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方法文章

内源性表达的人源RYR1变异体的功能表征

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DOI：

10.3791/62196

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2021年6月9日

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Basel University Hospital, 2Department of Life Sciences, University of Ferrara, 3Department of Anesthesia, Basel University Hospital

本文内容

摘要

本文描述了用于研究在EB病毒永生化的人B淋巴细胞以及由肌肉活检获得的卫星细胞分化成的肌管细胞中内源性表达的RYR1突变功能效应的方法。

摘要

在患有不同神经肌肉疾病的患者中，已鉴定出超过700种RYR1基因变异，这些疾病包括恶性高热易感性、核心性肌病和中心核肌病。由于RYR1突变与多种表型相关，因此对其功能效应进行表征至关重要，这有助于对患者携带的变异进行分类，为未来的治疗干预提供依据，并识别非致病性变异。许多实验室致力于开发方法，以功能表征患者细胞中内源性表达的RYR1突变。该方法具有多项优势，包括：突变在内源性水平表达、RyR1蛋白不会过表达、避免使用异源表达RyR1的细胞系。然而，由于患者可能携带除RYR1以外其他基因的突变，因此比较携带相同突变但遗传背景不同的个体所提供的生物样本结果显得尤为重要。本文描述了用于研究内源性表达的RYR1变异体功能效应的方法，所用细胞包括：（a）EB病毒永生化的人B淋巴细胞；（b）从肌肉活检组织中分离并分化为肌管的卫星细胞。随后通过添加药理性RyR1激活剂，监测细胞内钙离子浓度的变化。所选细胞类型被加载一种比率型荧光钙指示剂，细胞内[Ca2+]的变化可通过荧光显微镜在单细胞水平检测，或通过分光荧光计在细胞群体中检测。通过比较健康对照个体与携带RYR1变异患者的细胞之间的静息[Ca2+]水平及激动剂剂量-反应曲线，可深入了解特定变异的功能效应。

引言

迄今为止，已在人类群体中鉴定出超过700种RYR1变异体，并发现其与多种神经肌肉疾病相关，包括恶性高热易感性（MHS）、运动诱发的横纹肌溶解症、中央核心病（CCD）、多微小核心病（MmD）以及中心核肌病（CNM）1,2,3；然而，针对这些变异体功能效应的研究进展相对滞后，仅有约10%的突变经过了功能验证。可采用多种实验方法评估特定RyR1变异体的影响，包括将编码野生型（WT）和突变型RYR1 cDNA的质粒转染至异源细胞（如HEK293和COS-7细胞）4,5，将编码野生型和突变型RYR1 cDNA的质粒及载体转导至无雷诺丁受体的小鼠成纤维细胞，随后转导myo-D并诱导其分化为肌管细胞6，构建携带突变RyR1的转基因动物模型7,8,9，以及对内源性表达RYR1变异体的患者来源细胞进行功能表征10,11,12。这些方法有助于阐明不同突变对RyR1 Ca2+通道功能的影响机制。

本文描述了用于评估 RYR1 突变功能效应的方法。在内源性表达 RyR1 钙通道的人类细胞中，研究了细胞内钙稳态的多种参数，包括成肌细胞和 Epstein Barr 病毒（EBV）永生化的 B 淋巴细胞。细胞来源于患者，经体外扩增后，负载比值型荧光钙指示剂（如 Fura-2 或 indo-1）。已有报道指出，由于致病性 RYR1 突变，静息 [Ca²⁺]、兴奋-收缩耦联过程中钙释放的幅度和动力学、钙诱导的钙释放敏感性、内质网钙库的充盈状态以及钙泄漏等参数均可能发生改变。2+]，对不同药理学激动剂的敏感性以及细胞内Ca2+ 使用荧光显微镜在单细胞水平或使用荧光计在细胞群体水平上测量钙库。将来自突变携带者细胞的检测结果与来自健康对照家族成员细胞的结果进行比较。该方法已证明：（i）许多与恶性高热易感性（MHS）相关的突变会导致静息[Ca2+] 以及对KCl诱导的去极化或使用4-氯-间甲酚进行药理学RyR1激活的剂量反应曲线均出现左移10,11,12,13；（ii）与CCD相关的突变导致峰值[Ca2+] 通过药物激活 RyR1 释放，且当细胞内 Ca 浓度降低时，其尺寸减小2+ 储存12,13,14,15；（iii）某些变异体不影响 Ca2+ 稳态13该实验方法的优点包括：RyR1蛋白未过表达，处于生理水平；细胞可永生化（包括肌细胞和B淋巴细胞），从而获得携带突变的细胞系。一些局限性在于，患者可能在编码参与钙稳态和/或兴奋-收缩耦联（ECC）相关蛋白的多个基因中均存在突变，这可能使实验结论复杂化。例如，在恶性高热易感者（MHS）和对照人群中均发现了两种JP-45变异体，且其存在被证实会影响二氢吡啶受体（DHPR）对激活的敏感性。16患者需要能够配合，生物样本需新鲜采集，且须从当地伦理委员会获得伦理许可。

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方案

下述方案符合西北和瑞士中部伦理委员会（Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ）的伦理指南。

1. EB病毒永生化B淋巴细胞系的制备11

  1. 在获得知情同意后，使用经EDTA处理的无菌试管从携带RYR1突变的先证者及无突变的健康家庭成员中采集30 mL全血。
    注意：所有溶液均需保持无菌，并在组织培养超净台中操作。
  2. 通过密度梯度离心介质（例如Ficoll-Hypaque，0.077 g/L）从全血中分离单个核细胞。
    1. 将30 mL无菌血液置于50 mL锥形无菌离心管中。
    2. 将含有密度梯度离心介质的巴斯德吸管尖端插入管底，缓慢在血液下方加入20 mL无菌密度梯度离心介质溶液。
    3. 在18°–20°C条件下以900 × g离心30分钟，不设刹车。
      ​注意：单个核细胞层表现为密度梯度介质层与上层富含血小板的血浆之间的界面处一圈浑浊环状物。
  3. 用无菌吸管小心吸取含有单个核细胞的界面层（约3–5 mL），并将液体转移至一个新的50 mL无菌锥形离心管中。
  4. 加入20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，在室温下以600 × g离心10分钟，弃上清后将沉淀重悬于PBS中。重复洗涤三次；此步骤可确保完全去除残留介质。
  5. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于1–2 mL组织培养基中（RPMI培养基，添加10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺以及100单位青霉素和链霉素）。将约1 × 106个单个核细胞接种至含有20 mL组织培养基的T125组织培养瓶中。
  6. 用EB病毒（Epstein-Barr病毒）感染单个核细胞。
    1. 使用B95.8细胞系培养物的上清液（含102–103转化单位/mL，储存于-80 °C）作为EBV来源。
    2. 将步骤1.5中获得的1 × 106个单个核细胞重悬于20 mL组织培养基中，并加入2 mL B95.8细胞系上清液，在环孢素A存在下（终浓度0.2 µg/mL）进行感染。
  7. 将培养瓶置于37 °C细胞培养箱中培养，允许细胞生长。一周后更换培养基。
    注意：一旦B细胞开始增殖，会形成明显的细胞团块并快速生长，此时可进行传代扩增并冻存。
  8. 从EBV永生化B淋巴细胞系中提取基因组DNA11，以确认目标突变的存在或缺失。

2. 细胞内Ca2+浓度测定

注意：可在细胞群体中使用配备磁力搅拌器和37 °C比色皿架的光谱荧光计监测EB病毒转化的B淋巴细胞系内钙离子浓度的变化。或者，也可通过荧光显微镜在单个细胞中监测Ca2+的变化。两种情况下，均需将细胞从组织培养瓶中取出，用Krebs Ringer溶液（140 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、20 mM HEPES、1 mM NaHPO4、5.5 mM葡萄糖、pH 7.4，含1 mM CaCl2）洗涤两次，并进行计数。

  1. 使用分光荧光计进行细胞群体实验11,13,14
    1. 将细胞重悬于Krebs Ringer溶液中，终浓度为1 × 107 个细胞/mL，并在37°C下与终浓度为5 µM的Fura-2/AM共同孵育30分钟。
    2. 以900 × g离心10分钟，将细胞沉淀重悬于Krebs Ringer溶液中，浓度为2 × 106 个细胞/mL。
    3. 使用配备磁力搅拌器（调至最大转速）并设定为37 °C的分光荧光计，测量荧光变化（340/380 nm比值）。
    4. 实验开始前，在微量离心机中以900 × g离心5分钟，迅速将沉淀重悬于1.5 mL含0.5 mM EGTA但不含外源Ca2+的Krebs Ringer溶液中。
    5. 将细胞置于3 mL玻璃分光荧光计比色皿中，记录荧光比值（激发波长340 nm/380 nm，发射波长510 nm）。
    6. 待基线稳定（约30秒）后，加入选定浓度的RyR1激动剂（4-氯-间甲酚，即4-cmc），记录钙瞬变。
      ​注：4-cmc的300 mM母液用DMSO配制，作为起始试剂使用。该溶液可预先配制，分装后于-20 °C保存数月。
    7. 进行不同4-cmc浓度下的实验。
      注：应包括75 µM、150 µM、300 µM、450 µM、600 µM、750 µM至1 mM，以生成激动剂浓度与[Ca2+]变化之间的剂量-反应曲线。不同4-cmc浓度通过从母液中取适当体积直接加入含Fura-2负载细胞的比色皿中获得。例如，为达到终浓度300 µM的4-cmc，向含1.5 mL细胞的Krebs Ringer溶液比色皿中加入1.5 µL母液。对于较低激动剂浓度，应先将300 mM母液用DMSO稀释至75 mM，再取适当体积加入含1.5 mL细胞的比色皿中。
    8. 向细胞中加入400 nM毒胡萝卜素（thapsigargin），以计算细胞内储存池中总Ca2+含量。记录峰值Ca2+信号。
    9. 以毒胡萝卜素诱导的峰值钙信号作为100%，绘制特定4-cmc浓度所诱导的峰值钙信号与其相对比值，并构建4-cmc的剂量-反应曲线，比较先证者与健康亲属来源的细胞反应。
  2. 单细胞实验13
    1. 将聚-L-赖氨酸用无菌H2O按1:10稀释，预处理玻璃盖玻片30分钟，随后在无菌细胞培养超净台内自然晾干。
    2. 将EBV转化的B淋巴细胞重悬于含1 mM CaCl2的Krebs Ringer溶液中，终浓度为1 × 106 个细胞/mL，并加入终浓度为5 µM的Fura-2/AM。
    3. 取1 mL细胞悬液滴加至经聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上，在37 °C、湿润的细胞培养箱中孵育30分钟，使EBV转化的细胞在负载过程中贴附于盖玻片表面。
    4. 将盖玻片放入灌流腔室，开始以2 mL/min流速灌注含1 mM Ca2+的Krebs Ringer溶液。
    5. 使用倒置荧光显微镜（配备40倍油镜（数值孔径0.17）、滤光片组（BP 340/380、FT 425、BP 500/530））进行在线检测，并连接由软件控制的电荷耦合器件（CCD）相机。
    6. 以固定曝光时间（340 nm和380 nm激发波长均为100 ms），每1秒采集一次图像。使用成像软件分析荧光变化，测量每个细胞在340 nm和380 nm激发波长下的平均像素值13。
    7. 为实现细胞刺激，使用含12个阀门的细胞灌流刺激系统，加入不同浓度的4-cmc。冲洗阀中使用不含外源Ca2+并添加100 µM La3+的Krebs Ringer溶液，以特异性监测仅来自细胞内储存池的钙释放。
    8. 按上述方法构建4-cmc浓度与[Ca2+]变化之间的剂量-反应曲线。

3. 从肌肉活检样本制备人源肌管10,12,15

注意：不同实验室采用不同方法获取卫星细胞来源的成肌细胞和肌管细胞。以下是巴塞尔实验室所用方法的描述。

  1. 用无菌 PBS 冲洗肌肉活检组织以去除多余血液，并将其切成约 0.5–1 mm 的小片段。
  2. 准备带有插件的 6 孔组织培养板。每孔加入 1.5 mL 人肌肉生长培养基，每个插件中加入 0.5 mL 人肌肉生长培养基。
    注意：生长培养基的配制如下：500 mL 高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，4.5 mg/mL），含 10% 马血清、5 ng/mL 胰岛素、3 mM 谷氨酰胺、600 ng/mL 青霉素 G 和链霉素，以及 7 mM HEPES，pH 7.4。也可使用市售的骨骼肌生长培养基。
  3. 将 2–3 个小的肌肉片段放入每个插件中（图 1A），并将培养板置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）。大约 8–10 天后，可见卫星细胞从肌肉活检组织中迁移出来，并附着在插件周围（图 1，B 和 C，箭头所示）。
  4. 当从活检组织中释放出足够数量的细胞后（约 10–14 天），按以下步骤进行胰酶消化：
    1. 移除所有培养基，用 1 mL PBS 洗涤细胞一次，加入 0.5 mL 胰酶/EDTA 溶液（0.025% 胰酶和 0.01% EDTA），在 37 °C 下孵育 5 分钟。
    2. 向细胞中加入 1 mL 生长培养基以中和胰酶作用，将卫星细胞转移至新的 T25 细胞培养瓶中；加入 3 mL 生长培养基，并将细胞置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）。
    3. 次日更换生长培养基以去除 EDTA，之后每周更换一次培养基。
  5. 当成肌细胞融合度达到约 75% 时，进行胰酶消化并将其转移至经层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。
    注意：按比例，一个 T25 培养瓶中生长的细胞应转移至一个直径为 43 mm 的经层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。该玻璃盖玻片应放置于直径为 60 mm 的组织培养皿中，内含 3 mL 生长培养基。
  6. 将细胞在玻璃盖玻片上于生长培养基中继续培养，置于细胞培养箱中（5% CO2，37 °C），每周更换一次培养基。当细胞融合度达到 90% 时，更换为分化培养基，其配制如下：高糖 DMEM（4.5 mg/mL）、0.5% 牛血清白蛋白、10 ng/mL 表皮生长因子、0.15 mg/mL 肌酸、5 ng/mL 胰岛素、200 mM 谷氨酰胺、600 ng/mL 青霉素 G 和链霉素，以及 7 mM HEPES，pH 7.4。也可使用市售的分化培养基。每周更换一次分化培养基。
  7. 在分化培养基中培养 7–10 天后，可见多核肌管形成。应在一周内按照下述方法检测细胞内 [Ca2+] 的变化。

4. 使用 Fura-2 测定细胞内 [Ca2+]i 比值

  1. 将生长在玻璃盖玻片上的成肌细胞用Fura-2/AM（终浓度为5 µM）稀释于DMEM中，在37 °C下孵育30分钟。简而言之，从生长有细胞的玻璃盖玻片中移除分化培养基，加入2 mL新鲜分化培养基。从1 mM的储备液中加入10 µL Fura-2 AM，在细胞培养箱中（5% CO2，37 °C）孵育30分钟。
  2. 将玻璃盖玻片转移至灌流室中，并用含2 mM CaCl2的Krebs Ringer溶液冲洗细胞。
  3. 使用20倍水浸FLUAR物镜（数值孔径0.17），按照上述EBV单细胞部分所述方法进行在线[Ca2+]测定。

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结果

[Ca2+]i EBV永生化B淋巴细胞群体中的测量
原代B淋巴细胞表达作为钙离子通道功能的RyR1亚型，该亚型参与调控细胞内钙信号2+ B细胞抗原受体刺激信号过程中的释放通道17. 利用EBV永生化B细胞是一种遗传学家常规使用的方法，用于获得含有患者基因组信息的细胞系，其优势在于能够生成表达突变型RyR1 Ca2+ 携带 RYR1 突变患者中的通道11,13. [Ca2+]i 由特异性 RyR1 激动剂（如 4-氯-间甲酚）添加所引起的变化18 并且可以轻松监测咖啡因，以确定特定的 RYR1 突变是否改变了对激动剂的敏感性...

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讨论

本文所述方案已被多个实验室成功用于研究RYR1突变对钙稳态的影响。该方法的关键步骤涉及无菌操作、细胞培养技能与技术以及生物材料的可获得性。原则上，使用EBV永生化B淋巴细胞的方法更为简便，可用来建立含有突变型RyR1通道的细胞系。这些细胞可冷冻并长期保存于液氮中，并可在任意时间重新复苏培养。此外，研究者可选择在细胞群体水平或单细胞水平上监测钙稳态。前一种方法较为简单，无需荧光显微镜，且可在较短时间内检测来自不同个体的细胞系。其局限性在于细胞生长速度以及是否具备配备加热装置和磁力搅拌器的光谱荧光仪。作为替代方案，可采用流式细胞术结合荧光钙指示剂来测定EBV永生化B淋巴细胞中的钙流变化；通过这种方法可以确定细胞内钙浓度的变化19。若具备荧光显微镜、灌流室和微灌流系统，则单细胞成像具有更高的灵敏度，能够提供更详细的信息，包括细胞间变异、动力学分析以及参与钙释放的亚细胞区域的鉴定。后一种方法在技术上更具挑战性，且需要更多的设备支持。

使用EBV永生化B淋巴细胞具有多种优势，包括可检测除[Ca2+]i...

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披露

作者无任何披露信息。

致谢

本手稿所述工作由瑞士国家科学基金会（SNF）和瑞士肌肉基金会的资助完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-氯-间甲酚Fluka24940
血液采集管Sarstedt172202
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7906
咖啡因Merk102584
Cascade 125+ CCD 相机Photometrics
Cascade 128+ CCDPhotometrics
肌酸Sigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
表皮生长因子（EGF）Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
胎牛血清ThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
马血清Thermo Fisher Scientific16050122
胰岛素ThermoFisher ScientificA11382II
离子霉素SigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
层粘连蛋白ThermoFisher Scientific23017015
镧Fluka61490
微灌流系统ALA-ScientificDAD VM 12 valve manifold
Origin 软件OriginLab CorpSoftware
青霉素/链霉素Gibco Life Sciences15140-122
灌流腔室 POC-RPecon000000-1116-079
聚-L-赖氨酸Sigma-AldrichP8920
RPMIThermoFisher Scientific21875091
荧光分光光度计Perkin ElmerLS50
毒胡萝卜素Calbiochem586005
组织培养皿Falcon353046
组织培养瓶Falcon353107
组织培养小室Falcon353090
胰蛋白酶/EDTA 溶液ThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware
Zeiss Axiovert S100 TV 显微镜Carl Zeiss AG
Zeiss 玻璃盖玻片Carl Zeiss AG0727-016

参考文献

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