通过固体 NMR 对天然膜中的蛋白质进行高分辨率研究

摘要

这项工作详细介绍了如何制备同位素标记的膜蛋白样品并使用现代固体 NMR 波谱方法对其进行高分辨率分析的稳健基本例程。

摘要

膜蛋白对细胞功能至关重要，因此是重要的药物靶标。固体核磁共振 （ssNMR） 波谱为探测日益复杂的生物膜中此类蛋白质的结构和动力学提供了一种独特的途径。在这里，我们提出了现代固体 NMR 波谱作为在天然脂质膜和原子尺度上研究蛋白质结构和动力学的工具。这种波谱研究受益于使用高灵敏度的 ssNMR 方法，即质子（¹H）检测到的 ssNMR 和 DNP（动态核极化）支持的 ssNMR。使用细菌外膜 β 桶蛋白 BamA 和离子通道 KcsA，我们提出了制备同位素标记的膜蛋白并通过 ssNMR 获得结构和运动信息的方法。

引言

在生理相关环境中对膜蛋白进行结构和运动研究对传统的结构生物学技术构成挑战¹。现代固体核磁共振波谱 （ssNMR） 方法为膜蛋白的表征提供了一种独特的方法 2,3,4,5,6,7，长期以来一直用于研究膜蛋白，包括膜嵌入的蛋白质泵 ⁸、通道 9、¹⁰、¹¹ 或受体^{12,13，14,15}。超高磁场 >1,000 MHz、快速魔角旋转频率 >100 kHz 和超极化技术¹⁶ 等技术进步使 ssNMR 成为在从脂质体到细胞膜甚至整个细胞的日益复杂的环境中研究膜蛋白的强大方法。例如，DNP 已成为此类实验的有力工具（参见参考文献 17,18,19,20,21,22,23,24,25）。最近，¹H 检测到的 ssNMR 为以高光谱分辨率和灵敏度研究膜蛋白提供了越来越多的可能性 25,26,27,28,29。这项工作重点介绍了两种参与基本功能的细菌膜蛋白，即蛋白质插入和离子转运。相应的蛋白质 BamA 25,30,31,32,33 和 KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39（或其嵌合变体 ^10,40）已通过 ssNMR 进行了检测方法十多年来一直有效。

这里介绍了细菌来源膜蛋白的制备和 ssNMR 表征的代表性方案。该协议的不同步骤如图 1 所示。首先，解释了 BamA 的表达、同位素标记、纯化和膜重构。然后，提出了通过 ssNMR 表征膜蛋白的一般工作流程;具体来说，使用 ¹H 检测到的 ssNMR 在快速魔角旋转下分配膜蛋白骨架。最后，详细介绍了动态核极化 （DNP） 支持的实验的基本设置和采集，这些实验显著提高了 ssNMR 信号灵敏度。

方案

1. 生产均匀标记的 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N 标记的 BamA-P4P5

注意:虽然该协议需要与非致病性革兰氏阴性菌一起工作，但必须遵守基本的生物安全程序，即佩戴安全眼镜、实验服、手套，并遵循与微生物一起工作的机构标准作程序。

1. 使用含有编码大肠杆菌 BamA-P4P5 的 pET11aΔssYaeT 质粒的大肠杆菌 BL 21 Star （DE3） 菌落接种 50 mL 补充有 50 μg/L 氨苄青霉素的溶原肉汤。
2. 在 37 °C 下以 200 rpm 培养培养物，直到达到 OD₆₀₀ 的 0.6。以 2,000 x g 旋转 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL M9 中（见 表 1），最大 OD₆₀₀ 为 0.1。
   注意:除非另有说明，否则所有未来的生长步骤均按照上述条件进行。
3. 培养物直至 OD₆₀₀ 为 0.5。在室温下以 2,000 x g 离心 10 分钟。将沉淀重悬于 50 mL 含有 90% D₂O 的 M9 中（配方见 表 1 ），最大 OD₆₀₀ 为 0.1。将培养物在 30 °C 下以 200 rpm 培养过夜。
4. 在室温下以 2,000 x g 离心培养物 10 分钟。将沉淀重悬于预热的 50 mL 90% D₂O M9 中，最大 OD₆₀₀ 为 0.1。增长直到达到 OD₆₀₀ 1.0。
5. 在室温下以 2,000 x g 离心培养物 10 分钟。制备 100 mL 100% D₂O M9 培养基，其中含有富集同位素的未富集葡萄糖和氯化铵。重悬于 100% D₂O M9 培养基中，最大 OD₆₀₀ 为 0.1。生长直到达到 OD₆₀₀ 的 0.7。
6. 在室温下以 2,000 x g 离心培养物 10 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 500 mL 含同位素的 100% D₂O M9 培养基中（见 表 1），最大 OD₆₀₀ 为 0.1。
7. 让培养物生长，直到达到 0.6-0.9 的 OD₆₀₀ 。用 1 mM 异丙基 β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 诱导。表达 4 小时，并在室温下以 4,000 x g 收获细胞 15 分钟。

2. 纯化、重折叠和 BamA-P4P5 蛋白质脂质体形成

注意:本节的所有步骤都应在通风橱中进行。离心后打开试管时必须特别小心，以限制有害气溶胶。

1. 在冰上解冻颗粒。将沉淀重悬于 20 mL 冷缓冲液 1 中。有关缓冲区，请参阅 表 2 。
2. 将溶液在 4,000 x g 下在 4 °C 下旋转 20 分钟。 将沉淀重悬于 20 mL 冷蒸馏 H₂O 中。让悬浮液在冰上孵育 10 分钟。
3. 将悬浮液在 4,000 x g 下在 4 °C 下旋转 20 分钟。 重悬于 10 mL 冷缓冲液 2 中，并在冰上孵育 30 分钟。
4. 在混合物中补充额外的 10 mL 冷缓冲液 2，并在冰上再孵育 30 分钟。加入 0.5% 正十二烷基-B-D-麦芽糖苷 （DDM） 并轻轻旋转。
5. 在 13 kHz 的冰上对样品进行超声处理，直到恶性使用 10 秒长的开/关脉冲。在 4 °C 下以 25,000 x g 旋转 20 分钟。 用 20 mL 缓冲液 3 洗涤 3 次。在 4 °C 下以 25,000 x g 离心 20 分钟。
6. 将沉淀重悬于 20 mL 缓冲液 4 中。在 37 °C 下孵育 30 分钟。在 13 kHz 的冰上对样品进行超声处理，直到清除使用 10 秒长的开/关脉冲。
7. 在 4 °C 下以 25,000 x g 的速度旋转样品 20 分钟。 重复步骤 2.4 至 2.6，省略添加蛋白酶抑制剂并在 37 °C 下孵育。
8. 用 20 mL 水洗涤沉淀，用缓冲液 3 洗涤沉淀两次。在 4 °C 下以 25,000 x g 旋转 20 分钟。 将悬浮液分装到 1 mL 微量离心管中，并在台式离心机上以最大速度旋转微量离心管 20 分钟。通过 10% SDS-Page 凝胶评估包涵体纯度，参见 图 2A。纯化的 BamA-P4P5 三重 （^{2 H，13 C，15}N） 标记的预期产量为 30 mg/L。
9. 将包涵体溶解在 200 μL 缓冲液 5 和 300 μL H₂O 中。加入 6M 氯化胍 （GdnCl）。用 H₂O 将微量离心管的体积调节至 1 mL。涡旋混合物并在室温下孵育 4 小时。定期（每 30 分钟）涡旋微量离心管。
10. 在 4 °C 下以 100,000 x g 旋转 1 小时。 使用 Beer-Lambert 定律测定 280 nm 的蛋白质浓度。摩尔消光系数为 117,120 ^{M-1 cm-1}。如果浓度为 >100 μM，则用含 6 M GdnCl 的 1x 缓冲液 5 稀释。在缓冲液 6 中快速稀释蛋白质 10 倍。将混合物在室温下孵育过夜。
    注:对于超速离心，请使用超速离心级 1.5 mL 试管。
11. 使用半非变性 SDS-Page 凝胶测定复性效率。从步骤 2.10 中取出两个 10 μL 等分试样，向每个等分试样中加入 10 μL Lameili 缓冲液（缓冲液 8）。将一个样品在 95 °C 下煮沸 10 分钟;将另一份等分试样留在冰上。然后，在 10% SDS-Page 凝胶上以 14 mA 运行两个样品。凝胶的堆积和电泳部分缺乏还原剂和 SDS。使用考马斯染料进行蛋白质染色。预期结果如图 2B 所示。
12. 将样品在 4,000 x g 下在 4 °C 下旋转 20 分钟。 使用 30 kDa 离心过滤器将样品浓缩至 8 mL 的工作体积。将样品在 4,000 x g 下在 4 °C 下旋转 20 分钟。 测量 280 nm 处的蛋白质吸光度。与步骤 2.10 一样，确定蛋白质浓度。
13. 计算 10:1 脂质与蛋白质比 （LPR-mol/mol） 所需的脂质量。从氯仿原液中，将所需量的脂质（如步骤 2.12 中计算）添加到 100 mL 圆底烧瓶 （RBF） 中。在温和的氮气流下从 RBF 中抽出氯仿。将 RBF 置于高真空下 3 小时。用 1 mL 缓冲液 7 水合脂质膜。将 RBF 在 37 °C 下孵育 10 分钟。
14. 将蛋白质混合物（来自步骤 2.12）添加到 RBF 中。
15. 在 RBF 中将蛋白质/脂质混合物（从步骤 2.14 开始）稀释至 50 mL 的最终体积。使用补充有溶于 DMSO 的 1x 蛋白酶抑制剂的缓冲液 7，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
16. 用 100 体积的缓冲液 7 透析 2 周（使用 12-14 kDa 截留分子量的透析管）。在前 24 小时，在室温下进行透析，每 8 小时加入一次新鲜的缓冲液 7。之后，每天更换一次缓冲液，并在 4 °C 下进行透析。

3. 填充 ssNMR 转子

1. 在步骤 2.16 之后，在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30-60 分钟，以形成沉淀。用移液管去除上清液。
   注:下面讨论的技术已针对 3.2 mm 转头进行了优化，但几乎适用于任何转头直径。
2. 将样品移液到转子中，然后用台式离心机轻轻旋转。
   注:根据样品的稠度，可以使用致密化工具压缩样品，或者使用刮刀代替移液器将样品放入转子中。
3. 重复此过程 2-3 次，直到转子填充到正确的高度，并检查是否有足够的空间容纳盖子，如致密工具上的标记线所示。使用瓶盖定位工具在平坦的表面上关闭转子。标记转子底部边缘的一半。
   注:新一代 ssNMR 转头在底部边缘带有耐用的激光标记，用于对转头旋转频率进行光学检测。否则，建议使用记号笔;因为 MAS 检测器已专门针对 sharpie 墨水进行了优化。
4. 使用放大镜检查盖子是否放置正确。

4. 通过 2D ¹³C- ¹³C ssNMR 波谱进行样品表征

1. 将转子插入磁体，使用 MAS 装置的自动旋转程序，将样品旋转至 10 至 20 kHz MAS 之间所需的 MAS 频率，同时将样品冷却至 270 K 设定温度。调谐并匹配 ¹H 和 ¹³C 通道。
   注意:对于 MAS 频率的选择，避免意外地将光谱 Cα 区和羰基碳区之间的化学位移距离与纺丝频率匹配，即避免一阶旋转共振条件⁴¹。
2. 通过在 25-80 kHz 范围内改变质子通道上的射频功率来优化 ^{1 H-13}C 交叉极化⁴² （CP） 实验。典型参数包括 ¹³C 下 45 kHz 射频功率、采集期间 80-100 kHz 异核 ¹H 去耦⁴³ 、1.8-2.0 s 回电延迟和 64 次扫描。
   1. 优化 CP 接触时间，以获得对脂肪族碳的最大信号灵敏度。
   2. 通过将起始脉冲乘以 4（即优化 360° 脉冲）来确定 ¹H 90° 脉冲长度，并在信号消失之前改变长度。在 CP 传输后直接包括一个矩形脉冲，并以类似方式优化 ¹³C 90° 脉冲长度。
3. 以 30 ms 的磁化转移时间运行 2D ^{13 C-13}C 质子驱动的自旋扩散 （PDSD） 型实验，例如 PARIS，以检测残差内部相关性并衡量样品质量。从先前优化的 ¹³C-CP 实验中转移功率水平、接触时间和 90° 脉冲长度。在间接维度中使用 4-6 ms 的采集时间。使用平方正弦钟函数 （QSIN） 处理光谱，或者对于不敏感的样品，在两个维度上进行指数线展宽。
4. 提取孤立交叉峰的切片并确定半高处的线宽。线宽在 ~0.3-1.0 ¹³C ppm 之间表示样品有序，非常适合 ssNMR 表征，而线宽高于 1.0 ¹³C ppm 表示构象异质性，可能会影响 ssNMR 表征。 图 3A 所示的 BamA 的 2D CC PARIS 光谱是可提供高质量光谱的有序蛋白质的一个例子。

5. 通过 ¹个 H 检测到的 3D ssNMR 波谱进行主链分配

1. 采集 2D NH 光谱指纹
   1. 如上所述，将样品填充到 1.3 mm 转子中。将转子插入磁力架，将样品旋转至 10-20 kHz MAS，并将样品冷却至 240-250 K 设定温度或更低，具体取决于 ssNMR 探头的规格。使用 MAS 单元接口以 5 kHz 至 60 kHz MAS 的步长逐渐增加 MAS 频率。
   2. 在 ¹³C 和 ¹⁵N CP 实验中优化 CP 振幅、接触时间和 90° 脉冲长度。在异核信道上使用 30-50 或 70-100 kHz 左右的振幅，并将 ¹H 信道的振幅在 80-180 kHz 之间变化。使用 0.7-1.2 秒的回收延迟，以及 15 kHz 低功耗异核质子去耦⁴⁴。此外，有关如何设置 CP ssNMR 实验的更多实际细节，请参阅参考文献⁴⁵ 。
   3. 获取 2D NH 实验以测量 ¹H 分辨率。传输 ¹⁵个 N-CP 参数，并在直接和间接维度上使用大约 15 和 25 ms 的采集时间。对于前 ¹H 至 ¹⁵N CP 转移，请使用先前优化的接触时间。对于 ¹⁵N 到 ¹H 的反向转移，使用 0.7-1.0 ms 的接触时间，以最大限度地减少剩余磁化之间的转移。
   4. 使用 50-250 ms 水 MISSISSIPPI 抑制⁴⁶，具体取决于样品的含水量。在两个维度上都使用平方正弦钟函数 （QSIN） 处理频谱。提取孤立交叉峰的切片并确定半高处的线宽。图 3B 中显示了膜包埋的 BamA-P4P5 的高质量 2D NH 光谱²⁵ 的示例。
2. 主干分配
   1. 优化 1D ¹⁵N 至 ¹³Cα 特异性 CP 实验⁴⁷.将 ¹³C 载体置于 Cα 区域的中间，大约 55 ppm。使用 20 kHz 的 ¹³C 射频振幅，并在 35 至 45 kHz 之间改变 ¹⁵N 振幅，以实现向 Cα 信号的最大传输和向羰基信号的最小传输。将接触时间从 3 毫秒优化到 10 毫秒，增量为 1 毫秒。
   2. 运行 3D CαNH 实验。从先前优化的步骤中传输所有 CP 振幅、接触时间和脉冲长度。在间接和直接采集维度中使用大约 10 ms 和 30 ms。在所有三个维度上使用平方正弦钟函数 （QSIN） 处理频谱。
   3. 优化 1D Cα 到 CO DREAM 的磁化转移⁴⁸.从 ¹⁵N 到 ¹³Cα 特异性 CP 转移开始。然后，使用 ¹³C 通道上的旋转锁将磁化强度从 Cα 转移到 CO。将 RF 幅度从 20 kHz 更改为 35 kHz，以实现最佳传输。优化传输时间，从 4 毫秒到 10 毫秒。
   4. 运行 3D Cα（CO）NH 实验。从先前优化的步骤中传输所有射频幅度、接触时间和脉冲长度。在间接和直接采集维度中使用大约 10 ms 和 30 ms。在所有三个维度上使用平方正弦钟函数 （QSIN） 处理频谱。
   5. 重复并调整步骤 1-4 用于类似的 3D CONH 和 CO（C α）NH 实验。使用这四重 3D 实验进行连续 Cα 和 CO 游走以分配蛋白质骨架，如图 4²⁸ 中的 KcsA 示例所示。

6. 通过 ¹H 检测的 ssNMR 波谱进行蛋白质动力学分析

1. 对于 ¹⁵N T₁ 研究，使用 60 kHz MAS 下先前优化的 2D NH 实验，并在第一个 ¹H 至 ¹⁵N 交叉极化步骤之后包括延迟。获取一系列 2D NH 实验，并使用 0、2、4、8 和 16 s 等步长将延迟从 0 到 16 秒。
2. 将已解析信号的归一化强度绘制为增加的延迟时间的函数。根据 y = exp^（-x/T1） 将 T₁ 衰减拟合为单指数，其中 y 是衰减时间 x 处的信号强度。
3. 类似地，对于 ¹⁵N T_1rho 研究，在第一个 ¹H 至 15 N 交叉极化步骤之后，在 ¹⁵N 通道的脉冲程序中包括一个自旋锁定脉冲，其 rf 幅度在 ^15-20kHz 之间^26,49。获取一系列 2D NH 实验，并将延迟从 0 更改为 150 毫秒，并将解析信号的 T_1rho 衰减拟合为单指数。图 5 中显示了膜包埋的 K ⁺ 通道的说明性 ¹⁵N T_1rho 数据 ^27,28。

7. 动态核极化

注:以下制备步骤与使用 3.2 mm 蓝宝石 MAS 转子的商业 DNP 设置有关（图 6）²⁰。使用氧化锆转子或其他 DNP 设备可能会导致较低的 DNP 信号增强。

1. 将膜蛋白沉淀（来自步骤 3.1）重悬于 50 μL 氘代 DNP 缓冲液（60% （v/v） 氘代 d8 和甘油，以及 15 mM AMUPol⁵⁰ 中。对于 800 MHz 的实验，我们建议使用 10 mM NATriPOL-3⁵¹。另请参阅参考文献⁵² 以了解 DNP ssNMR 实验的更多实际方面。
2. 在 4 °C 下以 100,000 x g 离心 10-20 分钟，以形成沉淀。用移液管去除上清液。
3. 将离心适配器和 3.2 mm 蓝宝石 MAS 转子组件预冷至 <4 °C。 以下步骤 （7.4-7.7） 需要尽快完成，以防止 DNP 代理减少。
4. 将 3.2 mm 蓝宝石转子放入离心机适配器中，并用步骤 7.2 中的蛋白质脂质体悬浮液填充。
5. 使用 200 μL 移液器吸头小心地将重悬的膜蛋白样品靠在转子内壁上移液。让溶液向下滑到转子底部。确保没有形成气泡。
6. 在 4 °C 下以 4,500 x g 的速度将转子中的样品旋转 5-10 分钟。 小心移出含有过量 DNP 汁液的上清液，不要破坏细胞沉淀。重复步骤 6.4-6.6，直到转子装满。
7. 使用转子顶部的垫片螺钉小心地定位聚四氟乙烯 （PTFE） 垫片。
8. 将转子，盖子朝下放入转子柱塞⁵³ 中，然后将转子浸入液氮中。至少等待 30-60 秒，让转子和样品冻结。
9. 启动热交换器装置并将 DNP 探头冷却至 ~90K。
10. 将 MAS 装置设置为 手动模式 ，将变温 （VT） 设置为 135 l/h，将轴承和驱动气体流量设置为 ~6 l/h。
11. 在 MAS 控制台上使用 Eject 。
12. 将步骤 7.8 中的冷冻样品从液体 N2 转移到样品捕集器中，并将其放入探针中（另见参考文献⁵³）。
13. 在接合"插件"之前，手动将探头轴承压力 （Bp） 增加到 ~500 mbar。这对于转子的稳定和安全旋转是可取的。
14. 使用参考文献⁵³ 中描述的过程将 MAS 速率提高到所需的值。
15. 在进行多维实验（例如，本文第 3 节中描述的 2D CC 实验）之前，使用标准的 1D CP 实验（另见参考文献^51,54）（图 7）检查有和没有微波的 DNP 增强。

结果

图 2 显示了包涵体纯度（图 A）和包涵体复性（图 B3）的代表性凝胶。 图 2 证实了 ^{13 C，15}N 标记的 BamA-P4P5 的成功纯化。

图 3A 显示了有序膜蛋白的典型 2D ^{13 C-13}C 光谱，图 3B 显示了全氘化膜蛋白的典型高质量 2D ¹⁵N¹H 光谱²⁵。请注意，这种膜蛋白表达为包涵体，因此跨膜部分也可以通过氘化进入。对于不在包涵体中表达的膜蛋白，通常需要使用基于 H₂O 的生长培养基 27,55,56,57。

讨论

膜蛋白是原核生物和真核生物中重要细胞功能调节的关键参与者;因此，在原子分辨率水平上了解它们的作用机制至关重要。现有的结构生物学技术将对膜蛋白的科学理解推得相当远，但严重依赖从没有膜的体外系统收集的实验数据。在本文中，提出了一种实验方法，该方法允许利用尖端的固体 NMR 技术（即 fast-MAS 和 DNP）获得对嵌入天然样膜中的两种细菌膜蛋白的结构和功能的原子见解。该方法广泛适用于其他细菌膜蛋白。

该协议首先描述了一种以高产量和纯度生产和纯化三重同位素标记的 BamA 的稳健方法 （图 2A） - 可以采用其他稳定同位素标记方案。纯化方案利用表面活性剂活性和超声处理之间的协同作用，从 BamA 包涵体中去除细胞碎片。随后的重折叠看到 BamA-LDAO 胶束的形成（图 2B）。进一步添加脂质和透析有助于去除 LDAO 和残留的表面活性剂分子，从而促进形成适合固体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铵态铵	默克	277908
氯化铵-15N 氯化	Cortecnet	CN80P50
氨苄青霉素	Sigma Aldrich	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
Benzonase	EMD Millipore Corp	70746-3
硼酸	默克	B6768
溴酚蓝	Sigma	B0126
二氯化钙	默克	499609
氯化胆碱	Sigma	C-1879
氯化钴	默克	449776
硫酸铜	默克	C1297
D-生物素	默克	8512090025
氧化氘	Cortecnet	CD5251P1000
二甲基亚砜	默克	D9170
乙二胺四乙酸	Sigma Aldrich	L6876
叶酸	Sigma	F-7876
葡萄糖 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
甘油	霍尼韦尔	G7757
甘油 （12C3，99.95% D8， 98%）	欧洲同位素	CDLM-8660-PK
甘油（未富集）	霍尼韦尔	G7757-1L
甘氨酸	Sigma Aldrich	50046
盐酸胍	Roth Carl	NR.0037.1
硫酸铁	默克	307718
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷	Thermofisher	R0392
溶原肉汤	Merck	L3022
溶菌酶	Sigma Aldrich	L6876
氯化镁 - 六水合	Fluka	63064
硫酸镁	Merck	M5921
磷酸二氢钾	Merck	1051080050
肌醇	Sigma	I-5125
n-十二烷基-B-D-麦芽糖苷	Acros 有机物	3293702509
N，N-二甲基十二胺 N-氧化物	默克	40236
烟酰胺	Sigma	N-3376
泛烯酸	Sigma	21210-25G-F
蛋白酶抑制剂	Sigma	P8849
吡哆醛-盐酸	Sigma Aldrich	P9130
核黄素	Aldrich	R170-6
氯化钠	Merck	K51107104914
磷酸二氢钠 - 一水合	Sigma Aldrich	1,06,34,61,000
十二烷基硫酸钠	Thermo-scientific	28365
氢氧化钠	Merck	1,06,49,81,000
蔗糖	Sigma 生命科学	S9378
盐酸硫胺素	默克	5871
Tris-HCl	西格玛奥尔德里奇	10,70,89,76,001
氯化锌	默克	208086
大肠杆菌 BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 mL 超管	贝克曼库尔特	357448
30 kDa 离心过滤器	Amicon	UFC903024
3.2 mm 蓝宝石 DNP 转子，带盖	Cortecnet	H13861
3.2 mm 特氟龙插件	Cortecnet	B6628
3.2 mm 样品装填器/解包器	Cortecnet	B6988
3.2 mm 常规壁 MAS 转头	Cortecnet	HZ16913
3.2 mm 常规壁 MAS 转子	Cortecnet	HZ09244
用于 3.2 mm 薄壁转子	Cortecnet	B136904
1.3 mm MAS 转子 + 瓶盖	Cortecnet	HZ14752
1.3 mm 进样工具	Cortecnet	HZ14714
1.3 mm 样品装瓶器	Cortecnet	HZ14716
1.3 mm 瓶盖去除器	Cortecnet	HZ14706
1.3 mm 帽组工具	Cortecnet	HZ14744
透析管 12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - 黑色	Merck	HS15094