本文介绍了一种低成本且易于实施的实验方案，用于在环境条件下评估蝴蝶的冷休克恢复能力。
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摘要
摘要
在当前不断变化的世界中，生态生理学，尤其是变温动物的生态生理学，正变得愈发重要。该学科通过测量物种和环境特征，探究生物与其周围环境之间的相互作用，以更深入地理解其生存能力与适应性。传统的热耐受实验在时间、资金和设备方面成本较高，因此通常局限于较小的样本量和少数物种。本文介绍了一种新颖的实验方案，以蝴蝶为例，可获取大量飞行性陆生昆虫个体行为与生理的详细数据。本文描述了一种可在野外自然环境条件下进行的冷休克恢复实验方法，无需昂贵的实验室设备。该方法已被用于研究热带蝴蝶对冷休克的响应及恢复策略，获取了整个蝴蝶群落中个体水平的生理数据。这些方法既可用于偏远地区的野外研究，也可用于课堂教学，既能生成具有生态意义的生理数据，也可作为教学工具使用。
引言
20世纪70年代末至80年代初，热生理学与生态学的结合1,2催生了生态生理学这一研究领域。针对变温动物开展的大量热生理学研究，揭示了不同生态进化背景下生态学与生理学之间的协同作用3,4,5。近年来，由于全球气候变化及热环境的改变，变温生物热生理学研究再次受到广泛关注6,7。热生理学测定不仅有助于生态生理学领域的学术研究，还具有较高的可操作性，可供广大研究人员使用，并可作为各级教育阶段的实践教学手段。热性能的各个组成部分，包括热耐受极限以及温度骤变的影响，对动物的生态学、行为学和生活史特征具有基础性意义8,9。
具体而言，变温动物常被用于研究生理学问题，因为恒温性决定了环境温度与生物体温度之间存在不可分割的联系。生物所能耐受的温度范围（即临界热最小值至最大值的热范围），以及其行为和适合度达到最佳的温度（热最适范围），通常根植于生态和进化过程。随着平均温度及极端温度的不断升高，这些生理特征变得愈发重要10。例如，栖息地破坏和破碎化所伴随的非生物变化（包括温度上升）已影响到变温动物群落，如无尾目动物，使那些生理上较为脆弱（热耐受范围狭窄）的物种只能局限于小片残存的栖息地斑块中11,12。
评估热性能的关键组成部分在时间和资源方面都可能耗费巨大，传统上需要实验室设备和标准化条件。此外，常规测定通常无法反映特定动物在自然环境中所经历的广泛环境条件13，因为在类似生理实验中温度受到严格控制，往往与动物实际经历的环境条件无关。这种温度控制可能削弱对个体反应差异的理解2,14。生理学家一直依赖基于实验室的加热和冷却实验，利用可编程水浴装置逐步加热或冷却动物所处环境，以构建热性能曲线15。
通常将动物放入装有热电偶的小瓶中，通过调节周围水浴的温度，使其环境温度稳定变化。研究人员测量动物达到某种生理状态改变（例如冷昏迷、击倒）所需的时间，以及该状态变化发生时的温度16,17。这类设备起价至少500美元，体积大、重量重，且需要额外的技术设备（如计算机、热电偶）。因此，用于实施经典热性能评估方法的基本工具存在以下局限：1）并非所有人都能经济上承受；2）不适用于体型过大而无法容纳在常规小双翅目昆虫所用小瓶中的动物；3）不便于在偏远野外环境中携带使用。由于沿用常规做法，导致在分类学范围和实验条件方面的代表性受到限制18,19,20。
尽管完整的热性能曲线能够提供有关物种分布、生活史特征和行为等方面的信息，但量化少数更简单的热指标可能更为高效，且仍具有极高的信息价值。通过生理测定方法，测量冷昏迷起始、随后的冷休克恢复、冷适应以及翻正行为，可有效并可行地作为生物体临界低温（critical thermal minimum）的替代指标8。本文描述了一种适用于获取大型陆生变温昆虫生理数据的冷休克测定方法。该方法成本低廉、易于实施，可在野外条件下或课堂环境中进行。本实验方案所生成的冷休克恢复数据，可与物种或个体水平的性状数据相结合，用于探讨生态生理学相关问题，或用于向学生讲授生理学原理。
方案
1. 目标物种的鉴定
- 确定目标物种以明确冷击恢复时间。需要注意的是，不同类群诱导冷昏迷所需的时间各不相同（即昆虫仍存活但不活动且无反应的状态）。同样，根据所研究的生物体及数据用途，若目标个体未能飞行，可选择不同的终止时间点（见第4节）。
注意：本实验方案最初为鳞翅目昆虫设计和开发，但同样适用于体型较大、能飞行的陆生昆虫，特别是那些可被平放于玻璃纸信封中以限制其活动并防止损伤的昆虫（例如蝴蝶、蜻蜓和豆娘）。
2. 进行预试验
- 在少量个体中进行预实验，以确定关键参数。使用5-10个个体，按照下文第3至第5节的步骤进行预实验。
- 根据步骤5.1，采用30分钟、60分钟和90分钟的处理时间，在冰上测试诱导冷昏迷（不活动）但不致死目标物种所需的时间。
注：诱导冷昏迷所需时间取决于个体的体型、所处环境以及其自然史/行为特征。 - 根据步骤4.1–4.4的结果，并结合目标昆虫的生态学知识，选择一个时间点作为实验终止标准，即当某个个体未能完全恢复时结束实验。该时间截点也应基于物种的生态学特征，需考虑到昆虫在长时间无法飞行后极易被捕食。
注：例如，若大多数预实验个体在15分钟内恢复飞行，则可将实验终止时间设定为25分钟，以确保即使恢复较慢的个体也有充分恢复（即恢复飞行能力）的机会。本方案采用30分钟作为终止时间（步骤5.4）。
- 根据步骤5.1，采用30分钟、60分钟和90分钟的处理时间，在冰上测试诱导冷昏迷（不活动）但不致死目标物种所需的时间。
- 利用预实验数据中的参数指导正式实验的数据采集。根据目标生物的具体需求，调整下述方案中的参数，包括冰浴时间、实验终止时间，以及数据记录表中需记录的行为（例如，颤抖行为可能不适用于所选昆虫）。
- 在优化参数的同时，明确本实验拟解决的具体科学问题。
注：例如，若研究者关注长时间冷暴露对恢复能力的影响，则冰浴时间是需要重点调整的关键变量。若研究者关注体色（浅色与深色）物种间生理差异，可选择两种体色显著不同的物种，或人为改变昆虫翅的颜色，以检测翅色对恢复时间的影响。重要的是，本方法可根据具体研究需求和科学问题进行高度定制（详见讨论部分）。
- 在优化参数的同时，明确本实验拟解决的具体科学问题。
3. 昆虫的采集
- 使用适当的方法（如诱饵陷阱和昆虫网）采集昆虫（补充图1）。采集后，将每只个体放入带有唯一编号的独立玻璃纸信封中。
- 动物捕获后至进行低温休克实验前，应将其储存在阴凉遮蔽处。务必在捕获后24小时内对动物实施实验处理，并尽可能在各次试验中保持该时间一致。
- 尽管储存条件可能有所不同，但应避免昆虫暴露于直射阳光下。如有可能，将其置于室内阴凉、黑暗的房间中。
- 在野外时，确保存放过程中昆虫处于遮蔽状态，并防止被风吹走或受到可能进入信封的其他昆虫捕食者侵害。
4. 建立冷休克实验
- 在保温箱中装入冰块和水。确保冰块充足，能够维持至少一小时，必要时定期添加冰块，以保持水环境温度在 0 °C。
- 为每轮实验选择 1 至 4 个目标个体，并确保每个个体均可被识别。
- 若使用多个物种，每个物种仅使用一个个体，以避免在数据表中混淆个体。若仅实验一个物种，则仅使用易于区分的个体，例如具有断翅或独特斑纹的个体。
- 若实验目的与翅的颜色无关，可使用细头记号笔在翅上标记唯一编号（例如数字），以区分个体。
- 若实验不符合上述任一条件，则每次仅对一个个体进行实验。
- 在数据表中填写与每个被检测昆虫相关的信息，包括其唯一编号以及备注中的有用标识，如物种名称或显著特征（补充表 1）。
- 将所有目标个体（仍置于各自标记的信封中）放入一个密封的塑料袋中，并加入配重（材料表），然后将袋子置于冰水中 60 分钟（或直至诱导出冷昏迷状态；参见讨论部分）（补充图 2）。
- 确保配重足够重（例如大尺寸硬币、大垫圈或光滑石块），且体积足够大，以使装有昆虫的袋子完全浸没于冰水中并保持与水面垂直。使用不会导致密封塑料袋漏水的配重。
注意：尽管昆虫在浸水后仍可能恢复，但湿润的信封会增加取出个体的难度。最好保持袋内昆虫干燥。
- 确保配重足够重（例如大尺寸硬币、大垫圈或光滑石块），且体积足够大，以使装有昆虫的袋子完全浸没于冰水中并保持与水面垂直。使用不会导致密封塑料袋漏水的配重。
- 记录温度和光照数据。
- 使用数据记录仪（见 材料表）通过步骤 5.1 或 5.2 记录环境温度和光照数据。
- 将数据记录仪设置为每 10 秒采集一次温度和光照数据，起始时间设定为昆虫释放的时间。
- 根据昆虫被放入冰水的时间确定数据记录仪的启动时间。确保数据记录仪的时间（日期、时间）已同步，以便后续将环境条件数据与每个目标昆虫个体对应。
- 由第二位研究人员使用普通温度计手动记录短时间间隔内的温度和光照数据。
- 确定可与恢复时间相关联的实验参数，这些参数无需数据记录仪即可测量。采用明确的处理方式：遮阴/阳光；黄昏/正午。
- 使用数据记录仪（见 材料表）通过步骤 5.1 或 5.2 记录环境温度和光照数据。
- 将昆虫的网笼放置在合适位置，确保笼内温度和光照环境尽可能均匀，并使笼底抬高，便于观察者轻敲。
- 将数据记录仪放置在网笼外侧，或置于笼内不会因内部微小活动而被碰倒或干扰的位置。若不使用数据记录仪，则应适当放置温度计和/或按要求设置网笼配置。
注意：数据记录仪的放置位置必须确保所记录的环境条件尽可能接近昆虫实际所处的环境。
5. 开始冷激实验
- 将动物从冰水浴中取出，时间可为60分钟（或根据前述确定的适当时间）。立即从塑料袋中取出昆虫，并尽快将每只个体从其信封中取出，同时尽量减少操作（补充图3）。
- 一旦动物被放入网笼中，立即启动秒表（参见示例数据，补充表1）。
- 用铅笔轻敲网笼底部，以刺激正在恢复的昆虫。
注意：在恢复期间提供刺激可确保目标昆虫一旦具备生理能力，即刻表现出恢复状态和行为（补充视频）。- 敲击应足够频繁且有力，以确保动物在可能的情况下会做出反应，但不应引发非自主性反应。
注意：例如，当敲击网笼时，若某动物被弹射到空中并背部着地，但未自主移动以站立，则该行为不被视为"站立"行为，因为该生物并未真正自主站立。
- 敲击应足够频繁且有力，以确保动物在可能的情况下会做出反应，但不应引发非自主性反应。
- 当某只个体开始飞行（即表现出完全恢复）时，标记该次试验为完成。若昆虫在30分钟后仍未移动，则结束试验，并认为其已实现完全恢复。
- 将昆虫从网笼中取出，并放回其标记好的玻璃纸信封中。释放动物或保留用于进一步的数据采集（如个体的体型、体重等性状）。
- 若使用数据记录仪，请停止数据记录，并保存实验期间的温度和光照数据文件，文件应包含适当的日期/时间信息。
6. 数据处理
- 将数据表中提供的数据输入电子表格（例如，MS Excel）。
- 如果使用数据记录仪，请为每次测定的每个个体的每项反应添加温度和光照数据。
- 计算每个个体每种行为对应的温度和光照的平均值和标准差。
注意：由于数据记录仪每 10 秒记录一次数据，若某一个体的站立行为持续了 48 秒，则使用该次试验中数据记录仪的前 5 个数据点。 - 将每个个体的每种恢复行为与数据记录仪记录的非生物数据相关联，必要时将时间向上或向下取整至 10 秒间隔。
- 计算每个个体每种行为对应的温度和光照的平均值和标准差。
- 绘制并分析数据。图 1 举例展示了温度和光照对冷休克恢复时间的影响。 整合其他相关数据（物种特征、区域生境特征），以探究所测试类群生理特征的生态学与进化模式。
注意：图 1 使用 R 语言中的 ggplot2 软件包绘制。环境条件数据的详细程度取决于所用测量仪器。若使用数据记录仪，可生成细节水平与图 2相当的图表；若仅使用温度计，则研究人员无法绘制反映环境光照的图表。同样，若研究人员使用光照或温度的分类等级，可将这些散点图调整为箱形图或其他合适的图表模板以展示这些现象。
结果
本方案中收集的数据可用于分析和区分对生物体生理学具有重要意义的变量。例如，温度和光照条件均会影响蝴蝶从冷休克中的恢复（图1）。该图旨在探讨环境条件与冷休克恢复之间的相互作用。利用来自诱捕器和网捕的野生蝴蝶，共观察到181种蝴蝶在冷休克诱导的冷昏迷后表现出明显的恢复差异（图2）。图2所示数据由三位观察者在哥伦比亚安第斯山脉地区历时约五个月（2020年1月、2月及5月至7月）收集完成。实验均在蝴蝶捕获后的次日上午进行。在最高效率下，两名观察者可同时各自观察4只蝴蝶，重复7轮（最少耗时7.37小时），从而在单个上午完成对56只个体的测试。该方法可在涵盖个体变异数据的同时，实现对整个蝴蝶群落的大量数据采集。由于实验可在自然环境条件下进行，恢复条件能够代表其栖息地状况，并反映生物在自然环境中所经历的真实变异。图3展示了冷休克恢复实验中的温度与光照条件，与部分受试蝴蝶采集地牧场环境条件之间的重叠情况。
图1：蝴蝶冷休克后恢复时间（秒）的散点图。（A）恢复期间的平均温度和（B）平均LUX（光照强度）。物种按科进行分类并以不同颜色表示。总体而言，随着光照强度和温度的升高，冷休克恢复时间缩短，不同分类群之间存在差异。请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：哥伦比亚安第斯山脉181种蝴蝶的冷休克恢复实验结果示例。 数据表示将蝴蝶从低温环境中取出后至其能够飞行所经过的秒数。物种按科进行分类并以不同颜色标注。该图展示了本实验可成功应用的广泛分类学范围，以及不同物种间冷休克恢复反应的多样性。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：冷休克恢复实验期间的环境温度和勒克斯值。 图中显示了放置在蝴蝶采集地牧场中的数据记录仪所记录的环境温度（蓝色）和勒克斯值（光照强度，红色），浅色部分代表全天的野外环境条件，深色部分代表冷休克恢复实验期间的条件（仅上午时段）。所绘制的野外环境条件与实验条件反映了蝴蝶在为期一周的野外采样和实验过程中所经历的条件范围及平均状况。实验仅在清晨时段（07:00–13:00 h）进行，而数据记录仪在野外部署一周（图中显示白天时段为06:00–18:00 h）。本图展示了实验条件与蝴蝶实际经历的环境条件之间的重叠情况，表明在环境条件下开展生理学检测具有生态相关性。 请点击此处查看该图的放大版本。
补充 图1：使用诱饵Van-Someren陷阱和主动网捕法收集目标昆虫（此处为蝴蝶）的操作流程。 陷阱中同时放置了腐烂鱼类和腐烂水果作为诱饵。背景中为未加诱饵的陷阱，前景中为装在独立信封中的标本，置于一个蓝色塑料采集盒上。请点击此处下载该文件。
补充 图2：在装有冰水的冷藏箱中，最多四个单独的蝴蝶装在袋内并完全浸没。 塑料袋上标注了其放入冰水中的时间，以便在上午不同时段分批进行冷休克实验。塑料袋应密封，以防止标本被水浸湿；但在本实验中，袋子和信封进水对蝴蝶的恢复未产生可测量的影响。请点击此处下载该文件。
补充 图3：两名观察者在野外收集数据。 每个网笼中包含四只从冷休克中恢复的独特蝴蝶。笼内的聚氯乙烯T型接头用于放置数据记录仪，以防止阳光直射或雨水淋湿。每位观察者均使用秒表，在蝴蝶被释放入笼的瞬间立即启动计时。网笼由实验台架高，便于观察者轻敲笼底，以确保蝴蝶在行为反应上尽可能迅速地响应其生理状态。请点击此处下载该文件。
补充表 1：示例数据表。 该表格显示了每只蝴蝶在野外被赋予的唯一编号，以及备注中的区分特征（物种名称、主要颜色）。同时记录了蝴蝶在恢复期间的主要朝向（即翅膀哪一侧暴露于阳光下），记为 D（背面）或 V（腹面）。请点击此处下载该表格。
补充视频 1：轻敲饲养笼以促进冷休克后恢复。 当蝴蝶恢复时，观察者轻轻敲击饲养笼底部，以便在蝴蝶具备活动能力后立即诱导其行为反应。 请点击此处下载该视频。
讨论
热生理学研究结合了物种和环境特征的测量，以更好地理解生物与其周围环境之间的相互作用，这些相互作用对生存和适应性至关重要。尽管热特征在理解动植物自然史和生态学方面始终具有核心作用，但在景观变化和气候变化背景下，其重要性日益凸显11,21。特别是陆生变温昆虫中的多个类群，如鳞翅目和蜻蜓目昆虫，体型相对较大、数量丰富、行为特征明显，且易于进行实验操作。本文概述了一种高效且低成本的检测方法，可用于有效测量此类昆虫的生理反应。该方案需要获取健康的实验个体，且在实验前应尽量减少操作时间。每次实验所检测的个体数量具有灵活性，但每项实验中重点关注的个体数量将根据数据采集目的和/或观察者人数而有所不同。
例如，本方案旨在收集整个群落中蝴蝶个体的详细数据。因此，代表性结果展示了一项努力：尽可能在多种与当地环境相关的条件下，为尽可能多的物种个体收集数据。无论目标物种的数量多少，观察者都必须能够识别笼中正在恢复过程中的每一个个体。如果目标是仅从一个物种收集数据，则每次应仅测定一个或两个个体（如果能根据翅面磨损程度不同或通过个体标记加以区分）。研究对象的选择必须依据特定的研究问题或研究计划。根据所提出的问题以及数据收集的目的（例如科研或课堂教学），样本量及其他性状的采集方式将有所不同。
为了说明本实验方案所揭示的生理学基本组成部分（冷昏迷的诱导、恢复过程的各个步骤、环境条件的作用），课堂教师可选择两种不同的物种或同一物种的两种不同形态型。如果研究对象仅在一个关键性状上存在差异（例如体色），则所需的样本量较小，学生可深入研究该性状与生物体生理功能之间的关系。关注生态生理学的研究人员可利用其实验数据，探讨复杂的生态学与进化生物学问题。研究人员必须谨慎选择能够直接回答其科学问题的昆虫样本（例如根据发育阶段、年龄、性别或采集地点），并根据所涉及变量的数量确定适当的样本量。对于复杂模型而言，所需的样本量将大于上述描述的规模。
在收集行为恢复数据时，必须将笼子放置在离地面一定高度的位置，因为观察者需要能够轻敲笼子底部以诱发恢复行为。这可以确保生物体一旦具备生理能力，便立即做出反应（如站立或飞行），并记录下最终的恢复行为（飞行）。在冷休克恢复期间记录环境条件对于热生理学研究至关重要，因为本实验方案旨在研究并解析环境在生物体生理过程中的作用。数据记录仪（参见材料表）可用于标准化记录相关环境参数（例如温度、光照，甚至湿度）。然而，若缺乏此类设备，也可通过其他方式测量相关条件，例如使用数字温度计，或简化环境变量，采用明显不同的环境条件（如阴凉处与阳光下）进行对比。本实验方案为研究者提供了多种选择，可根据研究目的和范围灵活决定在冷休克恢复期间如何测量环境条件。
尽管该方法可进行修改以更好地适用于特定的分类群，但仍建议使用体型较大的飞行昆虫。能够自主恢复飞行能力的飞行昆虫可被视为已完全恢复。如文中所述，该方法已成功应用于热带和亚热带地区的蝴蝶。根据特定区域的温度变化趋势（即某地点所经历的温度范围会因海拔、纬度和树冠覆盖等因素而变化，从而影响预期结果），生物体进入冷昏迷所需在冰水浴中的时间可能超过或少于一小时。生物体的体型也可能影响其进入冷昏迷所需的时间。关键是要确定诱导冷昏迷（即完全不动）但不会导致目标物种死亡所需的低温暴露时间。诱导冷昏迷所需的时间取决于个体的体型、所处位置及其自然史/行为特征。根据本文所述的冷休克实验结果，并结合目标昆虫生态学的相关知识，应选择一个合适的时间点作为若个体未能完全恢复时终止实验的依据。
根据研究者的具体问题，该方法既可在野外也可在实验室中应用，分别用于考察自然环境变异和控制重要变量。该检测方法简单且成本低廉，有助于填补热生理学领域的现有空白。由于本实验方案操作简便，可适用于多种生物类群，使研究范围不再局限于适合实验室研究的生物。开展标准化且基于环境温度的热生理检测具有新颖性，可弥合实验室与野外研究结果之间的差距22。利用环境条件进行生物体恢复，将有助于研究者区分生理过程中环境因素与物种自身因素的作用14,22。最后，由于该方案成本低且无需特殊材料，可在野外偏远地区仅用少量设备即可实施——非常适合许多野外生物学家，同时也适用于课堂教学，使年轻学生获得动手实践的学习机会。
披露
作者没有竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
感谢Jaret Daniels、Isabella Plummer、Brett Scheffers和Dan Hahn在本实验方案最初开发阶段提供的建议。特别感谢Jaime Haggard、Sebastián Durán和Indiana Cristóbal Róis-Málaver多次实施该实验方案，并对其中关键环节提出了宝贵意见。同时感谢一位匿名审稿人对整篇稿件提出的反馈意见。本研究得到了佛罗里达大学 McGuire 鳞翅目与生物多样性研究中心出版基金、农业与生命科学学院、自然资源与环境学院以及野生动物生态与保护系的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24 x 24 x 36" 弹出式饲养 &和观察笼 | Bioquip | 1466PB | 确保笼子略微抬离地面，以便在实验过程中能够敲击笼底。 |
| 冷却器 | 任何 | NA | |
| 玻璃纸信封 | Bioquip | 1130B | |
| HOBO Pendant 温度/光照 8K 数据记录仪 | 起始 | UA-002-08 | 如果无法获取数据记录仪，研究人员可选择使用数字温度计定期记录环境温度。有关更多信息，请参见方案步骤4.5。 |
| HOBO 光学 USB 基站 | 起始 | 碱基-U-1 | |
| 冰水 | NA | NA | |
| 昆虫（焦点类群） | NA | 任何 | 收集足够的待测样本，确保实验分组（如物种、采样地点）具有重复性 |
| PVC 三通接头 | 任何 | 任何 | |
| 可密封塑料袋 | 任何 | NA | |
| 秒表/计时器 | 任何 | NA | |
| 重量 | 任何 | NA | 使用大号硬币或小石块压住塑料袋可确保样本完全浸没在冰水中。建议使用标准化重量的物体。 |
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