本文介绍了一种从患者外周血单个核细胞稳健地生成并扩增人心肌细胞的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
通过单次抽血获取患者特异性心肌细胞在心血管疾病精准医疗领域引起了广泛关注。人类诱导性多能干细胞（iPSCs）向心肌细胞的分化过程受到若干明确信号通路的调控，这些通路在胚胎心脏发育中起关键作用。目前已有多种在二维和三维平台上进行心肌分化的技术，其效率和心肌细胞产量各不相同。由于方法种类繁多，领域外的研究人员往往难以选择和掌握。本文提供了一套完整的实验方案，详细阐述了如何从外周血单个核细胞（PBMCs）高效生成并扩增患者特异性心肌细胞。我们首先介绍一种利用非整合型仙台病毒载体从患者血液样本高效重编程为iPSC的方案。随后详述一种基于小分子的单层分化方法，该方法可稳定地将大多数人iPSC系分化为能够搏动的心肌细胞。此外，还引入了一种可放大的心肌细胞扩增方案，使用小分子CHIR99021可快速扩增患者来源的心肌细胞，适用于工业级和临床级应用。最后，详细描述了对这些iPSC来源心肌细胞（iPSC-CMs）进行分子鉴定和电生理特性表征的实验流程。本方案力求实用，即使对心血管发育和干细胞生物学知识有限的新手研究人员也能顺利操作。
引言
人类诱导性多能干细胞的发现彻底改变了现代心血管医学1,2。人iPSC具有自我更新能力，并可分化为心脏中的所有细胞类型，包括心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和心脏成纤维细胞。来源于患者的iPSC心肌细胞（iPSC-CMs）可作为无限的资源，用于构建遗传性心血管疾病（CVDs）模型以及新药的心脏安全性测试3。特别是，患者来源的iPSC-CMs非常适合研究源于心肌细胞缺陷的遗传性和分子病因，例如长QT综合征4和扩张型心肌病（DCM）5。结合CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，患者iPSC-CMs为理解包括先天性心脏病（CHDs）在内的复杂遗传性心血管疾病的遗传基础开辟了前所未有的途径6,7,8。人iPSC-CMs还展现出作为自体细胞来源用于补充心肌梗死期间受损心肌的潜力9。近年来，生成具有明确亚型（心房、心室和结状）的高质量人iPSC-CMs，已成为心脏再生和药物测试中的关键任务10。
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方案
本研究中涉及人类受试者的实验方案和知情同意书已获得全美儿童医院机构审查委员会（IRB）的批准。
1. 细胞培养基、溶液和试剂的准备
- 准备外周血单个核细胞（PBMC）培养基
- 将20 mL基础PBMC培养基（1x）与0.52 mL补充剂混合。加入干细胞因子（SCF）和FLT3各20 μL（储存浓度：100 μg/mL），白细胞介素-3（IL3）、白细胞介素-6（IL6）和促红细胞生成素（EPO）各4 μL（储存浓度：100 μg/mL），以及200 μL L-谷氨酰胺替代物（100x）。充分混匀。在无菌操作台中使用0.22-μm滤器过滤。将此培养基命名为完全血液培养基（Complete Blood Media）。
- 将20 mL基础PBMC培养基（1x）与0.52 mL补充剂混合。加入200 μL L-谷氨酰胺替代物（100x）。充分混匀。使用0.22-μm滤器过滤。将此培养基命名为补充血液培养基（Supplement Blood Media）。
- 制备完全E8培养基
- 将500 mL E8基础培养基与10 mL E8补充剂（于4 °C过夜解冻）混合，配制成完全E8培养基。使用前平衡至室温（RT）。
- 制备诱导多能干细胞（iPSC）传代培养基
- 将40 μL Y-27632 RO....
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结果
由外周血单个核细胞诱导人iPSC重编程
在外周血完全培养基中预培养7天后，外周血单个核细胞（PBMCs）体积增大，细胞核与细胞质清晰可见（图1B），表明其已适合进行病毒转染。使用仙台病毒重编程因子转染后，PBMCs将再经历约一周的表观遗传重编程过程。通常情况下，每转染1 × 105个PBMCs可获得30–50个iPSC克隆，重编程效率为0.03%–0.05%。当完全重编程的细胞被转移至完全E8培养基时，它们会贴壁并开始形成克隆（图1C）。这些早期iPSC克隆再扩增培养7天后，通过机械法逐个切割并挑取。每个iPSC克隆被转移至6孔板中的一个孔，以建立独立的iPSC细胞系。经过4–5次传代后，iPSC克隆趋于纯化，周围仅有极少量分化细胞（图1D）。在此阶段，大多数iPSC克隆中的细胞均表达OCT4和NANOG（
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讨论
在诱导多能干细胞（iPSC）重编程过程中，外周血单个核细胞（PBMCs）需培养1周，直至细胞体积增大，核与细胞质清晰可见。由于PBMCs本身不增殖，因此用于病毒转导的细胞数量对于iPSC重编程的成功至关重要。应综合考虑并调整PBMCs的细胞数量、感染复数（MOI）以及病毒滴度，以达到最佳的转导效果。在心肌分化过程中，初始接种密度对iPSCs在给予CHIR99021当天达到90%以上汇合度尤为关键。一方面，若在心肌分化时iPSCs汇合度不足，CHIR99021将产生毒性，导致大量细胞死亡；另一方面，若iPSCs过度汇合，则会发生自发性分化，从而降低定向心肌分化的效率。在早期iPSC来源的心肌细胞（iPSC-CMs）扩增过程中，需考虑操作时机和心肌细胞质量。仅当心肌细胞纯度足够高时，早期iPSC-CMs才能有效增殖。培养物中残留的非心肌细胞也可能在CHIR99021处理下增殖，从而对早期iPSC-CMs的扩增产生负面影响。此外，必须在分化第20天左右启动心肌细胞的扩增刺激。一旦iPSC-CMs超过分化第30天，其重新进入旺盛分裂的能力将显著下降。
人类iPSC最初通过逆转录病毒介导的转.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本研究由美国心脏协会（AHA）职业发展奖 18CDA34110293（M-T.Z.）、Additional Ventures AVIF 和 SVRF 奖项（M-T.Z.）、美国国立卫生研究院（NIH/NHLBI）资助项目 1R01HL124245、1R01HL132520 和 R01HL096962（I.D.）提供支持。Ming-Tao Zhao 博士还获得了全美儿童医院阿比盖尔·韦克斯纳研究所启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 Fast 实时荧光定量 PCR 系统 | 赛默飞世尔科技 | ||
| Axon Axopatch 200B 微电极放大器 | Molecular Devices | 微电极放大器 | |
| B27添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| B27 补充剂（不含胰岛素） | 赛默飞世尔科技 | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜试剂盒 | BD 生物科学 | 554714 | 固定/透化液，透化/洗涤缓冲液 |
| BD Vacutainer CPT 管 | BD 生物科学 | 362753 | 血细胞分离管 |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A16517 | 仙台病毒重编程试剂盒 |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | 采集板 | |
| Direct-zol RNA Miniprep 试剂盒 | Zymo Research | R2050 | RNA提取试剂盒 |
| DMEM/F12 | 赛默飞世尔科技 | 11330057 | |
| Essential 8 培养基 | 赛默飞世尔科技 | A1517001 | 用于iPSC培养的E8培养基 |
| GlutaMAX 补充剂 | 赛默飞世尔科技 | 35050061 | L-谷氨酰胺替代物 |
| 生长因子减少型基质胶 | 康宁 | 356231 | 基底膜基质 |
| iScript cDNA合成试剂盒 | 伯乐（Bio-Rad） | 1708891 | cDNA合成 |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut血清替代物（KSR） | 赛默飞世尔科技 | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | 电生理数据采集 &和分析软件 | |
| 重组人EPO | 赛默飞世尔科技 | PHC9631 | |
| 重组人 FLT3 | 赛默飞世尔科技 | PHC9414 | |
| 重组人IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| 重组人IL6 | 赛默飞世尔科技 | PHC0065 | |
| 重组人 SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11875093 | |
| RPMI 1640 培养基，无葡萄糖 | 赛默飞世尔科技 | 11879020 | |
| SlowFade Gold 抗荧光淬灭封片剂 | 赛默飞世尔科技 | S36936 | 封片剂 |
| StemPro-34 SFM | 赛默飞世尔科技 | 10639011 | PBMC 培养基 |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | 赛默飞世尔科技 | 4444964 | qPCR预混液 |
| TrypLE Select 酶 10 倍浓度，无酚红 | 赛默飞世尔科技 | A1217703 | CM解离溶液 |
| UltraPure 0.5 M EDTA | 赛默飞世尔科技 | 15575020 | iPSC 解离液 |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
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