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方法文章

异种肿瘤移植 黑腹果蝇 使用可编程纳升级自动注射器

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DOI：

10.3791/62229

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2021年2月2日

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Tulane University School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了将Drosophila肿瘤异体移植至成年宿主腹部的初始及连续世代移植的详细操作指南，用于研究肿瘤发生的不同方面。通过使用自动注射装置，研究人员可获得比传统人工方法更高的效率和肿瘤产量。

摘要

该方案描述了肿瘤的同种异体移植方法 黑腹果蝇 使用自动纳升级注射装置. 使用自动注射装置，经过培训的操作人员相较于手动注射器能够实现更高效且更一致的移植效果。本文将按时间顺序介绍相关主题：从杂交配种开始 果蝇 线条，到原发肿瘤的诱导与解剖，再将原发肿瘤移植至新的成年宿主，并进行连续多代的肿瘤传代以支持长期研究。作为示例，本文采用由Notch胞内区（NICD）过表达诱导产生的唾液腺成虫盘环肿瘤进行多代移植。这些肿瘤可首先在幼虫唾液腺成虫盘环的过渡区微环境中稳定诱导产生，随后进行同种异体移植并在体内培养，以研究肿瘤的持续生长、演化及转移过程。该异体移植方法可用于潜在的药物筛选项目，同时也适用于肿瘤与宿主相互作用的研究。

引言

本方案提供了使用自动纳升注射装置（例如 Nanoject）将黑腹果蝇（Drosophila）幼虫唾液腺（SG）成虫盘肿瘤异体移植至成年宿主腹部的逐步操作指南。本方案还介绍了将肿瘤再次异体移植到新一代成年宿主中的方法，从而为持续纵向研究肿瘤特征（如肿瘤演化及肿瘤-宿主相互作用）提供了可能。该方案也可应用于药物筛选实验。

本方法旨在改进使用手动注射器在Drosophila中进行肿瘤异体移植的效率1，因为手动注射器在吸力和注射力方面通常不一致，导致肿瘤异体移植效果不理想。自动注射装置可提供更好的控制，从而降低移植后果蝇的死亡率。熟练的操作者使用自动注射器可实现超过90%的宿主存活率，而使用手动注射器时约为80%1。移植后第8至12天的总体肿瘤获取率为60%–80%。平均每只果蝇的注射时间也从使用手动注射器的30–40秒缩短至使用自动注射器的20–25秒。

该方案是首批使用自动注射装置的方案之一 果蝇 肿瘤异体移植。最近一项研究还使用自动注射器进行肿瘤性神经干细胞的异体移植。2此前，自动注射装置已被用于 果蝇 研究细菌毒力3寄生虫感染与宿主防御4以及对不同化合物的生物活性进行筛选5. 本方案对自动注射装置进行了改造，以适用于肿瘤注射，并旨在提供 果蝇 研究人员可获得更高质量且更一致的结果，同时节省大量时间。该方案不仅可用于肿瘤的同种移植，还可根据需要调整用于相同规格的野生型和突变型组织的同种移植6.

Drosophila NICD 肿瘤模型由 Yang 等人首次引入本方案7，该模型建立于 SG 幼虫盘环状过渡区，这一区域被称为"肿瘤热点"，其内源性 Janus 激酶/信号转导子与转录激活子（JAK-STAT）以及 c-Jun 氨基末端激酶（JNK）活性水平较高。此外，该过渡区基质金属蛋白酶-1（MMP1）表达水平也较高7，使得该区域特别易于发生肿瘤形成。仅通过过表达 NICD 激活 Notch 信号通路，已足以稳定诱导肿瘤的发生。这些肿瘤随后可进行异体移植，用于研究多种科学问题，包括肿瘤细胞分裂、侵袭行为以及肿瘤与宿主之间的相互作用。

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方案

1. SG 成虫盘环肿瘤的制备

  1. 将具有以下基因型的成年果蝇进行杂交 UAS-NICD （雄性：10-15 只果蝇）和 Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80ts （处女雌蝇：10–15只），在18 °C条件下让其交配繁殖1天。所选成年果蝇应为5–9日龄，以确保较高的繁殖力。
  2. 让成虫在18 ˚C条件下于小瓶内的果蝇培养基中产卵24小时，然后移除成虫。
    注意：果蝇食物采用标准的玉米粉食物配方制备 果蝇 菌种保藏中心8每个小瓶应含有约10 mL的果蝇食物。
  3. 将卵在18 °C条件下孵育6天。在此期间，幼虫将孵化。
  4. 将含有幼虫的样品管转移至29 °C培养箱中，继续孵育7天。
    ​注意：此孵育步骤可根据具体的实验设计选择性进行。

2. 异体移植用成年野生型 Drosophila 的制备

  1. 麻醉野生型或适当的突变型成年果蝇 含100% CO2 根据性别分选果蝇。雄性和雌性果蝇均可作为肿瘤宿主。
  2. 用两条较短的胶带分别固定在载玻片两端，将一段5厘米长的果蝇粘板黏性面向上固定在载玻片上。
  3. 用胶带将果蝇的翅膀固定以 immobilize 果蝇。操作果蝇时使用镊子。
    1. 对60-80只用作异体移植受体的成年果蝇重复上述步骤。
      注意：最好将果蝇排列成整齐的行，使其体轴相互平行，以便后续注射过程更高效地进行。 图1 显示以这种方式固定住的寄主果蝇排成行。

3. 自动注射装置的组装

  1. 将自动注射装置和电源线连接到控制器箱。
    1. 将注射体积设置为 59.8 nL。这有助于在异体移植过程中维持适当的吸力和注射力。
  2. 将 控制器箱和自动注射器放置在光学显微镜的两侧。
    注意：对于右手操作者，控制器箱应置于显微镜左侧，注射器置于右侧；左手操作者则相反。
  3. 使用镊子剪去玻璃毛细管封闭端，以准备 3.5 英寸玻璃毛细管的使用。
    1. 使用四步式微电极拉制仪处理玻璃毛细管的一端，并按照仪器设定参数加热形成细窄的封闭端：加热温度 = 650，拉力 = 200，距离 = 8。将毛细管整齐放入拉制仪中，输入上述参数后运行程序。
    2. 用镊子以约 60° 角剪切毛细管，使其末端更尖锐，便于顺利插入成年果蝇腹部1。参见 图 2 以了解剪切良好的毛细管示例。
  4. 轻轻拧开注射器的帽盖。按住 排空 按钮，推动注射针直至其伸出长度达到总长度的 70%–80%。如需加快毛细管推进速度，可在持续按住 排空 按钮的同时，按下 填充 按钮一次。
  5. 使用注射器将矿物油注入玻璃毛细管中。然后小心地将玻璃毛细管套入注射针上，直至其牢固地固定在注射器的橡胶塞内。随后拧紧注射器帽盖。
    1. 擦拭玻璃毛细管外表面残留的矿物油，以避免在异体移植过程中污染培养基。

4. SG 成虫盘环肿瘤的解剖

  1. 选取一条幼虫，将其转移至盛有 100 µL Schneider 培养基的解剖板中，以准备进行唾腺（SG）成囊环肿瘤的解剖。
    ​注意：仅携带肿瘤的样本会保持幼虫状态，因为肿瘤的生长会延缓幼虫的发育和变态进程9。约三分之二的样本不携带肿瘤，因此已发育为蛹或成虫。
    1. 进行解剖与异体移植操作时，使用放大倍数为 10x–20x 的体视显微镜。
  2. 用一对镊子夹住幼虫身体的中段，用另一对镊子夹住幼虫头部，并沿身体长轴施加拉伸力。
  3. 定位幼虫的 Y 形唾腺（SG），并将其从其他幼虫组织中分离10。
  4. 通过去除周围邻近组织，解剖并分离唾腺成囊环肿瘤。解剖过程示意图参见 图3。
  5. 根据研究需要，重复步骤 4.1–4.4，额外获取 10 至 20 个唾腺成囊环肿瘤。

5. 原发性唾液腺想象环肿瘤的同种异体移植

  1. 将毛细管浸入含有原代唾液腺成虫盘肿瘤的Schneider培养基中。按住填充按钮，使Schneider培养基充满玻璃毛细管，直至顶部0.5 cm段。该顶部区域应始终保持矿物油填充。
    注意：在按住填充按钮的同时，按下排空按钮一次，可加快此过程。
  2. 找到一个原代肿瘤，按住填充按钮，直至肿瘤被吸入毛细管内。
    1. 确保肿瘤位于毛细管尖端，或距离尖端数毫米处。这有助于避免肿瘤漂移并在毛细管内的溶液中丢失。参见图4A，了解肿瘤在毛细管中合适位置的示意图。
  3. 在显微镜载玻片的胶带上找到一只被固定的成年果蝇。使用镊子轻轻压住其下腹部，然后用毛细管刺穿腹部侧面的外骨骼。按下排空按钮，直至肿瘤进入新的宿主腹部。参见图4B，了解该技术的操作示意图。
  4. 使用镊子轻轻夹住宿主果蝇的翅膀，将其从胶带上取下。将宿主放入装有新鲜培养基的新试管中。注射后最初24小时，最好将试管水平放置。每支试管中最多放置20只果蝇。
    注意：部分宿主果蝇在注射后可能出现翅膀缺失或其他身体损伤，若试管直立放置，它们可能会粘附在培养基上。
  5. 重复步骤5.2至5.4，将剩余的原代肿瘤移植到新的成年宿主中。
  6. 将使用过的毛细管丢弃至锐器盒中，并在将仪器放回包装盒前，清除自动注射器外部残留的矿物油。
  7. 将宿主果蝇试管在室温下保存1天，然后转移至29 ˚C的培养箱中。每隔2-3天将果蝇宿主转移至新的试管中。
  8. 每天观察果蝇宿主，计算其存活率。一周后，可在配备荧光适配器的体视显微镜下观察到肿瘤，并可持续监测其大小和进展。

6. 移植肿瘤的再次异体移植

  1. 同种移植后约10-14天，使用荧光显微镜检测宿主腹部生长的肿瘤。
  2. 用CO2麻醉宿主，并将其置于盛有100 μL Schneider's培养基的解剖板中。使用两对镊子将生长的同种移植肿瘤从宿主体内解剖取出。
    1. 用一对镊子固定腹部，另一对镊子切开腹部角质层，暴露同种移植的肿瘤1。
    2. 在荧光标记的引导下，尽可能小心地将肿瘤从附着的宿主组织中分离。
  3. 重复步骤6.2，以准备另外两到三个同种移植肿瘤。
  4. 将含有收获肿瘤的解剖板转移至光学显微镜载物台上。
  5. 使用无菌针头将肿瘤切割成适合毛细管尺寸的小块。
  6. 重复步骤4.1-4.5以准备新一代成年宿主，并重复步骤5.1-5.7完成肿瘤的同种移植。
    注意：与原发性肿瘤相比，非原发性肿瘤的移植成功率通常更高。
  7. 在研究中使用的每一代后续果蝇中均重复步骤6.1-6.6。
    注意：应根据实验需求选择合适的Drosophila宿主品系。

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结果

本研究利用纳升级注射自动注射装置对唾液腺成虫盘肿瘤进行了代际异体移植，并使用共聚焦激光扫描显微镜进行后续的肿瘤活体成像，从而更深入地研究肿瘤生长、肿瘤细胞迁移以及肿瘤与宿主之间的相互作用。在固定果蝇时，将其粘附于显微镜载玻片上，并使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）块进行固定11。

图 5A 实时成像捕获了一个1st 第一代（G1）SG成虫盘环状肿瘤在异体移植后第10天于成年宿主腹部生长。该成像水平可用于追踪肿瘤分裂过程。 图5B 描绘了一个6th 第6代（G6）SG成虫盘环状肿瘤在异体移植后第10天占据宿主腹部的大部分区域。此阶段的成像有助于揭示肿瘤的生长模式及其迁移与侵袭行为。需要注意的是，尽管本图像使用共聚焦激光扫描显微镜拍摄，但也可根据肿瘤大小，采用配备GFP荧光适配器的体视显微镜在2倍至5倍放大倍数下进行观察。

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讨论

肿瘤异体移植有助于研究人员解决在黑腹果蝇（Drosophila）肿瘤生长与进展过程中出现的某些问题。其中一个挑战是避免携带肿瘤的幼虫或成虫在原代肿瘤培养期间过早死亡12。在此背景下，持续进行肿瘤异体移植可使肿瘤无限生长，从而便于开展关于肿瘤生长、转移及演化的纵向研究。肿瘤异体移植还适用于评估宿主-肿瘤相互作用的多个方面7,13。在进行肿瘤异体移植前，可对宿主基因型进行操控，以评估宿主对肿瘤生长和迁移以及肿瘤诱导的恶病质的影响14,15。具有不同基因型的果蝇宿主在面对相同肿瘤时，可能表现出不同的类似恶病质的消耗症状。异体移植后，可将携带肿瘤的宿主制备成标本，用于活体成像，相关操作方案经Koyama等和Ji等的方法改进而来11,16

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披露

作者之间无任何利益冲突需要声明。

致谢

感谢前实验室成员杨盛安博士和胡安-马丁·波蒂拉先生在本实验方案开发过程中所做的贡献。感谢北京大学生命科学学院宋艳实验室分享其手工异体移植实验方案。同时感谢卡尔德·埃尔斯沃思先生和埃弗雷斯特·夏皮罗先生对稿件的审阅和宝贵意见。

本研究获得了美国国立卫生研究院（https://www.nih.gov/）的资助（项目编号：GM072562、CA224381、CA227789） 以及美国国家科学基金会（htps://nsf.gov/）的资助（项目编号：IOS-155790）。 资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
共聚焦激光扫描显微镜ZeissLSM 980也称为 "Zeiss LSM 980"
玉米粉果蝇饲料Bloomington 果蝇保种中心N/A也称为 "BDSC 标准玉米粉饲料"
解剖针（30G×1/2）BD PrecisionGlide305106
解剖板Fisher Scientific12-565B
果蝇胶带Fisherbrand159015A
体视显微镜荧光适配器Electron Microscopy SciencesSFA-UV也称为 "NightSea 荧光适配器"
荧光显微镜Zeiss495015-0001-000也称为 "Zeiss Stereo Discovery.V8"
镊子Fine Science Tools11251-10也称为 "Dumont #5 镊子" 
玻璃毛细管（3.5英寸）Drummond3-000-203-G/X
胶水ElmerE305也称为 "Elmer 可水洗透明胶"
光学显微镜Zeiss435063-9010-100也称为 "Zeiss Stemi 305"
微电极拉制仪World Precision InstrumentsPUL-1000也称为 "四步微电极拉制仪"
纳升注射仪Drummond3-000-204也称为 "Nanoject II 自动纳升级注射器"
Schneider 培养基ThermoFisher21720001
注射器（27G×1/2）BD PrecisionGlide305109
小瓶FisherbrandAS507

参考文献

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