利用免疫荧光染色评估和量化结肠黏膜中的微上皮间隙

摘要

本文介绍一种新方法，用于可视化显示炎症结肠黏膜中跨细胞和旁细胞通透性增强的具体位置。在本实验中，我们使用一种与可固定赖氨酸葡聚糖偶联的10 kDa荧光染料，以显示结肠黏膜中的高通透性区域（HPR）。

摘要

排列在肠黏膜上的上皮细胞形成一道物理屏障，将管腔内容物与间质分隔开来。上皮屏障功能受损与多种病理状态的发生有关，例如炎症性肠病（IBD）。在炎症性黏膜中，破坏上皮单层的表浅糜烂或微糜烂区域对应于高通透性位点。多种机制被认为参与了微糜烂的形成，包括细胞脱落和细胞凋亡。这些微糜烂通常表现为在结肠中随机分布的显微镜下上皮间隙。对这些上皮间隙进行可视化和定量分析，已成为研究肠道上皮屏障功能的重要工具。本文介绍一种新方法，用于可视化炎症性结肠黏膜中跨细胞和旁细胞通透性增强的具体位置。在本检测中，我们使用一种与可固定赖氨酸偶联的10 kDa荧光标记葡聚糖染料，以显示结肠黏膜中的高通透性区域（HPR）。结合使用细胞死亡标志物进一步发现，HPR 包含发生上皮细胞挤压/脱落的凋亡灶。本文所述方案提供了一种简单而有效的方法，用于对肠道中的微糜烂进行可视化和定量分析，这对于肠道上皮屏障受损的疾病模型研究具有重要价值。

引言

胃肠道（GI）黏膜形成一道物理屏障，将细胞外环境与机体内部环境分隔开来，并参与营养物质、水分和电解质的吸收。肠屏障包括由糖蛋白构成的黏液层、单层上皮细胞以及其下方含有免疫细胞和基质细胞的固有层。构成物理屏障的肠上皮细胞通过多种蛋白质复合物相互连接，包括黏附连接（AJ）、紧密连接（TJ）和桥粒（DMs）。上皮屏障功能受损会增加肠道通透性，导致有害物质和病原体从肠腔易位至间质¹。目前已有越来越多的疾病被发现与上皮屏障功能障碍相关，例如炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病（CD）、溃疡性结肠炎（UC）和未定型结肠炎（IC）。IBD 的发病率在全球范围内呈上升趋势，在西方国家的患病率已接近 0.5%。尽管 IBD 的病因尚不明确，但肠道壁内异常激活的免疫/炎症反应会阻碍肠上皮稳态的重建，从而直接导致上皮屏障破坏^2,3,4。此外，长期患有结肠炎症的患者发生结直肠癌（CRC）的风险较高⁵。其他与肠上皮屏障破坏相关的病理状态还包括肠易激综合征、肥胖、乳糜泻、非乳糜泻性麸质敏感以及食物过敏⁶。因此，迫切需要建立实验方法，以在模拟人类疾病发生过程的动物模型中分析肠上皮屏障的完整性。

方案

所有实验程序均经CINVESTAV实验动物护理与使用机构委员会（CICUAL）审查并批准。

1. 材料与试剂的准备

1. 将哈特曼溶液（130 mM NaCl、28 mM 乳酸盐、4 mM KCl、1.5 mM CaCl₂）预热至 37 °C，同时用 95% O₂/5% CO₂ 混合气体持续通气。保持溶液的生理 pH 值（7.4）。
2. 为分析被动旁细胞通透性，将 1 mg/mL 的 FITC-葡聚糖（4 kDa）和 1 mg/mL 的 RITC-葡聚糖（10 kDa）溶解于预热的哈特曼溶液中，配制工作液。
3. 将 Alexa Fluor647 可固定葡聚糖（10 kDa）以 4 µg/mL 的浓度溶于哈特曼溶液中。将工作液储存于 15 mL 圆锥形离心管中，避光保存直至使用。
   注意：每段结肠需要 300 µL 工作液。
4. 准备手术缝线，为每段大肠剪取两段 5 cm 长的缝线。将缝线打成未闭合的环形结。

2. 消化道的解剖与制备

1. 在处死小鼠前 6 小时停止提供固体食物，但可自由饮水。
   注：如果可能，将小鼠置于营养凝胶补充剂中（纯化水、糖蜜、南瓜、玉米糖浆、葵花籽、小麦蛋白、植物油、食品酸、亲水胶体、电解质、玉米纤维、NIH-....

结果

在炎症黏膜中，表浅糜烂或微糜烂破坏了上皮细胞单层的完整性，并形成高通透性区域^7,8。为了评估此类情况，我们分析了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导结肠炎小鼠模型中炎症结肠黏膜的被动通透性。简言之，C57BL/6J小鼠连续5天饮用含有2.5%（w/v，40–50 kDa）DSS的水。该模型的特点是引起大肠上皮细胞损伤和上皮屏障功能障碍，从而允许管腔内抗原进入固有层。这一过程会激活免疫系统，导致促炎性细胞因子和趋化因子的分泌，进一步加剧上皮损伤⁹。如图1A所示，经DSS处理的小鼠在5天后体重下降约12%。所有DSS处理的小鼠均出现粪便隐血和腹泻。此外，结肠炎小鼠的结肠长度显著缩短，差异具有统计学意义（图1B）。因此，疾病活动指数（DAI）——包括动物体重下降、粪便性状、腹泻、隐血及肉眼可见直肠出血——在DSS处理5天后显著升高（

讨论

通过平衡细胞增殖与上皮细胞凋亡所维持的上皮稳态，对于形成正常且功能完整的肠道屏障至关重要。许多临床疾病，如炎症性肠病（IBD），常伴随或表现为肠道通透性改变、黏膜炎症以及上皮稳态的破坏¹。这些过程之间的相互作用目前仍存在很大争议。因此，开发新的研究方法以准确探究这些过程，是该领域的重要课题。目前已发表多种用于间接研究炎症期间肠道通透性的实验方案，例如通过上皮单层细胞测量跨上皮电阻，或在肠道类器官、小鼠肠道及肠囊中定量疏水性荧光标记探针的摄取量^10,11,12,13。尽管这些方法能够表明某种物质在肠道黏膜中的吸收增加或减少，但在分析其他直接影响通透性变化的重要事件方面仍存在不足。例如，由于无法识别上皮完整性受损的具体区域，这些研究限制了对物质转运机制或影响肠道通透性的生物学功能的理解。此外，鉴于肠道通透性在不同区域可能存在显著差异，此类研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活性 Caspase-3 抗体（1:1000）	Cell signaling	9664	Cleaved caspase-3 (Asp175)(5AE1) Rabbit mAb
Alexa Fluor 488  抗兔抗体（1:1000）	Invitrogen	A21206
Alexa Fluor 594 抗大鼠抗体（1:1000）	Invitrogen	A21209
共聚焦显微镜（Leica TCS SP8x）	Leica		HyD 检测器  和白光激光器
E-钙黏蛋白抗体（1:750）	Sigma	MABT26	大鼠单克隆 Delma-1 抗体
70% 乙醇	通用
可固定葡聚糖	Invitrogen	D22914	葡聚糖，Alexa Fluor 标记，分子量 10,000，阴离子型，可固定
FITC 葡聚糖	Sigma	46944	异硫氰酸荧光素–葡聚糖，分子量 4 kDa
哈特曼溶液	PiSA	HT PiSA
培养箱（AutoFlow NU-8500）	Nuaire
酶标仪（Tecan Infinite 200 PRO）	Tecan
Nunc F96 微孔板，黑色与白色聚苯乙烯板	ThermoFisher Scientific
多聚甲醛	Sigma	P6148
鬼笔环肽（1:1000）	Invitrogen	A12380	Alexa Fluor 568 标记鬼笔环肽
RITC 葡聚糖	Sigma	R8881-100MG	罗丹明 B 异硫氰酸酯-葡聚糖，分子量 10 kDa
二抗（1:10000）	Jackson ImmunoResearch Laboratories		HRP 标记二抗
缝合线	通用		推荐使用编织丝线和编织聚酯外科缝合线。
ZO-1 抗体（1:1000）	Invitrogen	40-2200	兔抗 ZO-1 抗体