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方法文章

斑马鱼游泳过程中后侧线传入神经元的活动

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DOI：

10.3791/62233

⸱

2021年2月10日

 , 
1Department of Biology, University of Florida, The Whitney Laboratory for Marine Bioscience

本文内容

摘要

我们描述了一种在模式脊椎动物毛细胞系统中监测传入神经元活动在运动指令期间变化的实验方案。

摘要

感觉系统收集对指导行为至关重要的线索，但动物必须分辨出哪些信息具有生物学意义。运动会产生再感受性线索，动物必须将其与周围环境中相关的感官线索区分开来。例如，当鱼类游动时，身体波动产生的水流会被侧线系统中的机械感受性神经丘所检测，神经丘由毛细胞组成。随后，毛细胞通过感觉传入神经元将流体运动信息从感受器传递至大脑。与此同时，运动指令的伴随放电信号也会被传递至毛细胞，以防止感觉超载。因此，在评估侧线系统敏感性时，必须考虑运动信号预测性抑制效应的影响。我们开发了一种在体电生理方法，可同时记录斑马鱼幼鱼（受精后4-7天）的后侧线传入神经元和腹侧运动根活动，记录可持续数小时。传入神经元的胞外记录采用松贴式膜片钳技术实现，可检测单个或多个神经元的活动。腹侧运动根记录则通过皮肤使用玻璃电极检测运动神经元活动。本实验方案有望在完整且具有行为能力的脊椎动物中，监测不同运动行为过程中感觉输入的内源性或诱发性变化。

引言

机械感觉系统的传入神经元在听觉和平衡过程中将信息从毛细胞传递到大脑。通过直接记录，电生理学可以揭示传入神经元的敏感性。虽然对毛细胞进行全细胞膜片钳记录具有挑战性，但对下游传入神经元进行记录则更为容易，并且能够在受控刺激条件下评估动作电位的反应1,2,3。刺激毛细胞会导致其发生偏转，从而改变机械感觉结构，进而引发传入神经元动作电位（尖峰）的增加4,5,6。在没有外部刺激的情况下，由于毛细胞向传入神经后突触末梢发生谷氨酸泄漏，传入神经元也会产生自发性放电7,8，并且已被证明有助于维持系统的敏感性9,10。对传入神经活动进行膜片钳记录，能够观察到毛细胞的敏感性和信号动态变化，而这些是使用时间分辨率较低的技术（如微音器电位11,12或功能性钙成像13,14,15）所无法实现的。以下实验方案可用于同步记录传入神经活动与运动指令，以揭示毛细胞敏感性的瞬时变化。

斑马鱼（Danio rerio）利用侧线系统中的感觉毛细胞来感知相对于其身体的水流，这种感知被转化为神经信号，对导航16,17,18、躲避捕食者、捕食19,20以及群游行为21至关重要。水流也可能由游泳22,23,24、呼吸22,25,26和摄食27等自身运动产生。这些行为包含重复性动作，可能导致毛细胞疲劳并削弱感知能力。因此，侧线系统必须能够区分外部（传入性）和自身产生的（再传入性）水流刺激。在斑马鱼运动过程中，伴随放电信号会抑制自身产生的水流信号。这种抑制性的预测性运动信号通过下行神经元传递至感觉受体，以调节输入或中断对再传入反馈的处理28,29。早期对这一前馈系统理解的关键研究依赖于体外制备模型，其中神经回路的连接性和内源性活动未能得以维持28,30,31,32,33,34,35。本实验方案描述了一种保持完整神经回路的方法，维持内源性反馈动态，从而更深入地在活体条件下理解伴随放电机制。

本方案描述了如何在斑马鱼幼鱼中同时监测后侧线传入神经元和运动神经元的活动。在运动指令发生之前、期间和之后对传入信号动态进行表征，有助于揭示中枢神经系统在运动过程中调节毛细胞敏感性的实时内源性反馈机制。本方案列出了实验前所需准备的材料，并详细说明了斑马鱼幼鱼的麻痹与制备方法。此外，方案还介绍了如何建立稳定的传入神经元松散贴附记录以及运动神经元的腹根（VR）细胞外记录。文中展示了一个代表性个体利用该方案获得的数据，并对多个实验重复样本进行了分析。数据预处理采用MATLAB编写的自定义脚本完成。总体而言，这一活体实验范式有望加深我们对模式脊椎动物毛细胞系统在运动过程中感觉反馈机制的理解。

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方案

所有动物护理和实验均按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。

1. 电生理记录所需材料的准备

  1. 制作硅胶弹性体底部的记录皿。
    1. 将一层薄薄的自混合型硅胶弹性体组分（例如 Sylgard） dispense 至带有盖玻片底部的组织培养皿中，直至其液面与浅井边缘齐平。约 0.5 mL 即可。
    2. 盖上盖子，并在室温下固化至少 48 小时。
  2. 制备解剖针。
    1. 使用直流电源为盛有蚀刻剂（3M KOH）的 100 mL 烧杯提供负电荷（5 V），并将一根钨丝（直径 0.002 英寸；50.8 µm）连接至正极输出端。
      ​警告：在此过程中，正极和负极导线不得相互接触，否则可能产生火花，存在潜在火灾风险。
    2. 通过快速反复地将钨丝尖端浸入蚀刻液中进行蚀刻，直至尖端变细成锐利的点状。在体视显微镜下，使用直边剃刀刀片从尖端起约 1 mm 处切断钨丝。重复此操作三次，然后使用精细镊子将针插入已固化的记录皿中。
  3. 准备记录电极。
    1. 使用水平微电极拉制仪和盒式灯丝，将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.86 mm，外径：1.50 mm）拉制成尖端直径为 30 µm、轻微锥形的电极（图 1 Ai），用于记录后侧线传入神经元。
    2. 另取一根硼硅酸盐玻璃毛细管，拉制成一对尖端直径更小（1–5 µm）的电极。双手各持一个电极，轻轻使两个尖端相互划过，使其断裂成约 30° 的斜角。使用微电极抛光仪将斜面尖端抛光至光滑。最终尖端直径应在 30–50 µm 之间，作为腹根（VR）记录电极使用（图 1 Aii）。
    3. 用永久性墨水在 VR 电极的前缘一侧做标记，以便在将电极插入前置放大器头段的移液管夹持器时（步骤 3.2），帮助确定尖端开口朝下。
      ​注意：VR 记录电极的机械修整精度较低，步骤 1.3.2 可能需要多次尝试，直至获得合适的尖端形态后再进行抛光。VR 记录电极的斜面设计是为了贴合幼体的身体曲率。一旦制备完成，只要实验间保持尖端通畅清洁，该 VR 记录电极可重复使用。
  4. 在电生理记录程序中生成记录协议。
    1. 确保右侧头段连接至微电极电流与电压钳放大器背面的 通道 1 输入端，用于传入神经元记录；左侧头段连接至 通道 2 输入端，用于 VR 记录。
      注意：电流与电压钳放大器的计算机最低配置要求为：处理器 1 GHz 或更高，Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6 操作系统，CD-ROM 驱动器，512 MB 内存，500 MB 硬盘空间，以及 2 个 USB 接口。
    2. 打开计算机控制的放大器软件。
    3. 点击每个通道的 IC 按钮，将 通道 1 和 通道 2 设置为电流钳模式。
    4. 在 I-Clamp 1 和 I-Clamp 2 两个标签页下输入以下参数：主输出：100x 交流膜电位（100,000 mV/mV），增益：1,000，Bessel：1 kHz，AC：300 Hz，示波器：旁路；次级输出：100x 交流膜电位（100 mV/mV），增益：1，低通滤波器：10 Hz。
    5. 将通道参数分别保存为 Ch1_Aff 和 Ch2_VR。
    6. 安装并打开膜片钳电生理软件。
    7. 点击 配置，选择 实验台，通过添加 Ch1_Aff 和 Ch2_Vr 到 数字化仪通道（例如 Analog IN #0 和 Analog IN #1）来设置模拟信号，这些通道通过 BNC 同轴电缆连接至放大器相应的 通道 1 和 通道 2 标度输出。点击 确定。
      ​注意：数字化仪的最低计算机要求为：处理器 1 GHz 或更高，Windows XP Pro 或 Mac OS X 10.46.6 操作系统，CD-ROM 驱动器，512 MB 内存，500 MB 硬盘空间，以及 2 个 USB 接口。
    8. 点击 采集，选择 新建协议。
    9. 在 模式/速率 标签页中，选择 连续采集；在 采集模式 下，将 试验时长 设置为 使用可用磁盘空间（即持续记录直至手动停止）或设定一个期望的 持续时间（hh:mm:ss），然后将 每信号采样率（Hz） 设置为 20,000 以最大化分辨率。
    10. 在 输入 标签页下，选择先前已配置的 模拟输入通道（步骤 1.4.6 中设置），并为对应通道选择 Ch1_Aff 和 Ch2_VR。
    11. 在 输出 标签页下，分别为 通道 #0 和 通道 #1 选择 Cmd 0 和 Cmd 1。
      1. 通过 BNC 同轴电缆将放大器上的通道 1 命令输出连接至数字化仪的模拟输出 0，同样将通道 2 命令连接至模拟输出 1。
    12. 其余标签页可保持默认设置。点击 确定 并保存该协议。

2. 溶液配制

  1. 配制 Hank's 溶液：137 mM NaCl、5.4 mM KCl、0.25 mM Na2HPO4、0.44 mM KH2PO4、1.3 mM CaCl2、1.0 mM MgSO4、4.2 mM NaHCO4；pH 调至 7.3。用去离子水将储备液稀释至 10% 的 Hank's 溶液。
  2. 配制细胞外溶液：134 mM NaCl、2.9 mM KCl、1.2 mM MgCl2、2.1 mM CaCl2、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES 缓冲液；用 NaOH 调节 pH 至 7.8。使用孔径为 0.22 µm 的滤器对细胞外溶液进行真空过滤。
  3. 配制 α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）：将 1 mg 冻干的 α-银环蛇毒素溶于 10 mL 细胞外溶液中，制成 0.1% 的稀释液。
  4. 配制安乐死溶液：在 10% Hank's 溶液中配制含 50%（mg/L）缓冲的药用级 MS-222 溶液。
    警告：α-银环蛇毒素是一种强效神经毒素，可通过阻断胆碱能受体引起肌肉麻痹。操作此类麻痹性物质时必须佩戴手套，建议佩戴护目镜。

3. 电生理记录用幼虫的制备

  1. 固定斑马鱼幼体。
    1. 使用实验室培育的斑马鱼（Danio rerio；受精后4-7天）幼体，将其饲养于胚胎溶液（10% Hank's溶液）中，温度维持在27 °C。
    2. 用带大口径吸头的移液器将幼体从饲养容器转移至小型培养皿（35 mm）中，并尽可能去除周围溶液。
      注意：去除胚胎溶液可防止麻痹剂被稀释，从而提高其效果。可用实验擦拭纸的角落吸除残留的胚胎溶液，操作时切勿接触幼体，也避免使幼体暴露于空气中。
    3. 将幼体浸入10 µL的0.1% α-银环蛇毒素中，约5分钟。
      注意：使幼体完全固定所需时间因样本而异。一个健康的样本应持续保持较快的血流并出现运动反应减弱。即使经过充分冲洗，短暂过度暴露于麻痹剂也可能导致样本整体健康状况缓慢下降。最佳操作是在幼体尚未完全固定、但仍表现出轻微肌肉震颤时即开始冲洗。
    4. 用细胞外溶液冲洗已麻痹的幼体，并浸泡10分钟。
      注意：冲洗过程可使幼体从轻微肌肉震颤过渡至完全麻痹。此外，α-银环蛇毒素是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）α9亚基的拮抗剂，而该亚基是本实验所观察的内源性反馈回路的关键组成部分；然而，已有研究表明，在Xenopus和斑马鱼毛细胞中，经过10分钟的冲洗后，这种效应是可逆的36,29。
  2. 将鱼固定在记录用培养皿中。
    注意：在处理斑马鱼幼体（4-7日龄）时无需使用麻醉剂（如MS-222、Tricaine），因其可能影响动物健康。事实上，斑马鱼幼体在某些脊椎动物实验规程中可被豁免。
    1. 使用移液器将幼体从细胞外溶液中转移至底部为硅胶的记录用培养皿中，并将培养皿其余部分充满细胞外溶液。
    2. 在体视显微镜下，用尖头镊子轻轻将幼体置于硅胶垫中央上方，使其侧面向上，身体前端和后端分别朝向左和右。然后用尖头镊子夹取硅胶垫上的刻痕针，将针垂直插入幼体肛门正上方的背部脊索中。将第二根针插入尾部末端附近的脊索，第三根针插入鳔背侧的脊索（图1B）。
      注意：插入针时应准确对准脊索宽度的中心，以避免压迫血流或损伤周围肌肉组织。脊索位于后侧线神经的背侧，因此若正确固定，预期不会损伤侧线感觉神经元。针插入时应在首次接触后立即停止，以免扰动周围组织。理想情况下，针的直径应小于脊索宽度的一半，以确保顺利插入。若针过粗，请重复步骤1.2，直至获得合适直径的针。若固定后血流减慢，应更换新样本并从步骤1.3开始重复操作。
    3. 插入第四根针时，穿过耳囊并同时在针进入包埋介质时轻微向头部方向旋转（图1B）。当施加轻微旋转时，注意观察肩胛骨与耳囊之间的组织，以暴露传入神经元胞体的聚集区域。
      ​注意：第四根针的斜向插入是为了充分暴露后侧线传入神经节，否则该结构会被较大的耳囊遮挡。

4. 腹根记录

  1. 将固定好的幼虫置于倒置的微分干涉差（DIC）显微镜的固定载物台上，使用10倍水浸物镜，并调整肌节间隔的方向，使其与左侧头架的接近方向平行（图1B）。
    1. 将固定载物台的DIC显微镜放置在光学气浮台上，以最大程度减少振动对记录的干扰。通过使用电动定位器，显微镜可在固定载物台周围自由移动，而标本和头架则安装在该载物台上（图1C）。
    2. 将接地导线插入浴液中，并确保其连接至左侧头架。
  2. 使用柔性凝胶加样枪头，向VR记录电极中加入30 µL细胞外溶液，并将其插入左侧头架的移液管夹持器中。
  3. 使用显微操作器将记录电极缓慢下放至培养皿溶液中，同时通过气动换能器施加正压（1–2 mmHg）。在10倍放大倍数下，确认电极尖端开口朝下。
    1. 气动换能器应通过硅胶管连接至移液管夹持器的接口。
  4. 将VR电极放置于肌隔上
    1. 再次使用显微操作器，将VR电极尖端缓慢下放，直至其稳定地位于幼虫上方。将放大倍数提高至40倍浸油物镜。
    2. 将电极尖端移至侧线腹侧两个肌节之间的肌隔上方，直至肌隔位于VR电极尖端开口的中心位置（图1D）。
    3. 继续下放移液管，使尖端开口的后缘轻轻接触上皮组织。初次接触后，以对角线方向微调移液管，确保前缘充分接触并可形成封接。
    4. 使用气动换能器施加负压（约100 mmHg），并保持该压力。
      注：VR移液管相对于肌隔的正确取向以及持续的负压，有助于通过皮肤以高信噪比有效检测运动神经元活动。
  5. 检测运动神经元活动。
    1. 左侧头架应连接至放大器，放大器将信号传递至数字化仪，再输出至膜片钳电生理软件，以便在相邻计算机上实时监测（见第1.4节）。
    2. 在膜片钳软件中，点击工具栏上的“播放”按钮以开始监测VR信号（图1E）。
    3. 当观察到具有典型爆发性信号动态特征的运动神经元活动时，即可确认VR记录成功29,37（图1E）。
      ​注：虚拟游泳行为（fictive swim bouts）是指在标本处于麻痹状态下仍持续传递的VR运动神经元活动模式。因此，虚拟游泳是评估动物行为状态和测量运动参数的有效手段，同时可进行需要固定标本的传入神经元记录。据我们经验，一旦获得稳定的VR记录，健康的标本通常每隔数秒会自发产生一次虚拟游泳事件。请注意，健康标本应维持快速的血液流动。需注意的是，获得足够强度的VR信号可能需要数分钟时间，且初始检测后信噪比可能进一步改善。为节省时间，可在确认信号后直接进入第5节操作。
    4. 若完成第5节后仍未获得VR记录，可释放负压，抬起电极，并在幼虫状态仍良好的情况下，选择另一肌隔从步骤4.4.2开始重复操作。

5. 传入神经元记录

  1. 用 30 µL 细胞外溶液填充传入神经记录电极；插入右侧头级移液管支架（图 1B、C），并在施加由气动换能器产生的正压（1–2 mm Hg）的同时将其缓慢浸入培养皿溶液中。
  2. 定位并松散地附着于后侧线传入神经节。
    1. 使用显微操作器，降低传入神经电极尖端，直至其位于锁骨上方并保持稳定位置。
    2. 将放大倍数增加至 40 倍浸油物镜，找到后侧线神经与锁骨的交汇处。从锁骨处沿侧线神经向前追踪，直至观察到神经纤维支配的后侧线传入神经节，该神经节可通过其明显的胞体簇进行识别（图 1F）。
    3. 将电极尖端移至传入神经节上方，并缓慢下降移液管，直至尖端接触上皮层。轻柔地调整电极位置，使整个尖端边缘均与传入神经节接触。
    4. 使用气动换能器施加负压（20–50 mm Hg）并保持稳定。
      注意：施加于传入神经节的负压应比腹根记录时的吸力更轻柔。适当增加负压可改善信噪比，但持续较强的负压会损害传入神经元的健康状态，从而降低成功记录的概率。
  3. 记录传入神经元活动。
    1. 确保右侧头级的连接顺序与步骤 4.5.1 中所述相似。
    2. 在 pClamp10 软件中，点击工具栏上的 播放 按钮，以同时监测传入神经元和 VR 信号。
    3. 当出现自发性动作电位（大约每 100–200 ms 一次）时，确认已成功实现传入神经元的全细胞松散贴附记录模式（图 1E）1，29。
    4. 逐渐将传入神经元记录电极的压力恢复至大气压（0 mm Hg），并在后续记录过程中保持该状态。

6. 数据采集

  1. 同时记录。
    1. 当检测到传入神经元和运动神经元均有活动时，点击 pClamp10 工具栏上的 Record 按钮，以在两个通道中同时采集无间隙记录数据。
    2. 按所需时长进行记录（图 1E）。
      ​注意：在状态良好的制备样本中，记录可持续数小时，并仍能对外部刺激保持反应。
    3. 将记录保存为支持的文件格式（.abf，pClamp10），以保留采集参数等元数据。

7. 安乐死

  1. 使用气动换能器对传入和VR记录电极施加正压（10 mm Hg），并通过显微操作器将电极从记录皿中抬起。
  2. 将记录皿从固定式微分干涉相差（DIC）显微镜转移至解剖体视显微镜。
  3. 使用精细尖头镊子移除脊索和耳囊中的钨针，并用移液器将幼虫转移至含有5 mL安乐死溶液的培养皿（35 mm）中，静置至少5分钟。

8. 预处理与数据分析

注意：数据预处理与分析需要具备命令行编码的基础知识。

  1. 转换记录文件以进行预处理。
    1. 安装 Matlab 软件。
    2. 下载作者自定义编写的脚本 abfload.m38，并将该文件保存到与原始记录文件相同的文件夹中。
    3. 在 Matlab 编辑器 窗口中打开 abfload.m，然后点击工具栏上的 运行。如果系统提示，请选择 更改文件夹。
    4. 在 命令窗口 中执行函数，将原始记录文件作为输入，
      > [d,si,h] = abfload('[原始记录文件名].abf')
      并将输出工作区保存为包含幼虫编号、年龄和实验日期的文件名，例如 [样本编号]_[日龄 dpf]_[原始记录文件名（默认包含实验日期）]。
      ​注意：转换后的文件名应仅包含以下划线分隔的整数。
  2. 执行数据预处理。
    1. 下载作者自定义编写的 Matlab 脚本 AffVR_preprocess.m 及其相关函数。
    2. 在 编辑器 窗口中打开 AffVR_preprocess.m。
    3. 在 变量 部分，根据信噪比调整传入神经和腹根（VR）记录的脉冲检测下限阈值（分别为第 8 行和第 14 行的 spk_detect_lb 和 vr_detect_lb）。
      注意：脉冲检测依赖于手动设定阈值，通过幅度对来自多个传入神经元的信号进行分类和分离。通过设定阈值滤除基线噪声和其他神经元单位的活动，仅保留最大幅度一定百分比范围内的脉冲幅度（例如 spk_detect_lb 和 spk_detect_ub）。阈值设定还有助于将运动活动脉冲准确地归类为簇状放电和整体虚拟游泳行为。通常，可先从 0.5 的阈值下限开始，逐步降低直至实现准确检测。例如，将 spk_detect_lb 设为 0.5，spk_detect_ub 设为 1.0，可检测所有等于或大于最大脉冲幅度 50% 的脉冲，并排除幅度更低的噪声或其他神经元信号（图 2A）。或者，也可将 spk_detect_ub 从 1.0 降低，以排除幅度更高的神经元，从而分离出幅度较低的神经元。预处理生成的图示输出（见步骤 7.2.6）将提示是否需要调整参数并从步骤 7.2.2 重新开始。
    4. 在 编辑器 窗口中点击 运行，以执行 AffVR_preprocess.m。
    5. 导航至先前转换的 .mat 数据文件（见步骤 7.1.3）；选择并点击 打开 以开始自动预处理。
      注意：在自定义脚本运行期间，命令窗口 中将显示处理进度信息，例如 "正在滤波数据 …"、"正在检测腹根活动 …" 和 "正在生成图示 …"。
    6. AffVR_preprocess.m 生成的图示将可视化传入神经脉冲和腹根信号的检测结果，并提示是否需要调整任何分析参数（图 2）。
    7. 在键盘上输入 "Y"，以将预处理后的元数据保存到 preprocess_output 文件夹中。
    8. 预处理后的数据将自动输出为 data_out.xls 文件。
  3. 根据需要分析预处理后的数据。

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结果

在斑马鱼幼鱼被适当固定并成功实现后侧线传入神经节和腹根（VR）记录后，可同时测量传入神经元和运动神经元的活动。使用无间隙记录程序（步骤1.4）显示记录通道，以持续监测传入神经和VR的活动。实时观察可见，自发性传入神经放电频率的下降与VR活动同步发生，后者提示存在拟态游泳发作活动。图1E）。我们发现，最佳结果和准确的峰电位检测依赖于达到至少0.5信噪比的记录。自行编写的预处理脚本可生成图表，以辅助传入神经和腹根（VR）峰电位检测的可视化。自发性传入峰电位通过结合多种峰电位参数进行识别，包括阈值、最小持续时间（0.01 ms）和最小峰间间隔（ISI；1 ms）。在建立记录过程中，随着负压的增加，常可同时检测到来自多个传入神经单位的信号。通过按振幅过滤，可区分独立传入神经信号的动力学特征。通过调整预处理脚本中的下限和上限检测变量，可实现对信号的分离。图2A）。通过强吸引力获取多单位记录可能导致记录不稳定、机械噪声、传入神经健康状况恶化，最终导致信号丢失。因此，在获得理想信号后，应缓慢减小吸力至大气压。腹根尖峰检测的参数与传入...

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讨论

本文所述实验方案有望在完整且具有行为能力的脊椎动物中监测感觉输入在不同运动行为期间的内源性变化。具体而言，该方案详述了一种在体方法，用于对幼年斑马鱼的侧线传入神经元和腹侧运动神经根进行同步细胞外记录。此前对斑马鱼传入神经自发活动的研究并未考虑可能同时发生的运动活动1,2,39,40,41。若不通过腹侧神经根记录来监测运动活动的存在，由于传出抑制作用在自发游泳期间甚至之后均会产生影响，传入活动的解析结果很可能会被低估。

在体电生理记录本质上具有挑战性。根据我们的经验，保持制备样本的健康状态是成功获得传入神经元和腹侧运动根长期记录的最关键因素。为此，不仅需要识别和监测快速的血流，还需辨认皮肤及其下层肌肉组织的质地。我们建议在进一步操作前，在显微镜下观察数条麻痹的幼...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们衷心感谢美国国立卫生研究院（DC010809）、美国国家科学基金会（IOS1257150、1856237）以及惠特尼海洋生物科学实验室对J.C.L.的支持。 我们感谢Liao实验室历届和现任成员所提出的富有启发性的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 mL 烧杯PYREX1000蚀刻剂容器
10倍水浸物镜奥林巴斯UMPLFLN10xW低倍镜用于定位幼虫和记录电极
40倍水浸物镜OlympusLUMPLFLN40XW高倍镜下定位电极尖端并建立膜片钳
abfload.m补充编码文件用于将原始电生理记录数据转换为 .mat 文件的自定义 MATLAB 脚本
AffVR_preprocess.m补充编码文件用于预处理记录数据的自定义 MATLAB 脚本
BNC同轴电缆ThorLabs2249-C-12连接放大器与数字化仪通道；需要 4 个
带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管Warner InstrumentsG150F-3内径：0.86，外径：1.50；用于制备记录电极的毛细玻璃管
burst_detect补充编码文件运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数
计算机N/AN/A任何计算机均可使用
直流电源天马72-420用于电蚀刻解剖针
电生理学数字转换器Axon Instruments, Molecular DevicesAxon DigiData 1440A实现膜片钳数据的采集
丝状物Sutter Instrument CompanyFB255B微管拉制仪中使用的2.5 mm盒装灯丝
精细镊子Fine Science ToolsDumont #5（0.05 × 0.02 mm）货号 11295-10用于操作幼虫和插入针具
固定载物台微分干涉相差显微镜OlympusBX51WI用于观察和建立膜片钳记录的显微镜
柔性锥形移液管吸头Fisher Scientific02-707-169柔性尖端可插入记录电极，以便在尖端处释放细胞外溶液
FluoroDishWorld Precision Instruments 公司FD3510-100盖玻片底部培养皿 记录皿
KimWipeKimTech34155用于吸除幼虫多余液体的任务擦拭工具
Kwik-GardWorld Precision Instruments 公司710172自混合Sylgard弹性体
MATLABMathWorksR2020b用于预处理数据的命令行软件
微电极放大器Axon Instruments，Molecular DevicesMultiClamp 700B用于双通道记录的膜片钳放大器
微操作仪NarishigeMF-830 显微操作仪抛光记录电极
显微操作仪控制单元锡斯基尤MC1000-eR/T用于控制显微操作仪的四轴旋钮控制器
微移液器拉制仪Sutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97用于将毛细玻璃管拉制成记录电极
显微镜控制单元锡斯基尤MC1000e将显微镜置于固定载物台及其制备样品周围
电动显微操作器锡斯基尤MX7600放置头阶段及相连的记录电极以进行膜片钳记录
MultiClamp CommanderMolecular Devices2.2.2可从 Axon MultiClamp 700B Commander 下载页面获取
光学气浮平台Newport CorporationVH3036W-OPT面包板隔振台用于悬浮显微镜，以在记录过程中最大限度减少振动
pCLAMPMolecular Devices10.7.0可从 Axon pCLAMP 10 膜片钳数据采集系统下载 &分析软件下载页面
永久性记号笔记号笔从亚马逊网站购买用于标记VR电极的前端侧面，以确保插入移液管支架时方向正确
培养皿Falcon35-3001用于将幼虫浸入麻痹剂中
移液器架Molecular Devices1-HL-U手持记录电极并连接至前置放大器
气动换能器福禄克生物医学仪器DPM1B用于控制记录电极内部压力
氢氧化钾Sigma-Aldrich221473-25G用于蚀刻解剖针的蚀刻剂
硅胶管Tygon14-169-1A连接气动换能器与移液管支架的管路
spike_detect补充编码文件运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数
体视显微镜卡尔·蔡司Stemi 2000-C用于观察针尖以及幼虫制备过程中
直边剃须刀片Canopus从亚马逊网站购买在制作解剖针时切割钨丝
swimbout_detect补充编码文件运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数
注射器Becton Dickinson 公司309602用细胞外液填充以注入记录电极
移液管Sigma-AldrichZ135003-500EA一次性非无菌移液管，用于转移幼虫
三卡因甲磺酸盐辛德尔12854用于通过高剂量使幼虫安乐死的药用麻醉剂。
钨丝World Precision Instruments 公司7155000.002 英寸，50.8 μ微米直径；用于制作解剖针
真空过滤装置Sigma-AldrichSCGVU11RE一次性无菌真空过滤装置，用于电生理电极任氏液中细胞外溶液的无菌过滤
电压钳-电流钳前置放大器Molecular DevicesCV-7B配备用于左臂和右臂记录的MultiClamp 700B放大器头级
α-bungarotoxinThermoFisherB1601用于在记录前固定幼虫

参考文献

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