我们描述了一种在模式脊椎动物毛细胞系统中监测传入神经元活动在运动指令期间变化的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
感觉系统收集对指导行为至关重要的线索，但动物必须分辨出哪些信息具有生物学意义。运动会产生再感受性线索，动物必须将其与周围环境中相关的感官线索区分开来。例如，当鱼类游动时，身体波动产生的水流会被侧线系统中的机械感受性神经丘所检测，神经丘由毛细胞组成。随后，毛细胞通过感觉传入神经元将流体运动信息从感受器传递至大脑。与此同时，运动指令的伴随放电信号也会被传递至毛细胞，以防止感觉超载。因此，在评估侧线系统敏感性时，必须考虑运动信号预测性抑制效应的影响。我们开发了一种在体电生理方法，可同时记录斑马鱼幼鱼（受精后4-7天）的后侧线传入神经元和腹侧运动根活动，记录可持续数小时。传入神经元的胞外记录采用松贴式膜片钳技术实现，可检测单个或多个神经元的活动。腹侧运动根记录则通过皮肤使用玻璃电极检测运动神经元活动。本实验方案有望在完整且具有行为能力的脊椎动物中，监测不同运动行为过程中感觉输入的内源性或诱发性变化。
引言
机械感觉系统的传入神经元在听觉和平衡过程中将信息从毛细胞传递到大脑。通过直接记录，电生理学可以揭示传入神经元的敏感性。虽然对毛细胞进行全细胞膜片钳记录具有挑战性，但对下游传入神经元进行记录则更为容易，并且能够在受控刺激条件下评估动作电位的反应1,2,3。刺激毛细胞会导致其发生偏转，从而改变机械感觉结构，进而引发传入神经元动作电位（尖峰）的增加4,5,6。在没有外部刺激的情况下，由于毛细胞向传入神经后突触末梢发生谷氨酸泄漏，传入神经元也会产生自发性放电7,8，并且已被证明有助于维持系统的敏感性9,10。对传入神经活动进行膜片钳记录，能够观察到毛细胞的敏感性和信号动态变化，而这些是使用时间分辨率较低的技术（如微音器电位11,12<....
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方案
所有动物护理和实验均按照佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会批准的方案进行。
1. 电生理记录所需材料的准备
- 制作硅胶弹性体底部的记录皿。
- 将一层薄薄的自混合型硅胶弹性体组分（例如 Sylgard） dispense 至带有盖玻片底部的组织培养皿中，直至其液面与浅井边缘齐平。约 0.5 mL 即可。
- 盖上盖子，并在室温下固化至少 48 小时。
- 制备解剖针。
- 使用直流电源为盛有蚀刻剂（3M KOH）的 100 mL 烧杯提供负电荷（5 V），并将一根钨丝（直径 0.002 英寸；50.8 µm）连接至正极输出端。
警告：在此过程中，正极和负极导线不得相互接触，否则可能产生火花，存在潜在火灾风险。 - 通过快速反复地将钨丝尖端浸入蚀刻液中进行蚀刻，直至尖端变细成锐利的点状。在体视显微镜下，使用直边剃刀刀片从尖端起约 1 mm 处切断钨丝。重复此操作三次，然后使用精细镊子将针插入已固化的记录皿中。
- 使用直流电源为盛有蚀刻剂（3M KOH）的 100 mL 烧杯提供负电荷（5 V），并将一根钨丝（直径 0.002 英寸；50.8 µm）连接至正极输出端。
- 准备记录电极。
- 使用水平微电极拉制仪和盒式灯丝，将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（内径：0.86 mm，外径：1.50 mm）拉制成尖端直径为 30 µm、轻微锥形的电极（图 1....
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结果
在斑马鱼幼鱼被适当固定并成功实现后侧线传入神经节和腹根（VR）记录后，可同时测量传入神经元和运动神经元的活动。使用无间隙记录程序（步骤1.4）显示记录通道，以持续监测传入神经和VR的活动。实时观察可见，自发性传入神经放电频率的下降与VR活动同步发生，后者提示存在拟态游泳发作活动。图1E）。我们发现，最佳结果和准确的峰电位检测依赖于达到至少0.5信噪比的记录。自行编写的预处理脚本可生成图表，以辅助传入神经和腹根（VR）峰电位检测的可视化。自发性传入峰电位通过结合多种峰电位参数进行识别，包括阈值、最小持续时间（0.01 ms）和最小峰间间隔（ISI；1 ms）。在建立记录过程中，随着负压的增加，常可同时检测到来自多个传入神经单位的信号。通过按振幅过滤，可区分独立传入神经信号的动力学特征。通过调整预处理脚本中的下限和上限检测变量，可实现对信号的分离。图2A）。通过强吸引力获取多单位记录可能导致记录不稳定、机械噪声、传入神经健康状况恶化，最终导致信号丢失。因此，在获得理想信号后，应缓慢减小吸力至大气压。腹根尖峰检测的参数与传入.......
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讨论
本文所述实验方案有望在完整且具有行为能力的脊椎动物中监测感觉输入在不同运动行为期间的内源性变化。具体而言，该方案详述了一种在体方法，用于对幼年斑马鱼的侧线传入神经元和腹侧运动神经根进行同步细胞外记录。此前对斑马鱼传入神经自发活动的研究并未考虑可能同时发生的运动活动1,2,39,40,41。若不通过腹侧神经根记录来监测运动活动的存在，由于传出抑制作用在自发游泳期间甚至之后均会产生影响，传入活动的解析结果很可能会被低估。
在体电生理记录本质上具有挑战性。根据我们的经验，保持制备样本的健康状态是成功获得传入神经元和腹侧运动根长期记录的最关键因素。为此，不仅需要识别和监测快速的血流，还需辨认皮肤及其下层肌肉组织的质地。我们建议在进一步操作前，在显微镜下观察数条麻痹的幼.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院（DC010809）、美国国家科学基金会（IOS1257150、1856237）以及惠特尼海洋生物科学实验室对J.C.L.的支持。 我们感谢Liao实验室历届和现任成员所提出的富有启发性的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100 mL 烧杯 | PYREX | 1000 | 蚀刻剂容器 |
| 10倍水浸物镜 | 奥林巴斯 | UMPLFLN10xW | 低倍镜用于定位幼虫和记录电极 |
| 40倍水浸物镜 | Olympus | LUMPLFLN40XW | 高倍镜下定位电极尖端并建立膜片钳 |
| abfload.m | 补充编码文件 | 用于将原始电生理记录数据转换为 .mat 文件的自定义 MATLAB 脚本 | |
| AffVR_preprocess.m | 补充编码文件 | 用于预处理记录数据的自定义 MATLAB 脚本 | |
| BNC同轴电缆 | ThorLabs | 2249-C-12 | 连接放大器与数字化仪通道；需要 4 个 |
| 带细丝的硼硅酸盐玻璃毛细管 | Warner Instruments | G150F-3 | 内径：0.86，外径：1.50；用于制备记录电极的毛细玻璃管 |
| burst_detect | 补充编码文件 | 运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数 | |
| 计算机 | N/A | N/A | 任何计算机均可使用 |
| 直流电源 | 天马 | 72-420 | 用于电蚀刻解剖针 |
| 电生理学数字转换器 | Axon Instruments, Molecular Devices | Axon DigiData 1440A | 实现膜片钳数据的采集 |
| 丝状物 | Sutter Instrument Company | FB255B | 微管拉制仪中使用的2.5 mm盒装灯丝 |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | Dumont #5（0.05 × 0.02 mm）货号 11295-10 | 用于操作幼虫和插入针具 |
| 固定载物台微分干涉相差显微镜 | Olympus | BX51WI | 用于观察和建立膜片钳记录的显微镜 |
| 柔性锥形移液管吸头 | Fisher Scientific | 02-707-169 | 柔性尖端可插入记录电极，以便在尖端处释放细胞外溶液 |
| FluoroDish | World Precision Instruments 公司 | FD3510-100 | 盖玻片底部培养皿 记录皿 |
| KimWipe | KimTech | 34155 | 用于吸除幼虫多余液体的任务擦拭工具 |
| Kwik-Gard | World Precision Instruments 公司 | 710172 | 自混合Sylgard弹性体 |
| MATLAB | MathWorks | R2020b | 用于预处理数据的命令行软件 |
| 微电极放大器 | Axon Instruments，Molecular Devices | MultiClamp 700B | 用于双通道记录的膜片钳放大器 |
| 微操作仪 | Narishige | MF-830 显微操作仪 | 抛光记录电极 |
| 显微操作仪控制单元 | 锡斯基尤 | MC1000-eR/T | 用于控制显微操作仪的四轴旋钮控制器 |
| 微移液器拉制仪 | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | 用于将毛细玻璃管拉制成记录电极 |
| 显微镜控制单元 | 锡斯基尤 | MC1000e | 将显微镜置于固定载物台及其制备样品周围 |
| 电动显微操作器 | 锡斯基尤 | MX7600 | 放置头阶段及相连的记录电极以进行膜片钳记录 |
| MultiClamp Commander | Molecular Devices | 2.2.2 | 可从 Axon MultiClamp 700B Commander 下载页面获取 |
| 光学气浮平台 | Newport Corporation | VH3036W-OPT | 面包板隔振台用于悬浮显微镜，以在记录过程中最大限度减少振动 |
| pCLAMP | Molecular Devices | 10.7.0 | 可从 Axon pCLAMP 10 膜片钳数据采集系统下载 &分析软件下载页面 |
| 永久性记号笔 | 记号笔 | 从亚马逊网站购买 | 用于标记VR电极的前端侧面，以确保插入移液管支架时方向正确 |
| 培养皿 | Falcon | 35-3001 | 用于将幼虫浸入麻痹剂中 |
| 移液器架 | Molecular Devices | 1-HL-U | 手持记录电极并连接至前置放大器 |
| 气动换能器 | 福禄克生物医学仪器 | DPM1B | 用于控制记录电极内部压力 |
| 氢氧化钾 | Sigma-Aldrich | 221473-25G | 用于蚀刻解剖针的蚀刻剂 |
| 硅胶管 | Tygon | 14-169-1A | 连接气动换能器与移液管支架的管路 |
| spike_detect | 补充编码文件 | 运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数 | |
| 体视显微镜 | 卡尔·蔡司 | Stemi 2000-C | 用于观察针尖以及幼虫制备过程中 |
| 直边剃须刀片 | Canopus | 从亚马逊网站购买 | 在制作解剖针时切割钨丝 |
| swimbout_detect | 补充编码文件 | 运行 AffVR_preprocess.m 所需的自定义编写的 MATLAB 函数 | |
| 注射器 | Becton Dickinson 公司 | 309602 | 用细胞外液填充以注入记录电极 |
| 移液管 | Sigma-Aldrich | Z135003-500EA | 一次性非无菌移液管，用于转移幼虫 |
| 三卡因甲磺酸盐 | 辛德尔 | 12854 | 用于通过高剂量使幼虫安乐死的药用麻醉剂。 |
| 钨丝 | World Precision Instruments 公司 | 715500 | 0.002 英寸，50.8 μ微米直径；用于制作解剖针 |
| 真空过滤装置 | Sigma-Aldrich | SCGVU11RE | 一次性无菌真空过滤装置，用于电生理电极任氏液中细胞外溶液的无菌过滤 |
| 电压钳-电流钳前置放大器 | Molecular Devices | CV-7B | 配备用于左臂和右臂记录的MultiClamp 700B放大器头级 |
| α-bungarotoxin | ThermoFisher | B1601 | 用于在记录前固定幼虫 |
参考文献
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Mechanism of spontaneous activity in afferent neurons of the zebrafish lateral-line organ. The Journal of Neuroscience. 31 (5), 1614-1623 (2011).
- Haehnel-Taguchi, M., Akanyeti, O., Liao, J. C.
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重印与许可
