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方法文章

猪诱导性多能干细胞（piPSCs）向神经前体细胞（NPCs）的分化

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DOI：

10.3791/62209

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2021年6月11日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of São Paulo, 2Department of Veterinary Medicine, Faculty of Animal Sciences and Food Engineering, University of São Paulo, 3Department of Pharmacology, Institute of Biosciences, São Paulo State University

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于化学诱导分化及培养源自猪诱导性多能干细胞（piPSCs）的神经前体细胞的方法。

摘要

由iPSC衍生的神经元具有吸引力 体外 用于研究神经发生及精神疾病早期表型变化的模型，尤其是在临床前研究中常用的啮齿类动物模型往往无法满足将研究结果转化为临床应用的标准时，显得尤为重要。非人灵长类、犬类和猪模型由于在生理学、遗传学和解剖学上与人类具有较高的相似性，被认为更适用于生物医学研究和药物开发。其中，猪模型在转化神经科学研究中日益受到关注，可用于安全性评估和异体移植测试。本文描述了猪诱导多能干细胞（iPSCs）的建立及其向神经前体细胞（NPCs）的进一步分化。所获得的细胞表达了NPC标志物 Nestin 和 GFAP，经RT-qPCR验证，并通过免疫荧光检测显示Nestin、β-Tubulin III和Vimentin呈阳性。这些结果表明，经过 体外 使用大型动物模型进行化学抑制剂诱导，这是一种用于再生医学与转化医学研究的有趣且充分的模型。

引言

尽管许多研究人员致力于更深入地理解人类神经系统疾病的细胞机制和病理发展过程，但在人类身上使用非侵入性技术（如磁共振成像，MRI）存在诸多限制，且大多数情况下无法应用示踪追踪和细胞内记录等侵入性技术1。此外，获取高质量的死后人脑组织也具有挑战性，因为供体较长的濒死状态可能影响脑组织，从而干扰研究结果2。因此，动物模型成为必要选择，数十年来已被广泛应用于转化医学研究，其相关性和可靠性至今仍兼具重要价值与争议。在当前的实验设计与规划中，选择合适的动物模型正成为一个核心问题，这表明：为了获得一致可靠的研究结果，研究者不仅需要深入了解不同物种的生理特征，更重要的是必须明确研究的具体目标3。

然而，动物模型在模拟人类大脑结构和发育时常常存在局限性，因为人类大脑具有一些独特的发展、解剖、分子和遗传特征。因此，对研究中使用的动物（如啮齿类动物）所获得的数据进行解释和外推具有一定的难度1。

在当今可用的多种动物模型中，包括转基因模型，某些大型动物被认为具有很高的价值，例如非人灵长类动物、犬类和猪4。人类与猪在器官大小方面的生理学、遗传学和解剖学相似性，凸显了这些模型在开发诊断和治疗策略中的重要意义。尤其是猪模型，在转化神经科学领域引起了特别关注，可用于安全性评估和异体移植测试。该模型已广泛应用于心血管、肺部、胃肠道疾病的相关研究，尤其适用于新疗法的测试（例如，利用干细胞进行再生医学研究5, 6）。

在此背景下，体外模型，特别是由诱导性多能干细胞（iPSCs）衍生的神经元，是研究神经发生及精神疾病早期表型变化的理想模型，尤其是在临床前研究中常用的动物模型（如啮齿类动物）大多无法满足将研究结果转化为临床应用标准的情况下。

诱导多能干细胞的使用通过实现疾病建模，极大地推动了神经科学的发展 体外，特别是使用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经前体细胞（NPC），因为NPC已被证明是研究神经发育和疾病机制的有力工具 体外 疾病建模7,8,9. 已成功从阿尔茨海默病患者中生成诱导多能干细胞10，精神分裂症11以及由 Mungenast 及其合作者汇编的帕金森病、Rett 综合征、脊髓性肌萎缩症、唐氏综合征和肌萎缩侧索硬化症等多种其他疾病2已有报道称，使用iPSC衍生的NPC作为功能性脊柱移植物的临床前动物模型系统，检测到极小或无免疫反应。12,13,14.

本文描述了猪诱导性多能干细胞（iPSCs）的建立及其进一步通过化学诱导分化为拟似神经前体细胞的过程（图1 和 图2）。所获得的细胞表达神经前体细胞标志物 Nestin 和 GFAP，经RT-qPCR证实，并通过免疫荧光检测显示Nestin、β-Tubulin III和Vimentin呈阳性。这些结果表明，利用化学抑制剂在大型动物模型中体外诱导生成了类似神经前体细胞的细胞，该模型是再生医学与转化医学研究中重要且合适的模型。

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方案

这些实验已获得圣保罗大学动物科学与食品工程学院动物实验伦理委员会的批准（许可编号：n° 5130110517 和 n°4134290716）。

注意：所有涉及细胞培养和孵育的操作均在受控环境（38.5 °C，空气中含 20% CO2，最大湿度）中进行。细胞传代通过使用解离试剂孵育 5 分钟完成，随后经离心（300 × g）回收细胞。

1. 将猪成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞

  1. 实验准备
    1. 准备成纤维细胞和293细胞培养基，成分为Iscove改良的DMEM培养基（IMDM），添加10%胎牛血清（FBS）、0.1 mM非必需氨基酸和1%抗生素（青霉素/链霉素），除非另有说明。
    2. 准备iPSC培养基（重编程培养基），成分为低渗透压DMEM/F12（适用于人胚胎干细胞和诱导多能干细胞的生长），添加20%血清替代物、0.1 mM非必需氨基酸、1 mM谷氨酰胺、3.85 µM β-巯基乙醇、10 ng/mL bFGF和1%抗生素。
    3. 如需使用，将小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种至T75培养瓶（10 mL），使次日达到70–80%融合度（约每T75培养瓶6 × 105个细胞）。次日，加入200 µL浓度为0.5 mg/mL的丝裂霉素C孵育2小时30分钟以灭活细胞（无需更换培养基，直接将丝裂霉素加入含MEFs的T75培养瓶中）。
    4. 孵育结束后，用消化液处理5分钟以回收细胞，并将细胞接种至预先用明胶包被的6孔板中，接种浓度为1 × 105个细胞/孔。
    5. 通过在37 °C下用0.1%明胶溶液孵育20分钟对孔板进行包被（每孔约1 mL明胶溶液，确保完全覆盖孔底），随后立即吸除溶液。然后去除残留液体，并加入培养基（每孔2 mL）。
  2. 转染与慢病毒生产
    1. 将293细胞在T75培养瓶中培养至约90%融合度。
    2. 消化细胞后，将5 × 106个细胞接种至新的T75培养瓶中，不添加抗生素。
    3. 次日，为每个T75培养瓶准备两份转染溶液：1：1.5 mL IMDM（不含抗生素和血清），加入各载体的适当浓度（OSKM 12 µg；TAT 1.2 µg；REV 1.2 µg；hgpm2 1.2 µg；VSVG2°generation, 2.4 µg）；2：1.5 mL IMDM（不含抗生素和血清）加36 µL脂质体转染试剂（或按制造商推荐用量）15。
    4. 混合两种溶液，室温孵育15分钟。
    5. 同时，更换293细胞的培养基，每瓶仅加入含10% FBS的IMDM 7 mL。
    6. 孵育结束后，向每瓶中加入3 mL脂质体转染试剂与质粒的混合液。6小时后更换为含10% FBS的IMDM（可选）。
    7. 在24、48和72小时时间点收集培养基（完全体积——每T75培养瓶10 mL）。用0.45 mm PVDF滤器过滤，并称重以平衡超速离心机。
    8. 在48,960 × g条件下离心1小时30分钟。
    9. 倾去上清液，将残留液体（约200 µL）在4 °C孵育1小时。
    10. 用移液器轻柔吹打数次，重悬病毒沉淀，并分装病毒溶液。
  3. 转导
    1. 将2 × 104个成纤维细胞接种至6孔板的每孔中。可设置用于分子分析（如PCR）和转导对照（如GFP分析）的孔（可选）。
    2. 次日，移除1 mL培养基，加入1 µL聚凝胺（8 µg/mL）和50 µL病毒溶液。
    3. 孵育3至4小时，随后完全更换培养基（2 mL）（第0天）。
    4. 继续培养细胞5天，每2天更换一次培养基。
    5. 提前按照第1.1.3条所述方法准备0.1%明胶包被并铺有MEFs的培养板。
    6. 为消化并重接种细胞至重编程培养基中，先用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤孔板，随后吸除PBS。
    7. 每孔加入1 mL消化试剂，37 °C孵育5分钟。
    8. 将细胞转移至锥形管中，在300 × g条件下离心5分钟，然后重悬于1–3 mL iPSC培养基中。
    9. 使用血球计数板或细胞计数仪计数细胞，并以1–2 × 104个细胞/孔的密度接种至预先用0.1%明胶包被并覆盖MEFs的孔中。
    10. 每2天更换一次iPSC培养基。
    11. iPSC克隆（第0代，P0）将在重编程过程约10天后出现。使用26 G针头手动挑选形态典型的克隆（边缘圆整、细胞核质比高），分离克隆及其周围的MEFs。
    12. 使用10或100 µL移液器吸头，将每个克隆单独转移至新孔中，用于克隆化培养及潜在iPSC细胞系的鉴定。
  4. 猪iPSC传代
    1. 手动传代与克隆挑选
      1. 清洁倒置显微镜并将其转移至超净工作台内。
      2. 用紫外线（UV）照射显微镜15分钟进行灭菌。
      3. 在转移克隆前，用PBS洗涤预先包被明胶并铺有MEFs的孔板，随后吸除PBS。
      4. 每孔加入2 mL iPSC培养基。
      5. 在目标孔中定位待转移的克隆。
      6. 使用胰岛素注射针头的斜面，将克隆与周围细胞分离。
      7. 若克隆较小，可用10 µL移液器在其边缘反复吹打，使克隆脱离孔底。
      8. 若为较大克隆，可用针头将其切割为若干小片段。
      9. 用10 µL移液器吸取克隆或其片段。
      10. 将其转移至新孔中。
    2. 克隆系的酶法传代
      1. 用PBS洗涤孔板，吸除PBS。
      2. 每孔加入1 mL消化试剂，37 °C孵育5分钟。
      3. 将约100 µL细胞悬液转移至新孔中。此接种量可能因不同细胞系而异，因此强烈建议每日进行融合度的视觉评估。

2. 猪iPSCs向NPCs的诱导

  1. 实验准备
    1. 配制神经诱导培养基（NIM），其成分为50% Neurobasal培养基和50% DMEM/F-12，添加B27-不含维生素A（20 µL/mL）、N2（10 µL/mL）、1 mM谷氨酰胺（10 µL/mL）、青霉素-链霉素（1 µL/mL）。使用0.22 µm滤器过滤溶液，并加入BMP信号抑制剂LDN193189和ALK抑制剂SB431542，使其终浓度分别为0.1 µM和10 µM。
    2. 用1 mL基质溶液包被6孔板的孔，37 °C孵育至少30分钟。去除基质溶液，加入用于iPSC培养的E8培养基。
    3. 在诱导程序的第13天，配制神经扩增培养基（NEM），其成分为50% Neurobasal培养基和50% DMEM/F-12，添加B27-不含维生素A（20 µL/mL）、N2（10 µL/mL）、NEAA（10 µL/mL）、1 mM谷氨酰胺（10 µL/mL）、青霉素-链霉素（1 µL/mL）。使用0.22 µm滤器过滤溶液，并加入FGF2和EGF，使其终浓度为10 ng/mL。
  2. 诱导程序
    1. 在iPSC达到100%融合度的前一天，将细胞以1:1比例传代至新孔中。加入1 mL PBS洗涤孔，随后去除PBS。
    2. 加入1 mL 0.5 mM EDTA，37 °C孵育5分钟。
    3. 去除EDTA，加入1 mL E8培养基。
    4. 轻柔地将细胞从孔中洗下，并将内容物转移至先前已用基质溶液包被的新孔中。
    5. 次日，用PBS洗涤孔，去除PBS后每孔加入2 mL NIM。
    6. 每24小时更换一次诱导培养基，持续14天。
    7. 第14天，用PBS洗涤孔，去除PBS。
    8. 每孔加入1 mL细胞解离试剂，37 °C孵育5分钟。
    9. 将细胞转移至锥形管中，在300 × g条件下离心5分钟，然后重悬于6 mL NEM培养基中。
    10. 每毫升加入60 µL（10 µL/mL）冻存后复苏溶液，将2 mL该溶液转移至每个包被有基质的孔中。
    11. 次日更换NEM培养基，之后每两天更换一次。
      ​注意：每个经过诱导程序的孔被视为产生一个新的NPC细胞系。因此，各自的细胞不应混合。

3. NPC 传代

  1. 用 1 mL PBS 充分洗涤。移除 PBS。
  2. 加入 1 mL 细胞解离试剂，将细胞在 37 °C 下孵育 5 分钟。
  3. 轻柔吹洗孔中细胞，并将内容物转移至锥形管中。
  4. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，加入 6 mL NEM。
  5. 轻柔匀浆沉淀，取 2 mL 溶液转移至先前已包被基质溶液的新孔中。

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结果

piPSC的表征
表征旨在确定重编程细胞是否获得多能性。为此，进行了拟胚体形成、多能性标志物的免疫荧光染色，以及基因表达分析和向拟胚体（EBs）的自发分化实验。

生成的细胞克隆呈现出扁平、致密的细胞簇形态，边界清晰，符合piPSCs16, 17的预期特征，且与成纤维细胞形态明显不同。这些细胞碱性磷酸酶染色呈阳性（图3），OCT4、SOX2染色呈阳性，SSEA1和TRA 1-60染色呈部分阳性（图4）。这些细胞能够形成拟胚体（EBs），并表达内源性多能性基因OCT4和NANOG（表1）。

piPSC来源的神经前体细胞的表征
表征旨在确定所生成细...

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讨论

通过本方案，成纤维细胞被 体外 通过外源性表达 OCT4、SOX2、c-MYC 和 KLF4 进行重编程。重编程后的细胞被维持培养 体外 经过20次以上的传代后，当这些细胞系使用化学抑制剂进行神经元分化时，表达了神经前体细胞的标志物 Nestin 和 GFAP通过RT-qPCR确认，并经免疫荧光检测显示Nestin、β-Tubulin III和Vimentin呈阳性。有趣的是，可能由于用于分化为NPC样细胞的重编程猪成纤维细胞具有胚胎样特性，在重编程和分化的各个阶段均检测到Nestin在不同水平上的存在与表达。事实上，已有报道指出，在人类和猪的新生及胎儿成纤维细胞中均存在Nestin的时空特异性表达。

尽管已有数篇报道讨论了拟胚干细胞的生成 4,18值得注意的是，不同的多能性特征可能导致潜在的分化结果差异。尽管已有大量研究报道，但真正意义上的诱导多能干细胞（piPSCs）尚未成功获得，这仍然限制...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Kristine Freude 教授在实验方案和科学讨论方面提供的帮助。本工作获得了圣保罗研究基金会（FAPESP）（# 2015/26818-5、# 2017/13973-8 和 # 2017/02159-8）、国家科学技术发展委员会（CNPq # 433133/2018-0）以及高等学府人员进修协调办公室（CAPES）（资助代码 001）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293FTInvitrogen# R70007
6 孔板Costar# 3516
抗 B-Tubulin III 抗体abcam# ab7751
抗 NANOG 抗体abcam# ab77095
抗 NESTIN 抗体Millipore# ABD69
抗 OCT4 抗体Santa Cruz Biotechnology# SC8628
抗 SOX2 抗体abcam# ab97959
抗 SSEA1 抗体Millipore# MAB4301
抗 TRA1-60 抗体Millipore# MAB4360
抗 VIMENTIN 抗体abcam# ab8069
B27（不含维生素 A）Life Technologies# 12587010
DMEM/F-12 培养基Life Technologies# 11960
驴抗山羊 IgG (488)Invitrogen#  A11055
EGFSigma# E9644
胎牛血清Gibco# 10099
FGF2Peprotech# 100-18B
GlutaMAXGibco# 35050-061
谷氨酰胺Gibco# 25030-081
山羊抗小鼠 IgG (594)Invitrogen#  A21044
山羊抗兔 IgG (488)Invitrogen# A11008
六亚甲基溴化铵Sigma Aldrich# 107689
HighCapacity  试剂盒Life Technologies# 4368814
IMDM 培养基Gibco# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12 培养基Gibco# 12660-012
Knockout 血清替代物Gibco# 10828-028
LDN-193189Sigma-Aldrich# SML0559
白细胞碱性磷酸酶检测试剂盒Sigma Aldrich# 86R
Lipofectamine P3000™Invitrogen# L3000-015
MatrigelCorning# 354277
丝裂霉素 CSigma Aldrich# M4287-2MG
N2 添加剂Life Technologies# 17502048
Nanodrop ND-1000Nanodrop Technologies, Inc.
Neurobasal 培养基Life Technologies# 21103049
非必需氨基酸Gibco# 11140-050
青霉素-链霉素双抗Gibco# 15140-122
Revita CellGibco# A2644501
Rnase 抑制剂Life Technologies# 10777019
SB431542Stemgent# 72232
StemPro AccutaseGibco# A11105-01
SW28 转子Beckman Coulter# 342207
TrizolLife Technologies# 15596026
TrypLE ExpressGibco# 12604-021
β-巯基乙醇Gibco# 21985-023

参考文献

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