内源性表达人RYR1变异体的功能表征

Summary

这里描述了用于研究RYR1突变的功能效应的方法，这些突变在爱泼斯坦巴尔病毒中内源性表达，使人B淋巴细胞永生化，肌肉活检衍生的卫星细胞分化成肌管。

Abstract

RYR1基因的700多种变异已经在患有不同神经肌肉疾病的患者中被发现，包括恶性高热易感性，核心肌病和中心核肌病。由于与RYR1突变相关的表型多种多样，因此表征其功能效应以对患者携带的变异进行分类以用于未来的治疗干预并识别非致病性变异是至关重要的。许多实验室一直对开发功能表征患者细胞中表达的RYR1突变的方法感兴趣。这种方法具有许多优点，包括:突变是内源性表达的，RyR1不会过度表达，避免使用异源RyR1表达细胞。然而，由于患者可能在RYR1以外的不同基因中表现出突变，因此比较具有不同遗传背景的具有相同突变的个体的生物材料的结果非常重要。本手稿描述了为研究内源性表达的RYR1变体的功能效应而开发的方法:（a）爱泼斯坦巴尔病毒永生化的人B淋巴细胞和（b）来自肌肉活检并分化成肌管的卫星细胞。然后监测由添加药理学RyR1激活剂触发的细胞内钙浓度的变化。所选细胞类型加载比例荧光钙指示剂，并通过荧光显微镜在单细胞水平或使用光谱荧光计监测细胞内[Ca^{2 +]}变化。然后比较来自健康对照组的细胞和携带RYR1变异的患者之间的静息[Ca^{2 +]}激动剂剂量反应曲线，从而深入了解给定变异的功能效应。

Introduction

迄今为止，已在人群中鉴定出700多种RYR1变体，并与各种神经肌肉疾病有关，包括恶性高热易感性（MHS），运动诱导的横纹肌溶解，中枢核心疾病（CCD），多微核疾病（MmD），中心核肌病（CNM）1，2，3;然而，表征其功能效应的研究滞后，只有大约10%的突变进行了功能测试。可以使用不同的实验方法来评估给定RyR1变体的影响，包括用编码WT的质粒和突变的RYR1 cDNA^4，5转染异源细胞，如HEK293和COS-7细胞，转导呼吸不良的小鼠成纤维细胞与质粒和编码WT的载体和突变的RYR1 cDNA，然后转导肌-D并分化成肌管⁶，产生携带突变RyR1s的转基因动物模型^7，8，9，表征来自内源性表达RYR1变异的患者的细胞10，11，12。这些方法有助于确定不同的突变如何在功能上影响RyR1 Ca^{2 +}通道。

在这里，描述了为评估RYR1突变的功能效应而开发的方法。在内源性表达RyR1钙通道的人细胞中研究了细胞内钙稳态的各种参数，包括肌管和爱泼斯坦巴尔病毒（EBV）永生化的B淋巴细胞。从患者身上获得细胞，在培养物中扩增并加载成比例的荧光钙指示剂，如Fura-2或indo-1。据报道，由于致病性RYR1突变而改变的参数，包括静息[Ca^{2 +]，}对不同药理激动剂的敏感性以及细胞内Ca^{2 +}储存的大小，可以在单细胞水平上，使用荧光显微镜或使用荧光计在细胞群中测量。然后将从突变携带者的细胞中获得的结果与从健康对照家族成员获得的结果进行比较。这种方法已经证明:（i）许多与MHS相关的突变导致静息[Ca^{2 +]}的增加，并且剂量反应曲线向左移动，以KCl诱导的去极化或药理学RyR1激活与4-氯-m-甲酚10，11，12，13;（ii）与CCD相关的突变导致RyR1的药理学激活释放的峰[Ca^{2 +]}降低，并且如果细胞内Ca^{2 +存储12，13，14，15，}则尺寸减小;（iii）某些变体不影响Ca2 +稳态^13。这种实验方法的优点是:RyR1蛋白不过度表达并且存在生理水平，细胞可以被永生化（肌肉细胞和B淋巴细胞）提供含有突变的细胞系。一些缺点与患者可能携带参与钙稳态和/或激发收缩偶联（ECC）的多个编码蛋白的基因突变有关，这可能会使实验结论复杂化。例如，在MHS和对照人群中鉴定出两种JP-45变体，并且它们的存在被证明会影响二氢吡啶受体（DHPR）对激活¹⁶的敏感性。患者需要可用，生物材料需要新鲜收集，并且需要从当地道德委员会获得道德许可。

Protocol

下面描述的协议符合Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ的道德准则。

1. 爱泼斯坦巴尔永生化B淋巴细胞系的制备¹¹

1. 在知情同意后，在EDTA处理的无菌管中收集30毫升全血，这些无菌管来自携带RYR1突变的先证者和没有突变的健康家庭成员。
   注意:保持所有溶液无菌，并在组织培养罩中工作。
2. 通过密度梯度离心培养基（例如，Ficoll-Hypaque，0.077 g/L）从全血中分离出单核细胞。
   1. 将30 mL无菌血液放入50 mL锥形无菌管中。
   2. 将含有密度梯度离心培养基的巴斯德移液管的尖端置于管底部，并在血液下方缓慢放置20mL无菌的密度梯度离心培养基溶液。
   3. 在18°-20°C下以900×g离心30分钟，无中断。
      注:单核细胞层在密度梯度离心培养基层和含有富集血小板血浆的顶层之间的间相处呈浑浊环状。
3. 使用无菌移液器轻轻除去含有单核细胞（约3-5mL）的相间层，并将溶液转移到干净的50mL无菌锥形管中。
4. 加入20mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞，在室温下以600×g离心10分钟，并将沉淀重悬于PBS中。 重复总共三次;这将确保所有介质都被移出。
5. 最后一次洗涤后，将细胞重悬于1-2mL组织培养基（补充有10%胎儿小牛血清，2mM L-谷氨酰胺和100单位青霉素和链霉素的RPMI培养基）中。将单核细胞（约1×10⁶ 个细胞）置于含有20mL组织培养基的T125组织培养瓶中。
6. 用爱泼斯坦-巴尔病毒感染单核细胞。
   1. 使用来自B95.8细胞系培养物的上清液（含有10^个2-10个3转化单位/mL，储存在-80°C）作为EBV的来源。
   2. 将步骤^{1.5中的1×10 6} 个单核细胞重悬于20mL组织培养基中，并在环孢菌素A（0.2μg/ mL终浓度）存在下将其暴露于B95.8细胞系的2mL上清液中以进行感染。
7. 将烧瓶置于37°C细胞培养箱中，让细胞生长。一周后更换培养基。
   注意:一旦B细胞开始增殖，它们就会形成可识别的团块并迅速生长，以便培养物可以扩增和冷冻。
8. 从EBV永生化的B淋巴细胞系¹¹ 中提取基因组DNA以确认给定突变的存在与否。

2. 细胞内 Ca²⁺ 测量

注意:EBV转化的B淋巴细胞系的细胞内钙浓度的变化可以在细胞群中监测，配备磁力搅拌器和比色皿支架的分光荧光计设置为37°C。 或者，可以通过荧光显微镜监测单个细胞中的Ca^{2 +} 变化。在这两种情况下，从组织培养瓶中取出细胞，用克雷布斯林格溶液（140mM NaCl，5 mM KCl，1 mM MgCl_2，20mM HEPES，1 mM NaHPO_4，5.5mM葡萄糖，pH 7.4含1mM CaCl_{2）洗涤两}次并计数。

1. 对于使用光谱荧光计在细胞群中的实验^11，13，14
   1. 将细胞以1 x 10⁷ 个细胞/ mL的终浓度重悬于克雷布斯林格溶液中，并在37°C下孵育30分钟，终浓度为5μM Fura-2 / AM。
   2. 将细胞以900×g离心10分钟，并以2×10⁶个细胞/ mL的浓度重悬于克雷布斯林格溶液中。
   3. 使用配备磁力搅拌器的光谱荧光计测量荧光变化（比率340/380 nm），该光谱仪设置为最大速度并设置为37°C。
   4. 就在实验之前，在微量离心机中以900×g旋转细胞5分钟，并迅速将沉淀重悬于1.5mL的克雷布斯林格溶液中，EGTA为0.5mM，但不添加Ca^{2 +。}
   5. 将细胞置于3mL玻璃荧光计比色皿中并记录荧光比（340nm / 380nm激发，510nm发射）。
   6. 达到稳定的基线（约30秒），加入所选浓度的RyR1激动剂（4-氯-m-甲酚，或4-cmc）并记录钙瞬时。
      注:使用DMSO制成的300 mM 4-cmc储备溶液用作起始试剂。该溶液可以提前制成，等分并储存在-20°C下数月。
   7. 对不同的4-cmc浓度进行实验。
      注:包括75μM，150μM，300μM，450μM，600μM，750μM至1mM，以产生激动剂与[Ca^{2 +]}变化的剂量反应曲线。通过将来自储备溶液的适当体积的4-cmc直接添加到含有Fura-2加载电池的比色皿中来获得不同的4-cmc浓度。例如，对于终浓度为300μM 4-cmc，将1.5μL储备溶液加入到含有Krebs Ringer溶液中1.5mL细胞的比色皿中。对于较低的激动剂浓度，应用DMSO稀释300mM储备溶液至75mM，并将适当体积加入到含有1.5mL细胞的比色皿中。
   8. 向细胞中加入400nM他西加宁，以计算细胞内储存中存在的Ca^{2 +} 的总量。记录峰值 Ca²⁺。
   9. 绘制给定的 4-cmc 浓度诱导的峰值钙与 thapsigargin 诱导的峰值钙（被认为是 100%），并构建 4-cmc 剂量反应曲线，比较来自先证和健康亲属的细胞
2. 用于单细胞实验¹³
   1. 在无菌H₂O中稀释聚-L-赖氨酸1:10，并预处理玻璃盖玻片30分钟。在无菌组织培养罩下风干。
   2. 将EBV转化的B淋巴细胞在含有1mM CaCl₂的Krebs Ringer溶液中重新悬浮至1 x 10⁶个细胞/ mL的终浓度，并加入5μM Fura-2 / AM的终浓度。
   3. 将1mL细胞放在聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上，并在37°C下在加湿的细胞培养箱中孵育30分钟，以使EBV细胞在加载过程中粘附在玻璃盖玻片上。
   4. 将盖玻片放入灌注室中，然后用含有1mM Ca 2 +的克雷布斯林格溶液开始灌注（以^2mL/ min的速度）。
   5. 使用倒置荧光显微镜（配备40倍油浸物镜（0.17数值孔径））、滤光片（BP 340/380、FT 425、BP 500/530）记录在线测量结果，并附有软件控制的电荷耦合器件（CCD）相机附件。
   6. 以固定曝光时间以1秒的间隔采集图像（340和380nm激发波长均为100 ms）。使用成像软件分析荧光的变化。在激发波长为340和380 nm¹³时测量每个细胞的平均像素值。
   7. 要实现细胞刺激，请使用具有12个瓣膜的细胞灌注刺激器，并添加不同浓度的4-cmc。冲洗阀含有克雷布斯铃声的溶液，不添加Ca^{2 +} 加上100μM La^{3 +，} 仅用于监测细胞内储存的钙释放。
   8. 如上所述，构建4-cmc与[Ca^2+]变化的剂量反应曲线。

3. 从肌肉活检中制备人肌管^10，12，15

注意:不同的实验室使用不同的方法来获得卫星细胞衍生的成肌细胞和肌管。以下是巴塞尔协议中所用方法的说明。

1. 用无菌PBS冲洗肌肉活检，以去除多余的血液并切成约0.5-1mm的小碎片。
2. 准备6孔组织培养皿与插入物。向每个孔中加入1.5 mL人肌肉生长培养基，向每个插入物中加入0.5 mL人肌肉生长培养基。
   注意:生长培养基组成如下:500 mL Dulbecco改良的鹰高葡萄糖培养基或DMEM（4.5 mg / mL），含有10%的马血清，5 ng / mL胰岛素，3 mM谷氨酰胺，600 ng / mL青霉素G和链霉素，以及7 mM HEPES，pH 7.4。也可以使用市售的骨骼肌生长培养基。
3. 将2-3个小肌肉碎片放入每个插入物中（图1A），并将培养皿放入细胞培养箱（5%CO 2，37°C）。大约8-10天后，可以看到卫星细胞从肌肉活检中生长出来并围绕肌肉活检，附着在插入物上（图1，B和C，箭头）。
4. 从活检中释放足够数量的细胞（约10-14天后），胰蛋白酶消化如下:
   1. 除去所有培养基，用1mL PBS冲洗细胞一次，加入0.5mL胰蛋白酶/ EDTA溶液（0.025%胰蛋白酶和0.01%EDTA），并在37°C下孵育5分钟。
   2. 向细胞中加入1mL生长培养基以中和胰蛋白酶的作用，并将卫星细胞转移到新的T25细胞培养瓶中;加入3mL生长培养基，将细胞置于细胞培养箱（5%CO 2，37°C）中。
   3. 第二天更换生长培养基以去除EDTA，随后每周更换一次培养基。
5. 当成肌细胞汇合约75%时，胰蛋白酶消化并转移到层粘连蛋白处理的玻璃盖玻片上。
   注意:按比例，在一个T25烧瓶中生长的细胞应转移到一个直径为43毫米的夹层蛋白处理玻璃盖玻片上。玻璃盖玻片应置于含有3mL生长培养基的60mm直径组织培养板内。
6. 在细胞培养箱（5%CO 2，37°C）的生长培养基中的玻璃盖玻片上生长细胞，每周更换一次培养基。在90%汇合时，切换到分化培养基，组成如下:高葡萄糖DMEM（4.5mg / mL），0.5%牛血清白蛋白，10ng / mL表皮生长因子，0.15mg / mL肌酸，5 ng / mL胰岛素，200 mM谷氨酰胺，600ng / mL青霉素G和链霉素，以及7 mM HEPES，pH 7.4）。也可以使用市售的分化培养基。每周更换一次分化培养基。
7. 在分化培养基中7-10天后，多核肌管可见。在一周内评估 [Ca²⁺] 的变化，如下所述。

4. [Ca²⁺]_i 使用 Fura-2 测定的比率测量

1. 加载玻璃盖玻片生长的肌管，在37°C下在DMEM中稀释30分钟Fura-2 / AM（终浓度为5μM）。 简而言之，从玻璃盖玻片生长的细胞中除去分化培养基，并加入2mL新鲜分化培养基。从1mM的储备溶液中加入10μLFura-2 AM，并在细胞培养箱（5%CO_2，37°C）中孵育30分钟。
2. 将玻璃盖玻片转移到灌注室，并用含有2mM_CaCl2的克雷布斯林格溶液冲洗细胞。
3. 使用20x水浸式FLUAR物镜（0.17数值孔径）执行EBV单细胞部分所述的在线[Ca^2+]测量。

Results

[Ca²⁺]_i 在EBV永生化B淋巴细胞群体中的测量
原代B淋巴细胞表达RyR1同种型，其在B细胞抗原受体刺激的信号传导过程中起到Ca²⁺释放通道^{的作用17。}用EBV对B细胞进行永生化，这是遗传学家经常用于获得含有患者基因组信息的细胞系的程序，它提供了在携带RYR1突变的患者中产生表达突变RyR1 Ca^{2 +}通道的细胞系的优势11，13。[约²⁺]添加特定的RyR1激动剂（如4-氯-m-甲酚¹⁸和咖啡因）_{带来的变化可以很容易地}监测，以确定给定的RYR1突变是否改变了对激动剂的敏感性，释放的钙量，静息[Ca^{2 +}

Discussion

本文中描述的方案已被几个实验室成功用于研究RYR1突变对钙稳态的影响。本文概述的方法的关键步骤涉及无菌性，细胞培养技能和技术以及生物材料的可用性。原则上，EBV永生化的B淋巴细胞的使用更简单，并允许产生含有突变RyR1通道的细胞系。细胞可以冷冻并在液氮中储存多年，并且可以随时重新开始培养。此外，可以选择是在细胞群中还是在单细胞水平上监测钙稳态。前一种方法更简单，不需要荧光显微镜，并允许研究人员在短时间内测试来自不同个体的细胞系。限制是细胞生长的速度和配备齐全（加热和磁力搅拌器）光谱荧光计的可用性。作为替代方法，流式细胞术与荧光钙指示剂的组合可用于测量EBV永生化B淋巴细胞中的钙通量;以这种方式可以确定细胞内钙浓度的变化^19.如果荧光显微镜、灌注室和微灌注系统可用，则单细胞成像具有更灵敏的优点，并提供更详细的信息，包括细胞间变异性、动力学分析和参与钙释放的亚细胞结构域的鉴定。后一种方法在技术上更具挑战性，需要更多的设备。

使用EBV永生化的B淋巴细胞具有多种优点，包括可以测量除[Ca^{2 +}]_i...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-氯间甲酚	Fluka	24940
采血管	Sarstedt	172202
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7906
咖啡因	Merk	102584
Cascade 125+ CCD 相机	光度学
Cascade 128+ CCD	光度学
肌酸	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
表皮生长因子 （EGF）	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Horse 血清	Thermo Fisher Scientific	16050122
ThermoFisher	ThermoFisherScientific	A11382II
离子霉素	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
层粘连蛋白 ThermoFisher	Scientific	23017015
镧	Fluka	61490
微灌注系统	ALA-Scientific	DAD VM 12 阀组
Origin 软件	OriginLab Corp	软件
青霉素/链霉素	Gibco 生命科学	15140-122
灌注室 POC-R	Pecon	000000-1116-079
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
分光荧光计	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
组织培养皿	Falcon	353046
组织培养瓶	Falcon	353107
组织培养小室	Falcon	353090
胰蛋白酶/EDTA 溶液	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	VisitronSystems GmbH	软件
蔡司 Axiovert S100 电视显微镜	Carl Zeiss AG
蔡司玻璃盖玻片	Carl Zeiss AG	0727-016