一种用于保存湿地植物根系及根际环境以进行元素成像的方法

摘要

我们描述了一种利用水稻（Oryza sativa L.）作为模式物种，从湿地环境中采集、保存及切片完整根系及其周围根际土壤的实验方案。样品经固定保存后，可采用元素成像技术（如同步辐射X射线荧光（XRF）化学形态成像）进行分析。

摘要

根系与土壤环境存在广泛的相互作用，但要观察根系与其周围根际环境之间的相互作用仍具有挑战性。由于从根系到主体土壤存在剧烈的氧气梯度变化，湿地植物根际化学特征的捕捉尤为困难。本文介绍了一种通过骤冻和冷冻干燥来有效保存湿地植物根系结构及根际化学特性的实验方案。骤冻法是将样品置于用液氮预冷的铜块之间进行冷冻，该方法在最大限度减少化学形态变化的同时，可显著降低快速冷冻过程中可能发生的根系损伤和样品形变。尽管样品形变仍有可能发生，但由于该方法能够快速、低成本地获取多个样品，因而提高了获得理想样品的可能性，并优化了成像时间。实验数据表明，该方法成功保留了与铁膜相关的水稻根系及其根际中还原态的砷形态。该方法可广泛应用于各类湿地环境中植物-土壤关系的研究，适用范围涵盖从微量元素循环到植物修复技术等多种场景。

引言

根系及其根际环境具有动态性和异质性，在理解植物如何获取矿质养分和污染物方面至关重要^1,2,3。根系是养分（如磷）和污染物（如砷）从土壤进入植物的主要途径，因此理解这一过程对于食物的数量与质量、生态系统功能以及植物修复技术具有重要意义。然而，根系在空间和时间上均具有动态性，会根据养分获取需求生长，并且在功能、直径和结构上常存在差异（例如侧根、不定根、根毛）²。根系系统的异质性可在从细胞到生态系统尺度的空间范围，以及从小时到十年尺度的时间范围内进行研究。因此，根系及其周围土壤（即根际）的动态性和异质性为长期捕捉根际化学变化带来了挑战。尽管存在这一挑战，仍必须在土壤环境中研究根系，以表征这一关键的植物-土壤关系。

由于从土壤主体到植物根系存在剧烈的氧气梯度，且该梯度在时空上不断变化，湿地植物根际化学的研究尤为困难。由于根系需要氧气进行呼吸，湿地植物通过形成通气组织以适应湿地土壤中低氧的环境^{4, 5}。通气组织是贯穿地上部分与根系的中空皮层组织，可使空气在植物体内扩散至根部。然而，部分空气会从根系中栓质化程度较低的区域泄漏至根际，特别是在....

方案

1. 准备 slam 冷冻设备

1. 将两个铜块（约 5 cm × 5 cm × 15 cm）水平放置于一个可盛装液氮的洁净保温箱内，并倒入足量液氮以完全浸没铜块。待沸腾现象减弱后，在其中一个铜块的两端各放置一个垫块。
   注意：垫块的高度决定了待冷冻样品的高度；本示例使用 2 cm 高的垫块，以制备约 3 cm × 3 cm × 2 cm 的样品块。液氮的用量取决于保温箱的大小；本示例中连续制备约 5 个样品块，使用约 1 L 液氮。
   警告：液氮为低温液体且具有窒息性，操作时须佩戴适当的个人防护装备并确保通风良好。
2. 使用镊子和耐低温手套，将另一个铜块竖直立起，以便在放置样品后更易于取出。

2. 样品采集与免锤击冷冻

1. 使用铁铲从湿土中提取目标植物及其根际，确保挖掘的坑比所需根系体积大得多。将土壤和植物放入容器中，并置于实验台上。
   注意：盆栽试验中的整个盆土和植物也可直接使用。
2. 确定需要取根的土壤位置（即深度及与地上部分的距离）。使用钢刀切除多余土壤，注意不要扰动目标区域的土壤。到达目标区域后，切割出一个约 3 cm × 3 cm × 2 cm 的根"立方体"，并立即将其置于水平铜块上的两个垫片之间。戴上低温手套，拿起垂直铜块，压在垫片上方，以快速冷冻根际土方。
3. 待气泡停止产生（约 5 分钟）后，从铜块中取出快....

结果

该方法可用于保存湿地植物根系及其根际和原土中的根系结构和化学形态。本研究中，该方法被用于评估水稻（Oryza sativa L.）根际中砷（As）的形态分布及其与铁（Fe）、锰（Mn）氧化物以及植物养分的共定位情况。水稻种植于特拉华大学的RICE试验平台，该平台设有30个水稻微宇宙系统（2 m × 2 m，每个系统种植49株水稻），用于在不同土壤和水分管理条件下种植水稻，旨在降低水稻籽粒中砷和镉（Cd）的吸收。本实验共提供了1470株独立植株，可在整个生长季中持续采集根际样品。

在样本数量足够的情况下，薄片能够捕捉到多种根系形态。图1A展示了土壤基质中不同根系直径的横切面。然而，部分土壤切片中可能仅含有极少甚至不含根系。本研究中共处理并使用湿式切割机切割了63个土壤块，以确定哪些样本子集适合进行薄片制备。在63个样本中，14个不含根系，31个含有1至3条根系，18个含有超过3条根系。需要注意的是，根系的保存状态可能存在不同程度的差异。图1B展示了.......

讨论

本文介绍了一种利用骤冻技术获取保存完好的湿地植物根系整体土壤及根际环境的实验方案，该样品可用于元素成像和/或化学形态分布图谱分析。

与现有方法相比，该方法具有多项优势。首先，该方法能够同时研究根系及其周围的根际环境。目前已有方法可通过洗去土壤并保存根系^{31, 32}，或通过在人工环境中（如根箱）培养植物并结合DGT技术来分析根-土相互作用^{24, 33, 34}，但这些方法均无法直接观察根系本身。本文所述方法则可在原位直接观察根系及其周围根际土壤，从而研究根-土关系。类似技术曾用于原位研究水稻根系及周围根际环境，但采用的是将样品浸入液氮中冷冻^{11, 35,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
铜块	McMaster Carr	89275K42
金刚石切割片	Buehler	15 LC, 102 mm x 0.3 mm	运行速度：225 rpm
环氧树脂模具	Struers	40300085	FixiForm
环氧树脂	Epotek	301-2FL
快干胶	Loctite	404
薄片切割机	Buehler	PetroThin
湿式切割机	Buehler	IsoMet 1000