我们描述了一种利用水稻(Oryza sativa L.)作为模式物种,从湿地环境中采集、保存及切片完整根系及其周围根际土壤的实验方案。样品经固定保存后,可采用元素成像技术(如同步辐射X射线荧光(XRF)化学形态成像)进行分析。
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我们描述了一种利用水稻(Oryza sativa L.)作为模式物种,从湿地环境中采集、保存及切片完整根系及其周围根际土壤的实验方案。样品经固定保存后,可采用元素成像技术(如同步辐射X射线荧光(XRF)化学形态成像)进行分析。
根系与土壤环境存在广泛的相互作用,但要观察根系与其周围根际环境之间的相互作用仍具有挑战性。由于从根系到主体土壤存在剧烈的氧气梯度变化,湿地植物根际化学特征的捕捉尤为困难。本文介绍了一种通过骤冻和冷冻干燥来有效保存湿地植物根系结构及根际化学特性的实验方案。骤冻法是将样品置于用液氮预冷的铜块之间进行冷冻,该方法在最大限度减少化学形态变化的同时,可显著降低快速冷冻过程中可能发生的根系损伤和样品形变。尽管样品形变仍有可能发生,但由于该方法能够快速、低成本地获取多个样品,因而提高了获得理想样品的可能性,并优化了成像时间。实验数据表明,该方法成功保留了与铁膜相关的水稻根系及其根际中还原态的砷形态。该方法可广泛应用于各类湿地环境中植物-土壤关系的研究,适用范围涵盖从微量元素循环到植物修复技术等多种场景。
根系及其根际环境具有动态性和异质性,在理解植物如何获取矿质养分和污染物方面至关重要1,2,3。根系是养分(如磷)和污染物(如砷)从土壤进入植物的主要途径,因此理解这一过程对于食物的数量与质量、生态系统功能以及植物修复技术具有重要意义。然而,根系在空间和时间上均具有动态性,会根据养分获取需求生长,并且在功能、直径和结构上常存在差异(例如侧根、不定根、根毛)2。根系系统的异质性可在从细胞到生态系统尺度的空间范围,以及从小时到十年尺度的时间范围内进行研究。因此,根系及其周围土壤(即根际)的动态性和异质性为长期捕捉根际化学变化带来了挑战。尽管存在这一挑战,仍必须在土壤环境中研究根系,以表征这一关键的植物-土壤关系。
由于从土壤主体到植物根系存在剧烈的氧气梯度,且该梯度在时空上不断变化,湿地植物根际化学的研究尤为困难。由于根系需要氧气进行呼吸,湿地植物通过形成通气组织以适应湿地土壤中低氧的环境4, 5。通气组织是贯穿地上部分与根系的中空皮层组织,可使空气在植物体内扩散至根部。然而,部分空气会从根系中栓质化程度较低的区域泄漏至根际,特别是在侧根连接处、未成熟的根尖以及伸长区6,7,8,9。这种径向氧气释放会在湿地植物根际形成一个氧化区域,影响根际(生物地球)化学过程,并与还原性的土壤主体显著不同10,11,12。为了理解湿地根际和根系中养分与污染物的归趋与迁移过程,关键在于在分析过程中保持化学还原态的土壤主体、氧化态的根际以及湿地植物根系的完整性。然而,由于土壤主体中含有对氧气敏感的还原性组分,根系与土壤的保存方法必须在维持根系结构的同时,尽量减少对氧敏感的化学反应。
现有方法可用于固定植物组织并保存其超微结构以进行成像,但这些方法无法用于化学保存生长在湿地土壤中的根系。当研究仅需获取植物细胞内元素分布时,通常采用水培方式培养植物,其根系可轻松从溶液中取出,经高压冷冻固定和冷冻置换处理后进行切片,适用于多种成像技术,包括高分辨率二次离子质谱(nanoSIMS)、电子显微镜以及同步辐射X射线荧光(S-XRF)分析13,14,15。为了研究湿地植物根系外部的铁膜(Fe plaque),这些水培研究需在溶液中人工诱导铁膜形成16,但这并不能准确反映原位条件下铁膜分布及其相关元素在空间异质性和矿物组成上的真实情况17,18,19,20。已有方法可通过冷冻钻取(freeze-coring)技术来保存湿地土壤及其相关微生物21,但该技术难以有效获取完整的根系样本。目前用于可视化土壤中生长的根系及其根际化学环境的主要方法包括两类测量方式:元素通量和总元素浓度(及形态)。前者通常采用薄膜扩散梯度技术(diffusive gradients in thin films, DGT)22,23,24,即将土壤装入根箱(rhizoboxes)中,在实验室条件下支持植物生长,土壤中活性元素通过凝胶扩散至结合层。随后可对结合层进行成像,以定量分析目标活性元素。该技术能够有效揭示根系与根际之间的相互关系24,25,26,27,但使用根箱培养植物可能因根系受限而引入人为假象,且DGT无法获取根系内部的信息。后者则涉及对根系及其根际区域进行取样、样品保存,并直接在切片样本上分析元素分布。针对湿地植物根系及其周围根际环境的此类环境取样,必须谨慎处理样品,以避免样品制备过程中产生人为假象。
本文描述了一种通过骤冷和冷冻干燥有效保存湿地植物根系结构及根际化学特性的实验方案。快速冷冻可显著减缓对氧气敏感溶质的转化过程,但可能导致根系损伤,并在样品干燥时引起物质迁移。然而,将样品置于用液氮预冷的铜块之间进行骤冷,可最大限度地减少根系损伤和样品形变28。保存后的样品随后被包埋于环氧树脂中,该树脂可稳定砷(As)的形态分布20, 29,并可用于对根系及其根际土壤进行切片和抛光,以实现成像分析。本研究中的样品在制备成薄片后,采用硫-同步辐射X射线荧光(S-XRF)化学形态成像技术进行分析。然而,也可选用其他成像技术,包括激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱(LA-ICP-MS)、粒子诱导X射线发射(PIXE)、二次离子质谱(SIMS)以及激光诱导击穿光谱(LIBS)成像技术。
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1. 准备 slam 冷冻设备
2. 样品采集与免锤击冷冻
3. 根际立方体的冷冻干燥与包埋
4. 切割和切片根际立方体
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该方法可用于保存湿地植物根系及其根际和原土中的根系结构和化学形态。本研究中,该方法被用于评估水稻(Oryza sativa L.)根际中砷(As)的形态分布及其与铁(Fe)、锰(Mn)氧化物以及植物养分的共定位情况。水稻种植于特拉华大学的RICE试验平台,该平台设有30个水稻微宇宙系统(2 m × 2 m,每个系统种植49株水稻),用于在不同土壤和水分管理条件下种植水稻,旨在降低水稻籽粒中砷和镉(Cd)的吸收。本实验共提供了1470株独立植株,可在整个生长季中持续采集根际样品。
在样本数量足够的情况下,薄片能够捕捉到多种根系形态。图1A展示了土壤基质中不同根系直径的横切面。然而,部分土壤切片中可能仅含有极少甚至不含根系。本研究中共处理并使用湿式切割机切割了63个土壤块,以确定哪些样本子集适合进行薄片制备。在63个样本中,14个不含根系,31个含有1至3条根系,18个含有超过3条根系。需要注意的是,根系的保存状态可能存在不同程度的差异。图1B展示了...
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本文介绍了一种利用骤冻技术获取保存完好的湿地植物根系整体土壤及根际环境的实验方案,该样品可用于元素成像和/或化学形态分布图谱分析。
与现有方法相比,该方法具有多项优势。首先,该方法能够同时研究根系及其周围的根际环境。目前已有方法可通过洗去土壤并保存根系31, 32,或通过在人工环境中(如根箱)培养植物并结合DGT技术来分析根-土相互作用24, 33, 34,但这些方法均无法直接观察根系本身。本文所述方法则可在原位直接观察根系及其周围根际土壤,从而研究根-土关系。类似技术曾用于原位研究水稻根系及周围根际环境,但采用的是将样品浸入液氮中冷冻11, 35,
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作者无任何利益冲突需要披露。
作者感谢Seyfferth和Tappero获得的一项联合种子基金,该基金支持特拉华大学与布鲁克海文国家实验室之间的合作。本研究的部分工作使用了国家同步辐射光源II的X射线荧光显微(XFM,4-BM)光束线,该设施是美国能源部(DOE)科学办公室下属的用户设施,由布鲁克海文国家实验室根据合同号DE-SC0012704为美国能源部科学办公室运行。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铜块 | McMaster Carr | 89275K42 | |
| 金刚石切割片 | Buehler | 15 LC, 102 mm x 0.3 mm | 运行速度:225 rpm |
| 环氧树脂模具 | Struers | 40300085 | FixiForm |
| 环氧树脂 | Epotek | 301-2FL | |
| 快干胶 | Loctite | 404 | |
| 薄片切割机 | Buehler | PetroThin | |
| 湿式切割机 | Buehler | IsoMet 1000 |
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