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方法文章

用于体外和体内研究的小鼠不变的自然杀伤T细胞的纯化与扩增

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DOI：

10.3791/62214

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2021年2月15日

 ,  ,  , 
1Experimental Immunology Unit, Division of Immunology, Transplantation and Infectious Diseases, IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Vita-Salute San Raffaele University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种快速且稳健的方案，用于从小鼠脾脏中富集不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，并在体外扩增至适合体外和体内研究的细胞数量。

摘要

不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）是一类具有固有免疫特性的T淋巴细胞，表达一种保守的半不变T细胞受体（TCR），该受体特异性识别由非多态性MHC I类相关分子CD1d呈递的自身或微生物脂类抗原。临床前和临床研究均支持iNKT细胞在癌症、自身免疫病和感染性疾病中的重要作用。iNKT细胞在不同物种间高度保守，其研究得益于多种小鼠模型，包括CD1d缺陷型或iNKT细胞缺陷型小鼠，以及利用CD1d四聚体或针对半不变TCR的单克隆抗体在小鼠和人类中明确检测iNKT细胞的技术手段。然而，iNKT细胞数量稀少，需扩增至足够数量方可开展研究。由于体外建立原代小鼠iNKT细胞系存在困难，我们建立了一种稳定可靠的方案，用于从iVα14-Jα18转基因小鼠（iVα14Tg）脾脏中分离和扩增iNKT细胞，这类小鼠中iNKT细胞的频率高出约30倍。本文表明，可通过免疫磁珠分选方法富集原代脾脏iVα14Tg iNKT细胞，获得纯度约为95–98%的细胞群体。纯化的iNKT细胞通过抗CD3/CD28磁珠联合IL-2和IL-7刺激，在培养第14天时可实现约30倍的扩增，细胞纯度达85–99%。扩增后的iNKT细胞易于进行遗传操作，为体外研究其活化与功能机制提供了极为宝贵的工具，更重要的是，也可用于体内过继转移实验。

引言

不变的自然杀伤T细胞（iNKT细胞）是一类具有固有免疫特性的T淋巴细胞，表达一种半不变的αβ T细胞受体（TCR）。在小鼠中，该受体由不变的Vα14-Jα18链与一组有限的多样化Vβ链配对形成1，可特异性识别由MHC I类相关分子CD1d呈递的脂类抗原2。iNKT细胞经历一种激动性选择程序，使其在胸腺内即获得活化/固有效应表型，该过程经历多个成熟阶段3,4，并产生CD4+和CD4-两个亚群。通过该程序，iNKT细胞获得不同的辅助性T细胞（TH）效应表型，即TH1（iNKT1）、TH2（iNKT2）和TH17（iNKT17），分别可通过转录因子T-bet、GATA3、PLZF和RORγt的表达加以识别5。iNKT细胞可识别多种微生物脂类，同时也对内源性脂类具有自身反应性，这些内源性脂类在细胞应激和组织损伤等病理情况下（如癌症和自身免疫疾病）表达上调2。激活后，iNKT细胞通过直接接触和细胞因子分泌来调节其他固有免疫和适应性免疫效应细胞的功能2。

iNKT细胞的研究得益于多种小鼠模型，包括CD1d缺陷型或Jα18缺陷型小鼠，以及抗原负载的CD1d四聚体的制备和针对人类半不变T细胞受体（TCR）的单克隆抗体（mAbs）的开发。然而，原代小鼠iNKT细胞系的建立一直较为困难。为了更深入地表征iNKT细胞的抗肿瘤功能，并将其应用于过继性细胞治疗，我们建立了一种从iVα14-Jα18转基因小鼠（iVα14Tg）6脾脏中纯化并扩增iNKT细胞的实验方案，该小鼠中iNKT细胞的频率比野生型小鼠高出30倍。

扩增的iNKT细胞可用于体外实验，也可在回输至小鼠后用于体内实验。在该实验体系中，例如，我们已证实其具有强大的抗肿瘤效应7。此外，体外扩增的iNKT细胞在注射至体内前可通过基因转移或基因编辑进行功能修饰8，这不仅有助于深入分析分子通路的功能，也为先进的细胞治疗策略奠定了基础。

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方案

本研究所述操作程序已通过圣拉斐尔科学研究所机构动物护理和使用委员会（IACUC）（编号1048）的审查和批准。

注意：所有操作均须在无菌条件下进行。所用试剂均列于材料表中。

1. 脾脏处理

  1. 通过吸入 CO 对 iVα14-Jα18 小鼠实施安乐死2 根据机构政策。
    注意：iVα14-Jα18 小鼠必须为 8 周龄或以上。为避免体内细胞移植时发生排斥反应，需注意：来自雌性小鼠的细胞可移植至雄性和雌性受体，而来自雄性小鼠的细胞仅可移植至雄性受体。对于体外实验，则无需考虑性别差异。可合并更多小鼠以获得更大量的细胞。
  2. 解剖小鼠脾脏，通过70 nm细胞筛过滤，加入10 mL含2%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS），制备单细胞悬液。
  3. 300 × g 离心 5 分钟。
  4. 倒置去除上清液，加入红细胞裂解缓冲液进行处理。用1 mL无菌ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液重悬细胞沉淀，在室温下孵育3分钟，然后加入5 mL含2% FBS的PBS进行封闭。以300 × g离心5分钟。
    注意：ACK 可商业获得；其成分为含有 0.15 M NH₄Cl、0.01 M KHCO₃ 和 0.1 mM EDTA 的溶液，用于裂解红细胞。4Cl, 10 mM KHCO₃3，以及 0.1 mM Na2EDTA（乙二胺四乙酸）溶于双蒸水2O，pH 7.2–7.4。如自行配制，需使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
  5. 通过倒置去除上清液。用 3 mL 含 2% FBS 的 PBS 重悬细胞沉淀，并通过移液去除脂肪残留物。如有需要，合并来自不同小鼠的细胞。
  6. 计数细胞，并保留50 µL用于FACS分析。

2. T细胞富集

注意：进行富集步骤时，操作需迅速，保持细胞处于低温环境，并使用已在 4 °C 预冷过夜后置于冰上的溶液

  1. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  2. 用适量含 2% FBS 的 PBS（每 107 个细胞使用 500 µL）和 Fc 阻断剂（每 107 个细胞使用 2.5 µL）重悬所有细胞；室温孵育 15 分钟。
  3. 每 107 个总细胞使用 1–2 mL MACS 分离缓冲液（MB）洗涤，并在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
    注意：MACS 缓冲液可商业获得，其成分为 pH 7.2 的 PBS、0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA。若自行配制，需使用 0.22 µm 滤膜过滤除菌。
  4. 倒置去除上清液，用 CD19-FITC 和 H2(IAb)-FITC 对细胞染色（每 107 个细胞在 100 µL MB 中加入 5 µL）。充分混匀后，在 4–8 °C 避光孵育 15 分钟。
  5. 每 107 个细胞加入 1–2 mL MB 洗涤细胞，并在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
  6. 彻底吸除上清液，将细胞沉淀重悬于每 107 个总细胞 90 µL 的 MB 中。每 107 个总细胞加入 10 µL Anti-FITC MicroBeads。充分混匀后，在 4–8 °C 避光孵育 15 分钟。
  7. 每 107 个细胞加入 1–2 mL MB 洗涤细胞，并在 300 × g 条件下离心 10 分钟。
  8. 彻底吸除上清液，将最多 1.25 × 108 个细胞重悬于 500 µL MB 中。
  9. 将 LD 柱置于 MACS 分选仪的磁场中以进行耗竭分选。为避免堵塞，在 LD 柱上安装预分选滤器，并用 2 mL MB 冲洗。
  10. 当柱腔排空后，将细胞悬液加至滤器上。收集穿过柱子的未标记细胞。
  11. 每次柱腔排空后，用 1 mL MB 洗涤 3 次。收集全部流出液，其中将富含 T 细胞，计数细胞总数。始终保留 50 µL 用于 FACS 分析。

3. iNKT 细胞富集

  1. 在 300 × g 条件下离心 5 分钟，通过倒置去除上清液。
  2. 根据抗体滴定结果，用 CD1d-四聚体-PE（小鼠 PBS57-CD1d-四聚体）对细胞进行染色，每 106 个细胞使用 50 µL MB。充分混匀后，在冰上避光孵育 30 分钟。
    注意：该步骤也可使用 APC 标记的小鼠 CD1d 四聚体及抗 APC 磁珠完成；后续染色中应相应调整所用荧光染料。本方案中使用的 PBS-57-CD1d 四聚体由 NIH 提供。α-半乳糖基神经酰胺（αGal-Cer）是 iNKT 细胞识别的典型抗原；PBS-57 是 αGal-Cer 的一种类似物，具有更高的溶解度9；NIH 四聚体中心提供与 CD1d 四聚体复合的 PBS-57 配体。然而，其他 CD1d 二聚体/四聚体/右旋糖酐复合物亦可商业获得，并可加载脂质抗原如 αGal-Cer。我们预计本方案可进行相应调整以适用于这些试剂。
  3. 每 107 个细胞加入 1–2 mL MB 洗涤细胞，300 × g 离心 10 分钟。
  4. 彻底吸走上清液，将细胞沉淀重悬于每 107 总细胞 80 µL 的 MB 中。每 107 总细胞加入 20 µL Anti-PE MicroBeads。充分混匀，在 4–8 °C 避光孵育 15 分钟。
  5. 每 107 个细胞加入 1–2 mL MB 洗涤细胞，300 × g 离心 10 分钟。
  6. 彻底吸走上清液，将最多 108 个细胞重悬于 500 µL MB 中。若细胞数量超过 108，则相应调整体积。
  7. 根据细胞数量，将 LS 柱（最多 108）或 MS 柱（最多 107）置于 MACS 分离器的磁场中。用 MB 冲洗柱子（LS 柱 3 mL，MS 柱 500 µL）。
  8. 将细胞悬液加至柱上。
  9. 收集未标记细胞的穿流液。当柱子储液室排空后，用适量 MB 洗柱 3 次（LS 柱每次 3 mL，共 3 次；MS 柱每次 500 µL，共 3 次）。全部流出液为 阴性组分。
  10. 将柱子从磁场中取出，置于新的收集管上。
  11. 向柱中加入 MB（LS 柱 5 mL，MS 柱 1 mL）；插入所提供的推杆，洗脱出 阳性组分（富含 iNKT 细胞）。
  12. 为进一步提高 iNKT 细胞回收率，将阴性组分在 300 × g 离心 10 分钟，并使用新的 LS 或 MS 柱重复步骤 3.6–3.7。合并阳性组分并计数细胞。保留 50 µL 阳性组分和阴性组分用于流式细胞术（FACS）分析。
  13. 通过流式细胞术（FACS）分析检测纯化效果。样品包括：新鲜脾脏组织、T 细胞富集组分、iNKT 阳性组分和 iNKT 阴性组分。使用以下抗体对细胞进行染色：CD19-FITC、IAb-FITC、CD1d-tetramer-PE、TCRβ-APC 和 DAPI。
    注意：预期从一只 iVα14-Jα18 小鼠可获得约 2×106 个 iNKT 细胞。

4. iNKT 细胞的激活与扩增

  1. 以1:1的比例，使用小鼠T细胞激活剂抗CD3/CD28磁珠激活纯化的iNKT细胞。
    1. 将iNKT细胞阳性组分在300 × g下离心5分钟。
    2. 同时，将适量的抗CD3/CD28磁珠转移至离心管中，加入等体积的PBS，涡旋振荡5秒。将离心管置于磁力架上1分钟，弃去上清液。
    3. 从磁力架上取下离心管，用适量完全RPMI培养基（RPMI 1640培养基，10%热灭活FCS，1 mM丙酮酸钠，1%非必需氨基酸，10 U/mL青霉素和链霉素，50 μM β-巯基乙醇）重悬洗涤后的磁珠，使每1 mL中含有5 × 105个iNKT细胞。用此悬浮液重悬离心后的iNKT阳性组分。
  2. 将1 mL细胞悬液（含5 × 105个iNKT细胞）与抗CD3/CD28磁珠加入48孔板中，添加20 U/mL IL-2，于37 °C培养。
  3. 5天后，加入10 ng/mL IL-7。
  4. 当细胞融合度达到80–90%时，按1:2比例传代，每次均需添加20 U/mL IL-2和10 ng/mL IL-7。在此条件下，iNKT细胞可扩增培养长达15天。

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结果

本论文所述方案可通过免疫磁珠分离法从小鼠脾脏中富集iNKT细胞，该过程如图1A所示。首先通过去除B细胞和单核细胞对脾脏总T细胞进行阴性筛选，随后使用负载PBS-57脂质抗原的CD1d四聚体对iNKT细胞进行阳性免疫磁珠分选，该四聚体可特异性地标记iNKT细胞。采用此方案可从一只iVa14-Ja18转基因小鼠的脾脏中获得约2 × 106个纯度为95–98%的iNKT细胞。在阴性组分中检测不到或仅能检测到极少量iNKT细胞（图1B）。

富集后，iVa14 iNKT细胞可在抗CD3/CD28磁珠以及IL-2和IL-7存在下进行扩增（图2A），如图2B所示，在培养第+14天平均扩增约30倍。

图3A展示了iNKT细胞的...

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讨论

本文展示了一种可重复且可行的方案，用于获得数百万个可直接使用的iNKT细胞。由于这些细胞在体内数量稀少，迫切需要一种扩增方法。我们提出的方案无需特殊仪器，也无需使用大量小鼠。为减少实验所需小鼠数量，我们特意采用了iVα14-Jα18转基因小鼠。

文献中已有另一种从iVα14-Jα18转基因小鼠扩增iNKT细胞的成功方案10。该方案需要在纯化iNKT细胞前6天制备新鲜的骨髓来源树突状细胞，随后用α-半乳糖基神经酰胺（α-galactosylceramide）负载并进行照射处理，再加入IL-2和IL-7。我们认为该方案的一大优势在于减少了实验所需小鼠的数量。此外，该方案也节省时间，因为细胞培养的建立仅需一天，而非一周。当前方案可能存在的一个可重复性限制是iVα14-Jα18转基因小鼠的可获得性，尽管这些小鼠可通过商业途径获取。若缺乏此类小鼠，我们设想可使用大量野生型（WT）小鼠作为替代，但由于野生型小鼠体内iNKT细胞数量稀少，需相应优化实验方案。

在细胞培养过程中，我们通常会检测扩...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Paolo Dellabona 和 Giulia Casorati 提供的科学支持以及对文稿的审阅。同时感谢美国国立卫生研究院（NIH）四聚体核心实验室提供的小鼠 CD1d 四聚体。本研究由 Fondazione Cariplo 基金项目 2018-0366（资助 M.F.）和意大利癌症研究协会（AIRC）奖学金 2019-22604（资助 G.D.）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化铵-氯化钾（ACK）溶液本实验室制备0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4
抗FITC磁珠Miltenyi Biotec130-048-701
抗PE磁珠Miltenyi Biotec130-048-801
布雷菲德菌素ASigmaB6542
CD19 -FITCBiolegend115506克隆号 6D5
CD1d-四聚体 -PENIH 四聚体核心实验室小鼠 PBS57-Cd1d-四聚体
CD4 -PeCy7Biolegend100528克隆号 RM4-5
Fc阻断剂BD Bioscience553142
胎牛血清（FBS）EurocloneECS0186L使用前经56°C热灭活并用0.22 µm滤膜过滤
FOXP3转录因子染色缓冲液eBioscience00-5523-00
H2 (IAb) -FITCBiolegend114406克隆号 AF6-120.1
重组人IL-2Chiron Corp
离子霉素SigmaI0634
LD柱Miltenyi Biotec130-042-901
LS柱Miltenyi Biotec130-042-401
MACS缓冲液（MB）本实验室制备含0.5%牛血清白蛋白（BSA；Sigma-Aldrich）和2 mM EDTA
MS柱Miltenyi Biotec130-042-201
非必需氨基酸Gibco11140-035
青霉素-链霉素（Pen-Strep）Lonza15140-122
PermWash缓冲液BD Bioscience51-2091KZ
多聚甲醛（PFA）SigmaP6148
磷酸盐缓冲液（PBS）EuroCloneECB4004L
佛波酯（PMA）SigmaP1585
预分离滤器（30 µm）Miltenyi Biotec130-041-407
重组小鼠IL-7R&D System407-ML-025
含谷氨酰胺的RPMI 1640培养基Gibco61870-010
丙酮酸钠Gibco11360-039
TCRβ -APCBiolegend109212克隆号 H57-597
αCD3CD28小鼠T细胞激活Dynabeads磁珠Gibco11452D
β-巯基乙醇Gibco31350010

参考文献

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