天然膜中蛋白质的高分辨率固态核磁共振研究

摘要

本工作详细介绍了制备同位素标记的膜蛋白样品的可靠基本流程，以及如何利用现代固态核磁共振波谱技术对其进行高分辨率分析。

摘要

膜蛋白对细胞功能至关重要，因此是重要的药物靶点。固态核磁共振（ssNMR）光谱技术为研究日益复杂的生物膜中此类蛋白的结构与动力学提供了独特途径。本文介绍现代固态核磁共振光谱技术作为一种在原子尺度上研究天然脂质膜中蛋白质结构与动力学的工具。这类光谱研究得益于高灵敏度ssNMR方法的应用，即质子（¹H）检测ssNMR和动态核极化（DNP）增强的ssNMR。以细菌外膜β-桶状蛋白BamA和离子通道KcsA为例，我们展示了制备同位素标记膜蛋白的方法，并通过ssNMR获取其结构与运动信息的技术流程。

引言

在生理相关环境中研究膜蛋白的结构与运动，对传统结构生物学技术提出了挑战¹。现代固体核磁共振波谱技术（ssNMR）为膜蛋白的表征提供了一种独特的方法^2,3,4,5,6,7，长期以来已被用于研究多种膜蛋白，包括嵌入膜内的蛋白质泵⁸、通道^9,10,11以及受体^12,13,14,15。技术进步，如超高磁场>1,000 MHz、快速魔角旋转频率>100 kHz以及超极化技术

方案

1. 均一标记的²H、¹³C、¹⁵N标记的BamA-P4P5的制备

注意：尽管本方案涉及非致病性革兰氏阴性细菌的操作，但仍必须遵守基本的生物安全规程，包括佩戴护目镜、实验服、手套，并遵循机构规定的微生物操作标准流程。

1. 使用单个菌落 E. coli BL 21 Star (DE3) 菌株含有 pET11a 质粒ΔssYaeT 质粒编码 E. coli BamA-P4P5 用于接种 50 mL 含 50 的胰蛋白胨肉汤 µg/L 氨苄青霉素
2. 在37℃下培养培养物 °C，200 rpm 振荡培养至 OD₆₀₀ 达到0.6时，以2,000转/分钟离心 x g 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL M9 中（参见 表 1) 至最大 OD₆₀₀ 0.1 的
   注意：除非另有说明，所有后续培养步骤均在上述条件下进行。
3. 培养至 OD₆₀₀ 0.5。在2,000转下离心 x g 室温下孵育10分钟。将沉淀重悬于50 mL含90% D的M9培养基中₂O（参见 表 1 最大OD值的配方）_600<....

结果

图2展示了包涵体纯度（图A）和包涵体重折叠（图B3）的代表性凝胶结果。图2证实了¹³C,¹⁵N标记的BamA-P4P5成功纯化。

图3A展示了一个有序性良好的膜蛋白典型的二维¹³C-¹³C谱图，而图3B展示了一个全氘代膜蛋白典型的高质量二维¹⁵N¹H谱图²⁵。请注意，该膜蛋白以包涵体形式表达，因此其跨膜区域也可实现全氘代。对于不以包涵体形式表达的膜蛋白，通常需要使用基于H₂O的培养基进行培养^27,55,

讨论

膜蛋白在原核和真核生物细胞关键生命功能的调控中起着核心作用；因此，从原子分辨率水平理解其作用机制至关重要。现有的结构生物学技术已极大地推动了对膜蛋白的科学认知，但这些技术主要依赖于从无膜的体外 系统中获得的实验数据。本文介绍一种实验方法，通过采用前沿的固态核磁共振技术——快速魔角旋转（fast-MAS）和动态核极化（DNP），可获得嵌入类天然膜环境中的两种细菌膜蛋白在原子水平上的结构与功能信息。该方法可广泛适用于其他细菌膜蛋白的研究。

本方案首先描述了一种高效且高纯度制备三重同位素标记BamA的稳健方法（图2A）——也可采用其他稳定的同位素标记策略。纯化过程利用表面活性剂作用与超声处理的协同效应，从BamA包涵体中去除细胞碎片。随后的复性步骤中形成BamA-LDAO胶束（图2B）。进一步添加脂质并进行透析，有助于去除LDAO及残留的表面活性剂分子，从而促进形成适用于固态核磁共振（NMR）研究的蛋白脂质体。蛋白脂质体的形成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钼酸铵	Merck	277908
氯化铵-15N	Cortecnet	CN80P50
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
苯甲酸酯酶	EMD Millipore Corp	70746-3
硼酸	Merck	B6768
溴酚蓝	Sigma	B0126
二氯化钙	Merck	499609
氯化胆碱	Sigma	C-1879
氯化钴	Merck	449776
硫酸铜	Merck	C1297
D-生物素	Merck	8512090025
氧化氘	Cortecnet	CD5251P1000
二甲基亚砜	Merck	D9170
乙二胺四乙酸	Sigma Aldrich	L6876
叶酸	Sigma	F-7876
葡萄糖 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
甘油	Honeywell	G7757
甘油 (12C3, 99.95% D8, 98%)	Eurisotope	CDLM-8660-PK
甘油（非富集）	Honeywell	G7757-1L
甘氨酸	Sigma Aldrich	50046
盐酸胍	Roth Carl	NR.0037.1
硫酸亚铁	Merck	307718
异丙基 β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷	Thermofisher	R0392
LB培养基	Merck	L3022
溶菌酶	Sigma Aldrich	L6876
氯化镁-六水合物	Fluka	63064
硫酸镁	Merck	M5921
磷酸二氢钾	Merck	1051080050
肌醇	Sigma	I-5125
n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷	Acros Organics	3293702509
N,N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物	Merck	40236
烟酰胺	Sigma	N-3376
泛酸	Sigma	21210-25G-F
蛋白酶抑制剂	Sigma	P8849
盐酸吡哆醛	Sigma Aldrich	P9130
核黄素	Aldrich	R170-6
氯化钠	Merck	K51107104914
磷酸二氢钠-一水合物	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
十二烷基硫酸钠	Thermo-scientific	28365
氢氧化钠	Merck	1,06,49,81,000
蔗糖	Sigma Life Science	S9378
盐酸硫胺素	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
氯化锌	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL 超速离心管	Beckman Coulter	357448
30 kDa 离心过滤器	Amicon	UFC903024
3.2 mm 宝石DNP转子及端盖	Cortecnet	H13861
3.2 mm 聚四氟乙烯插件	Cortecnet	B6628
3.2 mm 样品装填/卸载工具	Cortecnet	B6988
3.2 mm 普通壁MAS转子	Cortecnet	HZ16913
3.2 mm 普通壁MAS转子	Cortecnet	HZ09244
3.2 mm 薄壁转子工具包	Cortecnet	B136904
1.3 mm MAS转子 + 端盖	Cortecnet	HZ14752
1.3 mm 填充工具	Cortecnet	HZ14714
1.3 mm 样品装填器	Cortecnet	HZ14716
1.3 mm 端盖移除器	Cortecnet	HZ14706
1.3 mm 端盖安装工具	Cortecnet	HZ14744
透析袋 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - 黑色	Merck	HS15094