本方案提供了将Drosophila肿瘤异体移植至成年宿主腹部的初始及连续世代移植的详细操作指南，用于研究肿瘤发生的不同方面。通过使用自动注射装置，研究人员可获得比传统人工方法更高的效率和肿瘤产量。
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方法文章
异种肿瘤移植 黑腹果蝇 使用可编程纳升级自动注射器
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
该方案描述了肿瘤的同种异体移植方法 黑腹果蝇 使用自动纳升级注射装置. 使用自动注射装置，经过培训的操作人员相较于手动注射器能够实现更高效且更一致的移植效果。本文将按时间顺序介绍相关主题：从杂交配种开始 果蝇 线条，到原发肿瘤的诱导与解剖，再将原发肿瘤移植至新的成年宿主，并进行连续多代的肿瘤传代以支持长期研究。作为示例，本文采用由Notch胞内区（NICD）过表达诱导产生的唾液腺成虫盘环肿瘤进行多代移植。这些肿瘤可首先在幼虫唾液腺成虫盘环的过渡区微环境中稳定诱导产生，随后进行同种异体移植并在体内培养，以研究肿瘤的持续生长、演化及转移过程。该异体移植方法可用于潜在的药物筛选项目，同时也适用于肿瘤与宿主相互作用的研究。
引言
本方案提供了使用自动纳升注射装置（例如 Nanoject）将黑腹果蝇（Drosophila）幼虫唾液腺（SG）成虫盘肿瘤异体移植至成年宿主腹部的逐步操作指南。本方案还介绍了将肿瘤再次异体移植到新一代成年宿主中的方法，从而为持续纵向研究肿瘤特征（如肿瘤演化及肿瘤-宿主相互作用）提供了可能。该方案也可应用于药物筛选实验。
本方法旨在改进使用手动注射器在Drosophila中进行肿瘤异体移植的效率1，因为手动注射器在吸力和注射力方面通常不一致，导致肿瘤异体移植效果不理想。自动注射装置可提供更好的控制，从而降低移植后果蝇的死亡率。熟练的操作者使用自动注射器可实现超过90%的宿主存活率，而使用手动注射器时约为80%1。移植后第8至12天的总体肿瘤获取率为60%–80%。平均每只果蝇的注射时间也从使用手动注射器的30–40秒缩短至使用自动注射器的20–25秒。
该方案是首批使用自动注射装置的方案之一 果蝇 肿瘤异体移植。最近一项研究还使用自动注射器进行肿瘤性神经干细胞的异体移植。2此前，自动注射装置已被用于 果蝇 研究细菌毒力3寄生虫感染与宿主防御
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方案
1. SG 成虫盘环肿瘤的制备
- 将具有以下基因型的成年果蝇进行杂交 UAS-NICD （雄性：10-15 只果蝇）和 Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts （处女雌蝇：10–15只），在18 °C条件下让其交配繁殖1天。所选成年果蝇应为5–9日龄，以确保较高的繁殖力。
- 让成虫在18 ˚C条件下于小瓶内的果蝇培养基中产卵24小时，然后移除成虫。
注意：果蝇食物采用标准的玉米粉食物配方制备 果蝇 菌种保藏中心8每个小瓶应含有约10 mL的果蝇食物。 - 将卵在18 °C条件下孵育6天。在此期间，幼虫将孵化。
- 将含有幼虫的样品管转移至29 °C培养箱中，继续孵育7天。
注意：此孵育步骤可根据具体的实验设计选择性进行。
2. 异体移植用成年野生型 Drosophila 的制备
- 麻醉野生型或适当的突变型成年果蝇 含100% CO2 根据性别分选果蝇。雄性和雌性果蝇均可作为肿瘤宿主。
- 用两条较短的胶带分别固定在载玻片两端，将一段5厘米长的果蝇粘板黏性面向上固定在载玻片上。
- 用胶带....
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结果
本研究利用纳升级注射自动注射装置对唾液腺成虫盘肿瘤进行了代际异体移植，并使用共聚焦激光扫描显微镜进行后续的肿瘤活体成像，从而更深入地研究肿瘤生长、肿瘤细胞迁移以及肿瘤与宿主之间的相互作用。在固定果蝇时，将其粘附于显微镜载玻片上，并使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）块进行固定11。
图 5A 实时成像捕获了一个1st 第一代（G1）SG成虫盘环状肿瘤在异体移植后第10天于成年宿主腹部生长。该成像水平可用于追踪肿瘤分裂过程。 图5B 描绘了一个6th 第6代（G6）SG成虫盘环状肿瘤在异体移植后第10天占据宿主腹部的大部分区域。此阶段的成像有助于揭示肿瘤的生长模式及其迁移与侵袭行为。需要注意的是，尽管本图像使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄，但也可根据肿瘤大小，采用配备GFP荧光适配器的体视显微镜在2倍至5倍放大倍数下进行观察。
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讨论
肿瘤异体移植有助于研究人员解决在黑腹果蝇（Drosophila）肿瘤生长与进展过程中出现的某些问题。其中一个挑战是避免携带肿瘤的幼虫或成虫在原代肿瘤培养期间过早死亡12。在此背景下，持续进行肿瘤异体移植可使肿瘤无限生长，从而便于开展关于肿瘤生长、转移及演化的纵向研究。肿瘤异体移植还适用于评估宿主-肿瘤相互作用的多个方面7,13。在进行肿瘤异体移植前，可对宿主基因型进行操控，以评估宿主对肿瘤生长和迁移以及肿瘤诱导的恶病质的影响14,15。具有不同基因型的果蝇宿主在面对相同肿瘤时，可能表现出不同的类似恶病质的消耗症状。异体移植后，可将携带肿瘤的宿主制备成标本，用于活体成像，相关操作方案经Koyama等和Ji等的方法改进而来11,16
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披露
作者之间无任何利益冲突需要声明。
致谢
感谢前实验室成员杨盛安博士和胡安-马丁·波蒂拉先生在本实验方案开发过程中所做的贡献。感谢北京大学生命科学学院宋艳实验室分享其手工异体移植实验方案。同时感谢卡尔德·埃尔斯沃思先生和埃弗雷斯特·夏皮罗先生对稿件的审阅和宝贵意见。
本研究获得了美国国立卫生研究院（https://www.nih.gov/）的资助（项目编号：GM072562、CA224381、CA227789） 以及美国国家科学基金会（htps://nsf.gov/）的资助（项目编号：IOS-155790）。 资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM 980 | 也称为 "Zeiss LSM 980" |
| 玉米粉果蝇饲料 | Bloomington 果蝇保种中心 | N/A | 也称为 "BDSC 标准玉米粉饲料" |
| 解剖针（30G×1/2） | BD PrecisionGlide | 305106 | |
| 解剖板 | Fisher Scientific | 12-565B | |
| 果蝇胶带 | Fisherbrand | 159015A | |
| 体视显微镜荧光适配器 | Electron Microscopy Sciences | SFA-UV | 也称为 "NightSea 荧光适配器" |
| 荧光显微镜 | Zeiss | 495015-0001-000 | 也称为 "Zeiss Stereo Discovery.V8" |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11251-10 | 也称为 "Dumont #5 镊子" |
| 玻璃毛细管（3.5英寸） | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 胶水 | Elmer | E305 | 也称为 "Elmer 可水洗透明胶" |
| 光学显微镜 | Zeiss | 435063-9010-100 | 也称为 "Zeiss Stemi 305" |
| 微电极拉制仪 | World Precision Instruments | PUL-1000 | 也称为 "四步微电极拉制仪" |
| 纳升注射仪 | Drummond | 3-000-204 | 也称为 "Nanoject II 自动纳升级注射器" |
| Schneider 培养基 | ThermoFisher | 21720001 | |
| 注射器（27G×1/2） | BD PrecisionGlide | 305109 | |
| 小瓶 | Fisherbrand | AS507 |
参考文献
- Rossi, F., Gonzalez, C. Studying tumor growth in Drosophila using the tissue allograft method. Nature Protocols. 10 (10), 1525-1534 (2015).
- Magadi, S. S., et al. Dissecting Hes-centred transcriptional networks in neural stem....
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重印与许可
