使用免疫荧光染色评估和量化结肠粘膜中的微上皮间隙

Summary

在这里，我们描述了一种新方法，用于可视化发炎的结肠粘膜中跨细胞和细胞旁通透性增强的具体位置。在该测定中，我们将 10 kDa 荧光染料与赖氨酸可固定葡聚糖偶联，以观察结肠粘膜中的高渗透性区域 （HPR）。

Abstract

肠粘膜内的上皮细胞形成一个物理屏障，将管腔内容物与间质分开。上皮屏障损伤与炎症性肠病 （IBD） 等各种病理的发展有关。在发炎的粘膜中，破坏上皮单层的浅表糜烂或微糜烂对应于高通透性的部位。几种机制与微侵蚀的形成有关，包括细胞脱落和细胞凋亡。这些微糜烂通常代表随机分布在结肠中的微小上皮间隙。这些上皮间隙的可视化和量化已成为研究肠上皮屏障功能的重要工具。在这里，我们描述了一种新方法，用于可视化发炎的结肠粘膜中跨细胞和细胞旁通透性增强的具体位置。在该测定中，我们将 10 kDa 荧光染料与赖氨酸可固定葡聚糖偶联，以观察结肠粘膜中的高渗透性区域 （HPR）。细胞死亡标志物的额外使用表明，HPR 包含发生上皮挤出/脱落的凋亡病灶。此处描述的协议提供了一种简单但有效的方法来可视化和量化肠道中的微侵蚀，这在肠道上皮屏障受损的疾病模型中是一个非常有用的工具。

Introduction

胃肠道 （GI） 粘膜形成一道物理屏障，将细胞外环境和内部宿主环境分开，并参与营养物质、水和电解质的吸收。肠道屏障包括一个由糖蛋白构成的粘液层、一个单层上皮细胞，下面的固有层是免疫和基质细胞所在的。形成物理屏障的肠上皮细胞通过不同的蛋白质复合物连接在一起，包括粘附连接 （AJ）、紧密连接 （TJ） 和桥粒 （DM）。上皮屏障功能的损害增强了肠道通透性，并允许有害物质和病原体从管腔转移到间质¹。上皮屏障受损的疾病越来越多，例如克罗恩病 （CD）、溃疡性结肠炎 （UC） 和不确定结肠炎 （IC） 等炎症性肠病 （IBD）。IBD 的发病率在世界范围内呈上升趋势，西方的患病率接近 0.5%。虽然 IBD 的原因尚不清楚，但在肠壁中触发的过度免疫/炎症反应通过限制肠上皮稳态的重建直接导致上皮屏障破坏 ^2,3,4。此外，长期结肠炎症患者患结直肠癌 （^{CRC） 的风险}很高5。与肠上皮屏障破坏相关的其他病理是肠易激综合征、肥胖、乳糜泻、非乳糜泻麸质敏感性和食物过敏⁶。由于这些原因，迫切需要开发实验方法，以便在模拟人类发病机制的动物模型中分析肠上皮屏障的完整性。

在这里，我们使用一种简单的技术评估了胃肠道被动细胞旁和与结肠上皮炎症过程相关的跨细胞通透性。为了研究大分子的透壁流动，我们测量了 FITC-葡聚糖 （4 kDa） 和 RITC-葡聚糖 （10 kDa） 在 离体结肠囊中的被动扩散。此外，通过将荧光 10 kDa 赖氨酸固定葡聚糖注射到肠囊腔中，我们特异性地确定了发炎粘膜中具有高通透性的区域。使用针对 AJ 蛋白的细胞凋亡标志物和抗体使我们能够证明发炎粘膜中的高渗透性区域对应于上皮细胞凋亡和细胞间连接被破坏的特定区域。这种新技术可用于评估肠上皮屏障受损的任何模型中上皮的完整性。

Protocol

所有程序均由 CINVESTAV 实验动物护理和使用机构委员会 （CICUAL） 审查和批准。

1. 材料和试剂的准备

1. 将 Hartmann 溶液（130 mM NaCl、28 mM 乳酸盐、4 mM KCl、1.5 mM CaCl₂）预热至 37 °C，同时用 95% O₂/5% CO₂ 鼓泡。保持溶液的生理 pH 值 （7.4）。
2. 为了分析被动细胞旁通透性，通过将 1 mg/mL 的 FITC-葡聚糖 （4 kDa） 和 1 mg/mL 的 RITC-葡聚糖 （10 kDa） 溶解在预热的 Hartmann 溶液中来制备工作溶液。
3. 在 Hartmann 溶液中制备 4 μg/mL 的 Alexa Fluor647 Fixable-Dextran （10 kDa） 溶液。将工作溶液储存在 15 mL 锥形管中，使用前避光。
   注意:每个结肠需要 300 μL 的工作溶液。
4. 通过为每个大肠切下两个 5 厘米的切片来准备手术缝合。将缝合线绕成一个未闭合的结。

2. 胃肠道小路的解剖和制备

1. 在对小鼠实施安乐死之前，将固体食物保留 6 小时。随意提供饮用水。
   注意:如果可能，将小鼠置于营养凝胶补充剂（纯净水、糖蜜、南瓜、玉米糖浆、葵花籽、小麦蛋白、植物油、食物酸、亲水胶体、电解质、玉米纤维、NIH-31M 矿物质混合物、NIH-31M 维生素混合物）。
2. 在 CO₂ 室中对小鼠实施安乐死，然后根据机构伦理协议进行颈椎脱位。
3. 用 70% 乙醇对腹部和胸部消毒。
4. 用一把剪刀在腹部中间切开一个，露出腹膜腔。
5. 出于定向目的，通过在盲肠之前的小肠末端（回肠的末端部分）切开，然后在肛缘处切开大肠。使用手术钳轻轻取出肠系膜，并将结肠置于 Hartmann 溶液中。
6. 重要的是，为了保持动物之间的一致性，确定相似的部分并用于评估渗透性。强烈建议使用靠近盲肠的区域。
7. 使用配备有钝塑料套管的胰岛素注射器轻轻冲洗结肠中的管腔内容物。如果大便很硬，请用钝钳小心推动。去除粪便后，用 400 μL Hartmann 溶液洗涤 3 次。
8. 系好近端区域（最靠近盲肠的区域）并在结肠远端区域放置一个预先系好的缝合环。在装有钝塑料套管的注射器的帮助下，用含有欲望探针的溶液填充肠囊。小心地取下塑料套管，并在远端区域系上环。
9. 将肠囊放入装有 6 mL Hartmann 溶液的 15 mL 锥形管中，孵育 1 小时以评估 FITC/RITC-葡聚糖的被动细胞旁流，或 30 分钟以分析 Alexa Fluor Fixable-葡聚糖的流速。
   1. 将含有肠囊的锥形管保持在 37 °C 和 5% CO₂ 并避光。
10. 使用 FITC/RITC-葡聚糖测量被动渗透性。在 0 分钟和 60 分钟时，从锥形管中取出 100 μL 样品并转移至 96 孔板中。加回 100 μL 新鲜培养基以补充损失的体积。
11. 在荧光酶标仪上测量样品和 FITC/RITC 标准品（FITC 激发/发射:495 nm/519 nm;RITC 激发/发射:570/595 nm）。
12. 要使用 Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran 测量被动通透性，请取出肠道，靠近手术打结切开，然后切开肠道以露出管腔，用探针去除溶液。用冷的 Hartmann 溶液清洗肠腔 2 次。
13. 将组织放入先前填充有最佳切割温度化合物 （O.C.T.） 的组织模具中。根据要切片的一侧垂直或水平调整组织的方向。将样品储存在 -80 °C。

3. 免疫荧光染色

1. 在室温下用 3.7% 多聚甲醛 （PFA） 固定 20 微米的冷冻切片 20 分钟，然后用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS;37 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 1.8 mM KH₂ PO₄）洗涤 3 次。
   注意:如果洗涤非常强烈，肠道的垂直切片往往会脱落。
2. 在室温下用 0.2% TX-100/PBS 透化 12 分钟，然后用冷 PBS 洗涤 3 次。
3. 在室温下用 0.2% BSA/PBS 封闭 1 小时。
4. 在封闭溶液中稀释一抗，并在室温下孵育 1 小时。用冷 PBS 洗涤 3 次。
5. 在封闭溶液中与二抗孵育 1 小时。用冷 PBS 洗涤 3 次。
6. 将封固剂涂在切口上并用盖玻片密封。载玻片可在 -20 °C 下储存长达 3 个月。

Results

在发炎的粘膜中，浅表糜烂或微糜烂会损害上皮细胞单层的完整性，并代表高渗透性位点 ^7,8。为了评估这种可能性，我们分析了葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型中发炎结肠粘膜的被动通透性。简而言之，在 5 天内，C57BL/6J 小鼠接受溶于饮用水中的 2.5% DSS （w/v， 40-50 kDa）。该模型的特征是在大肠中诱导上皮细胞损伤和上皮屏障功能障碍，进而允许管腔抗原进入固有层。这样的过程导致免疫系统的刺激，导致促炎细胞因子和趋化因子的分泌，从而进一步增强上皮损伤⁹。如图 1A 所示，暴露于 DSS 的小鼠在治疗 5 天后体重减轻了 ~12%。在所有 DSS 处理的小鼠中也检测到粪血和腹泻。此外，结肠炎小鼠的结肠长度减少，具有统计学意义（图 1B）。因此，在 DSS 治疗 5 天后，包括动物体重减轻、粪便稠度、腹泻、潜血和肉眼直肠出血在内的疾病活动指数 （DAI...

Discussion

由平衡细胞增殖和上皮细胞凋亡引起的上皮稳态维持了适当且功能性的肠道屏障。许多临床疾病，如 IBD，伴有或以肠道通透性改变、粘膜炎症和上皮稳态破坏为特征¹。这些过程之间的相互作用仍然存在很大争议。因此，开发新的研究方法来正确研究这些过程是该领域的一个重要课题。有几种已发表的方案可用于间接研究炎症期间的肠道通透性，例如测量上皮单层中的跨上皮电阻和定量肠道类器官、小鼠肠道和肠囊中的疏水荧光团标记探针 10,11,12,13.尽管证明某种物质的摄取在肠粘膜中增加或减少，但这些方法在分析直接导致通透性变化的其他重要事件方面存在不足。例如，由于未能确定上皮完整性受损的特定区域，这些研究限制了对负责影响肠道通透性的运输机制或生物学功能的理解。此外，鉴于肠道通透性可能因地区而异，这些研...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
活性 Caspase-3 抗体 （1：1000）	细胞信号传导	9664	裂解的 caspase-3 （Asp175）（5AE1） 兔单克隆抗体
Alexa Fluor 488  抗兔 （1：1000）	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 抗大鼠 （1：1000）	Invitrogen	A21209
共聚焦显微镜 （Leica TCS SP8x）	Leica		HyD 探测器和白光激光器
E-钙粘蛋白抗体 （1：750）	Sigma	MABT26	大鼠单克隆 Delma-1 抗体
乙醇 70%	通用
可固定右旋糖聚糖	Invitrogen	D22914	葡聚糖，Alexa Fluor，10,000 MW，阴离子，可固定
FITC 葡聚糖	Sigma	46944	异硫氰酸荧光素–右旋糖酐 M. Wt. 4 kDa
Hartmann 溶液	PiSA	HT PiSA
培养箱 （AutoFlow NU-8500）	Nuaire
酶标仪 （Tecan Infinite 200 PRO）	Tecan
Nunc F96 微孔黑白聚苯乙烯板	ThermoFisher Scientific
多聚甲醛	Sigma	P6148
鬼笔环肽 （1：1000）	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 鬼笔环肽
RITC 葡聚糖	Sigma	R8881-100MG	罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖。分子量 10 kDa
二抗 （1：10000）	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP 偶联二抗 缝
合线	通用		编织丝和编织聚酯手术缝合是首选。
ZO-1 （1：1000）	Invitrogen	40-2200	Rb 抗 ZO-1