）	Sigma	677418	室温保存；储备液浓度为 10 mM
乙醇	Fischer Scientific	AC615095000	室温保存；储备液浓度为 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	冷冻保存（-20°C）；储备液浓度为 5 mM
金纳米颗粒	Sigma	742031	2–8°C 保存
NanoSight 仪器	Malvern Instruments, 英国	NS300
注射泵	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon 消毒剂	LanXESS Energizing Company, 德国	LSP
*荧光染料对光敏感；储备液及分装液应避光保存于 -20°C。