使用钙荧光染料标记和纳米颗粒追踪分析法评估人体尿液中的纳米晶体

摘要

本研究的目的是确定纳米颗粒跟踪分析（NTA）是否能够检测并定量健康成人尿液中含钙的纳米晶体。当前研究的结果表明，NTA 可能成为评估肾结石疾病期间尿液纳米晶体的一种潜在工具。

摘要

肾结石在成人和儿童中的发病率正于全球范围内上升。最常见的肾结石类型由草酸钙（CaOx）晶体构成。当尿液中矿物质（如钙、草酸盐、磷酸盐）达到过饱和状态时，便会发生结晶尿，此过程先于肾结石的形成。目前评估结石形成者结晶尿的标准方法包括显微镜检查、过滤和离心。然而，这些方法主要检测微晶，而无法有效检测纳米晶体。已有研究表明，在体外实验中，纳米晶体对肾上皮细胞的损害可能大于微晶。本文描述了纳米颗粒追踪分析（NTA）检测人尿液中纳米晶体的能力。健康成人受试者在接受草酸盐负荷前，先摄入受控的草酸盐饮食，以促进尿液中纳米晶体的生成。在草酸盐负荷前后分别收集24小时尿样。样品经处理后用乙醇洗涤以实现纯化。使用钙结合荧光染料Fluo-4 AM对尿液中的纳米晶体进行染色。染色后，采用NTA测定纳米晶体的粒径和数量。本研究结果表明，NTA能够高效检测健康成人中的纳米结晶尿。这些发现提示，NTA可能成为肾结石疾病患者纳米结晶尿早期检测的一种有价值的方法。

引言

当尿液中的矿物质达到过饱和状态时，会形成尿路结晶。这种情况可能出现在健康个体中，但在肾结石患者中更为常见¹。尿路结晶的存在和积聚会增加患肾结石的风险。具体而言，当结晶附着于兰德尔斑块（Randall's plaque），发生成核、积聚并随时间生长时，便可能导致结石形成^2,3,4。结晶尿先于肾结石的形成，对结晶尿的评估可能对肾结石患者具有预测价值^3,5。特别是，已有研究提出，结晶尿可用于预测既往有草酸钙结石病史的患者结石复发的风险^6,7。

已有研究报道，晶体对肾上皮细胞和循环免疫细胞的功能具有负面影响^{8,9,10,11,12,13}。先前有研究指出，与健康个体相比，草酸钙（CaOx）肾结石患者体内的循环单核细胞其细胞生物能量代谢受到抑制¹⁴。此外，CaOx 晶体会降低单核细胞的细胞生物能量代谢水平，并破坏其氧化还原稳态⁸。摄入富含草酸盐的食物可能导致结晶尿，进而引起肾小管损伤，并改变尿液中大分子物质的生成与功能，而这些大分子物质本具有抑制肾结石形成的作用^15,16。多项研究表明，尿液中晶体的形态和大小可随尿液 pH 值和温度的变化而改变^17,18,19。此外，尿液中的蛋白质已被证实能够调节晶体行为²⁰。Daudon 等人¹⁹提出，结晶尿分析可能有助于肾结石疾病患者的管理和治疗反应的评估。目前可用于检测晶体存在的几种传统方法包括偏振光显微镜^21,22、电子显微镜²³、颗粒计数器³、尿液过滤²⁴、蒸发法^3,5或离心法²¹。这些研究为肾结石领域关于结晶尿的认识提供了重要见解。然而，这些方法的一个局限性在于无法可视化和定量尺寸小于 1 µm 的晶体。此类尺寸的晶体可能通过附着于兰德尔斑块（Randall's plaque）影响 CaOx 结石的生长。

与较大的微晶相比，纳米晶体已被证明会对肾细胞造成更广泛的损伤²⁵。已有研究通过纳米颗粒分析仪在尿液中检测到纳米晶体的存在^26,27。近期研究采用荧光标记的双膦酸探针（阿仑膦酸-荧光素/阿仑膦酸-Cy5）结合纳米级流式细胞术来检测纳米晶体²⁸。该染料的局限性在于其缺乏特异性，除胱氨酸结石外，几乎可与所有类型的结石结合。因此，准确评估个体体内纳米晶体的存在可能成为诊断结晶尿症和/或预测结石风险的有效工具。本研究旨在利用纳米颗粒追踪分析技术（NTA）检测并定量含钙纳米晶体（<1 µm）的含量。为实现该目标，本研究结合使用NTA技术与钙离子结合型荧光染料Fluo-4 AM，以检测和定量健康成人尿液中的含钙纳米晶体。

方案

本研究中概述的所有实验均经阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）机构审查委员会批准。纳入研究的健康成人（年龄33.6 ± 3.3岁；n=10）需满足以下条件：血液全面代谢检查结果正常、非吸烟者、非妊娠状态、体重指数（BMI）在20-30 kg/m²之间，且无慢性疾病或急性病症。所有健康参与者在研究开始前均签署了书面知情同意书。

1. 临床方案与尿液采集

1. 让受试者在收集尿液（24小时样本）前，连续3天食用由阿拉巴马大学伯明翰分校临床与转化科学中心生物营养核心制备的低草酸饮食，并在收集前一晚开始禁食。
2. 次日，让受试者在摄入草酸负荷（含水果和蔬菜的奶昔，约8 mM草酸）前交回24小时尿液样本（摄入前草酸样本）。随后让受试者收集摄入后的24小时尿液样本（摄入后草酸样本），并于次日交回尿液样本。
3. 所有尿液样本在处理前均应保持在室温（RT）条件下，具体操作如下所述，并如图1所示。

2. 尿液处理

注意：使用的所有材料和设备均列在材料表中。
警告：处理临床样本和试剂时，必须始终佩戴个人防护装备。具体包括手套、面部和眼部护具、呼吸防护装置以及防护服。

1. 测量并记录尿液的 pH 值和体积。在将 50 mL 尿液加入已标记的无菌 50 mL 锥形管之前，需充分混匀。
2. 使用台式离心机在室温下以 1200 x g 离心 10 分钟。
   注意：保持样品在室温下，以防止进一步形成结晶，因为较低温度可能促进结晶。
3. 弃去上清液，用 5 mL 100% 乙醇洗涤并重新悬浮沉淀物。再次使用台式离心机在室温下以 1200 x g 离心 10 分钟。
4. 弃去上清液，并将沉淀物重悬于 1 mL 100% 乙醇中。将样品在 -20 °C 下保存以备后续处理，或按如下所述进行染色。
   ​注意：保存后染色样品与新鲜染色样品之间的数据点（即粒径/浓度）无显著差异。

3. 纳米颗粒示踪分析（NTA）

1. 样品制备
   1. 金纳米颗粒：使用金纳米颗粒优化仪器设置。将100 nm的金纳米颗粒用超纯水按1:1000比例稀释。
   2. 人尿液：在暗处用5 mM Fluo-4 AM（一种钙荧光染料）染色前，先将尿液样本用水稀释20倍，染色30分钟。使用NTA分析样本。
   3. 按照先前所述方法制备草酸钙（CaOx）晶体²⁹将10 mM储备液（14.6 mg溶于10 mL水中）用水稀释至50 µM，然后在避光条件下用5 mM Fluo-4 AM染色稀释后的样品30分钟，再进行分析。
   4. 磷酸钙（CaP）晶体：将10 mM储备液（50.4 mg溶于10 mL水）用水稀释至50 µM，加入5 mM Fluo-4 AM避光染色30分钟，随后进行NTA分析。
2. 仪器设置、相机参数与数据采集
   注意：本方法所用的计算机和仪器设置如图所示 图2.
   1. 打开计算机，然后开启仪器。启动软件并打开相机。
   2. 软件窗口打开后，点击窗口左上角的捕获图标以启动捕获模式。相机初始化需要数秒钟。
   3. 使用1 mL注射器向平台内泵入空气，直至平台表面洁净。再用另一支1 mL注射器向装置中轻轻加入水2–3次，以去除任何气泡。
      ​注意：检查平台及管路中是否存在任何气泡。在运行样品前及过程中，整个装置中均不得有气泡。若发现气泡，需再次使用空气和水清洗平台。
   4. 平台清洁后，加入水并通过摄像头观察表面是否有任何污染。接着，加入金纳米颗粒 作为样品加载泵注射器的对照，用于仪器设置。
   5. 调整屏幕或仪器右侧旋钮上的相机增益，直至图像开始显示彩色像素，然后降低相机增益。
   6. 然后调整屏幕以优化图像。 左键单击 视频图像上的鼠标按钮 保持 的 鼠标左键 和 拖动 上下移动图像以获得完整视野。
      ​注意：使用普通相机镜头和滤光片来评估金纳米颗粒和未染色样品。
   7. 设定输注速度并调节摄像头，使金纳米颗粒在摄像头屏幕上可见。初始设置时将输注速度设为高（即 500 µL/min），以确保检测到金纳米颗粒。一旦检测到颗粒，将速度降低至 50 µL/min。
   8. 调整摄像头水平以观察颗粒。对于未染色的样品，将屏幕增益调至5级以实现摄像头对焦，然后将摄像头水平设为8。对焦完成后，记录样品（即仅进行一次60秒的测量）。
      ​注意：获得用于计数的清晰、锐利的颗粒图像时，聚焦和持续的流速至关重要。
   9. 优化后，在检测样品前再次用水清洗装置。观察摄像头，确保管路清洁且无颗粒物存在。
      ​注意：每次更换样本后，需清洗腔室，直至相机检测不到任何颗粒为止。
   10. 为分析染色样本，将相机调节至装有合适荧光滤光片的滤光位置。将稀释并染色的样本加载到样本加载泵注射器中，并将流速降低至20 µL/min以进行样本分析。
   11. 接下来调整屏幕增益和相机水平，这些是重要的参数。对于染色（荧光）样品，将屏幕增益设为5，相机水平设为13。
       ​注意：这些参数将根据样本类型的不同而有所变化，每种样本都需要进行优化以获得清晰对焦。
   12. 使用标准测量方法对样品进行测量，每个样品测量5次，每次捕获持续60秒。
   13. 每次测量后保存并存储数据。软件将为每次测量保存图像和视频文件。软件可输出以 Excel 和 PDF 格式呈现的数据（例如：晶体尺寸：10 nM - 1000 nM 及浓度）。
   14. 计算每个样本5次读数的纳米颗粒平均数量。使用标准差或平均值的标准误差分析数据，并采用配对t检验进行数据分析。

结果

本研究结果表明，纳米颗粒追踪分析（NTA）能够有效检测人尿液中含钙纳米晶体的平均粒径和浓度。该方法通过使用荧光染料 Fluo-4 AM 与纳米颗粒追踪分析相结合实现。Fluo-4 AM 可结合草酸钙（CaOx）和磷酸钙（CaP）晶体。如图3A所示，CaOx 晶体的粒径范围为 50–270 nm，平均浓度为 1.26 × 10⁹ 个颗粒/mL。CaP 晶体的粒径范围为 30–225 nm，平均浓度为 2.22 × 10⁹ 个颗粒/mL（图3B）。为验证 NTA 是否可用于评估人尿液中的纳米晶体，研究人员招募健康成人受试者，先摄入受控草酸盐饮食，随后给予高草酸盐负荷。分别在负荷前后收集24小时尿液样本，用于评估尿液中纳米晶体的粒径和浓度。负荷前尿液样本中已检测到部分纳米晶体，浓度为 1.65 × 10⁸ ± 3.29 × 10⁷ 个颗粒/mL，粒径范围为 110–300 nm（图4

讨论

本研究采用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术，利用钙结合探针Fluo-4 AM检测人尿液中的纳米晶体。目前尚无检测尿液中纳米晶体的标准方法。一些研究团队虽已实现尿液中纳米晶体的检测，但依赖于复杂的实验流程或方法，这些方法在样本定量能力方面存在局限性^27,28。本研究展示了一种特异且灵敏的方法，用于检测参与高草酸负荷饮食干预研究的人类受试者尿液中含钙的纳米晶体。所摄入的草酸量相当于实际生活中的草酸摄入水平（例如，½份菠菜沙拉）。

纳米颗粒跟踪分析（NTA）是一种特征明确的高分辨率工具，利用布朗运动来测量溶液中的颗粒³⁰。该方法已被用于评估多种生物样本中的生物纳米颗粒^31,32,33。此外，NTA 能够准确预测任何类型生物样本中颗粒的尺寸和浓...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
台式离心机	Jouan 离心机	CR3-12
一水合草酸钙	实验室合成，方法如前所述29。		室温保存；储备液浓度为 10 mM
磷酸钙晶体（羟基磷灰石纳米粉末）	Sigma	677418	室温保存；储备液浓度为 10 mM
乙醇	Fischer Scientific	AC615095000	室温保存；储备液浓度为 100%
Fluo-4 AM*	AAT Bioquest, Inc.	20550	冷冻保存（-20°C）；储备液浓度为 5 mM
金纳米颗粒	Sigma	742031	2–8°C 保存
NanoSight 仪器	Malvern Instruments, 英国	NS300
注射泵	Harvard Apparatus	98-4730
Virkon 消毒剂	LanXESS Energizing Company, 德国	LSP
*荧光染料对光敏感；储备液及分装液应避光保存于 -20°C。