元素成像保护湿地根和岩石圈的方法

Summary

我们描述了一个协议，以水稻（Oryza水稻 L.）为模型物种，从湿地环境中取样、保存和分割完整的根部和周围的岩石圈土壤。保存后，可以使用元素成像技术（如同步加速器 X 射线荧光 （XRF） 化学光谱成像技术分析样品。

Abstract

根与土壤环境广泛相互作用，但可视化根与周围岩石圈之间的这种相互作用是具有挑战性的。湿地植物的岩石圈化学由于从根部到散装土壤的陡峭氧梯度，在捕获方面尤其具有挑战性。这里描述了一个协议，通过猛击冷冻和冷冻干燥，有效地保留了湿地植物的根系结构和岩石圈化学。大满贯冷冻，样品被冻结在铜块之间预先冷却液氮，尽量减少根部损伤和样品失真，可能发生闪光冻结，同时仍然尽量减少化学规格的变化。虽然样品失真仍有可能，但快速且成本最低的多个样品的能力增加了获得满意样品和优化成像时间的潜力。资料显示，该方法成功地保存了与铁斑块相关的稻根和生虫的减少砷物种。这种方法可用于研究各种湿地环境中的植物-土壤关系，这些环境跨越了从微量元素循环到植物化应用等各种浓度范围。

Introduction

根及其生殖球是动态的，异质的，对于理解植物如何获得矿物养分和污染物^1，2，3至关重要。根系是营养物质（例如磷）和污染物（例如砷）从土壤转移到植物的主要途径，因此了解这个过程对食物数量和质量、生态系统功能和植物灭菌有影响。然而，根是动态的空间和时间增长，以满足营养获取的需求，他们往往在功能，直径和结构（例如，横向根，冒险根，根毛^）2。根系的异质性可以在从细胞到生态系统的空间尺度上以及从每小时到十进制的时间尺度上进行研究。因此，根及其周围土壤（或日光圈）的动态和异质性对捕捉日光圈化学提出了挑战。尽管面临这一挑战，但必须研究土壤环境中的根源，以描述这种关键的植物与土壤关系。

湿地植物的岩石圈化学研究尤其具有挑战性，因为从散装土壤到根部存在陡峭的氧梯度，在空间和时间上都发生了变化。由于根部需要氧气来恢复，湿地植物已经适应了湿地土壤的低氧条件，创造了^4，5。Aerenchyma 是空心皮质组织，从芽延伸到根部，允许空气通过植物扩散到根部。然而，其中一些空气泄漏到岩石圈在较低的亚化部分的根，特别是附近的横向根结，不太成熟的根尖和拉长区

Protocol

1. 准备防冻设备

1. 将两个铜块（+5 厘米 x 5 厘米 x 15 厘米）水平放置在能够容纳液氮的清洁冷却器内，并倒入足够的液氮以淹没方块。一旦冒泡消退，将两个隔垫放在每端一个铜块的顶部。
   注:垫片高度决定要冻结的样品的高度:此示例使用 2 厘米隔间创建约 3 厘米 x 3 厘米 x 2 厘米的立方体。液氮的体积取决于冷却器的大小。此示例对大约 5 个立方体系列使用大约 1 L。
   注意:使用适当的个人防护设备和通风，因为液氮是低温和窒息。
2. 使用钳子和低温手套，将另一块铜块放在其末端，使取样在就位时更容易检索。

2. 样品收集和大满贯冻结

1. 使用铲子从潮湿的土壤中提取所需的植物和岩石圈，并确保挖洞比所需的根体积大得多。将土壤和植物放入容器中，并将其放置在台面上。
   注:整个盆栽土壤和植物从锅研究也可以使用。
2. 确定需要采集根部的土壤位置（即深度和接近拍摄）。使用钢刀片切割多余的土壤，注意不要打扰所需区域的土壤。当达到所需的区域时，切开一个约 3 厘米 x 3 厘米 x 2 厘米的根"立方体"，并立即将立方体放在水平铜块上的两个隔间之间。使用低温手套，拿起垂直铜块，并把它放在垫片的顶部，猛击冻结的生球立方体。
3. 冒泡消退（+5分钟）后，从铜块中取回被猛击冻结的岩石圈立方体，并包裹在预先标记的铝箔方块内。如果需要，在铝箔上标记块的方向。放入第二个液氮容器中，直到....

Results

这种方法允许在湿地植物的根和生土层中保存根部和化学物种，并进入散装土壤。在这项工作中，该方法用于评估稻米（Oryza水稻 L.）中与Fe和Mn氧化物以及植物养分的规格和共定位。水稻是在特拉华大学的水稻设施中种植的，在那里，30个稻田间皮（每株2米x2米，49株）用于在各种水土管理条件下种植水稻，目的是降低水稻谷物的吸收率和CD。这个实验提供了1470种单个植物，在整个生长季节可以从这些植物中取样。

鉴于样本数量充足，薄部分能够捕获各种根形态。 图1A 显示土壤基质内存在几个根直径作为横截面。然而，有些土壤部分可能包含很少（如果有的话）根部。在这项工作中，对63块土壤块进行了加工和切割，在湿锯上切割一次，以确定哪些样品子集适合薄切。在63个样本中，14个样本没有根，31个样本包含1-3根，18个样本包含3个以上根。请注意，根可能以不同的质量水平存在。 图1B 显示了保存完好的根，一个被冷冻干燥过程扭曲的根，以及一个在细分段过程中被拔出的根。

.......

Discussion

本文描述了一种利用可用于元素成像和/或化学规格映射的重度冷冻技术获取湿地植物根部保存的散装土壤和生肖球的协议。

与现有方法比较，此方法有几个优点。首先，这种方法允许同时调查根部和周围的生虫圈。目前存在的方法是，通过冲走土壤和保存^根31、32或在人工环境中种植植物（如rhizotbox），以及使用DGT方法检查根-土壤相互作用^{24、33、34，}但没有能力观察根本身^，来保存和化学成像根。此处描述的方法允许直接调查根部和周围的地层土壤，以便观察根-土关系。类似的技术已经用于检查原位水稻根部和周围的生虫圈，但与暴跌样品到液氮11，35，36，而不是猛击冻结这里描述。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
铜块	McMaster Carr	89275K42
金刚石刀片	Buehler	15 LC，102 毫米 x 0.3 毫米	作速度：225 rpm
环氧树脂形式	Struers	40300085	FixiForm
环氧树脂	Epotek	301-2FL
强力胶	Loctite	404
薄切片机	Buehler	PetroThin
湿锯	Buehler	IsoMet 1000