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可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用

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DOI：

10.3791/62234

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2021年2月7日

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1Department of Materials Science & Engineering, Stanford University, 2Department of Chemical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Pediatrics - Endocrinology, Stanford University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了可注射型超分子聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶生物材料的合成与配制方法。同时展示了这些材料在药物递送、生物制药稳定化以及细胞包封与递送中的应用。

摘要

这些方法描述了如何制备可注射的超分子聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶 用作生物材料。PNP水凝胶由两部分组成：疏水改性纤维素作为网络聚合物，以及通过动态多价相互作用充当非共价交联剂的自组装核-壳纳米颗粒。这些方法描述了通过纳米沉淀法形成此类自组装纳米颗粒的过程，以及两种组分的配制与混合，以制备具有可调机械性能的水凝胶。还详细介绍了利用动态光散射（DLS）和流变学对合成材料的质量进行表征的方法。最后，通过体外实验验证了这些水凝胶在药物递送、生物制药稳定化以及细胞包封与递送方面的应用价值，以表征其性能 药物释放、热稳定性以及细胞沉降与活性。由于其具有良好的生物相容性、可注射性以及温和的凝胶形成条件，该水凝胶系统是一种易于调控的平台，适用于多种生物医学应用。

引言

可注射水凝胶是一种新兴工具，能够以受控方式向体内递送治疗性细胞和药物1。这些材料可负载药物或细胞，并可通过直接注射至浅表组织或经导管递送至深部组织，以微创方式给药。通常，可注射水凝胶由通过短暂的物理相互作用交联在一起的水溶胀聚合物网络构成。在静止状态下，这些交联结构赋予凝胶类固体性质；但当施加足够机械力时，交联结构会暂时断裂，使材料转变为类液体状态，从而易于流动2。正是这种流变学特性使物理水凝胶在注射过程中能够发生剪切稀化，并顺利通过细小的针头3。注射后，材料的聚合物网络重新形成，使其能够自我修复并在原位快速恢复为类固体凝胶4,5。这些结构可作为药物缓释储库或组织再生的支架6,7。此类材料已广泛应用于药物递送技术、再生医学和免疫工程等多个领域1,8,9,10,11,12。

已开发出多种天然材料（如海藻酸盐和胶原蛋白）和合成材料（如聚乙二醇（PEG）或类似的亲水性聚合物）作为生物相容性可注射水凝胶材料13,14,15。许多天然材料存在批次间差异，影响实验的可重复性4,16。这些材料通常对温度敏感，在达到生理温度时发生固化；因此，操作这些材料会带来额外的技术和操作上的挑战17。合成材料可实现更精确的化学调控和优异的可重复性，但有时可能引发不良免疫反应，从而限制其生物相容性，而生物相容性是体内治疗应用的关键特性6,18,19。近期研究表明，可注射水凝胶材料的工程设计涉及多种复杂的考量因素，包括优化材料的力学性能、聚合物网络孔径、生物活性分子信号、生物降解性以及免疫原性20,21,22,23,24,25,26。所有这些因素都必须根据具体应用需求进行权衡，这意味着一种模块化、化学可调的平台最理想，能够满足广泛多样的应用需求。

本方法描述了一种可注射的聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶平台的制备及其应用，该平台具有可调节的力学性能、高度的生物相容性和低免疫原性，并可提供位点用于偶联生物活性分子信号27,28,29,30,31,32,33。这些PNP水凝胶由疏水改性的纤维素聚合物和自组装的核-壳结构纳米颗粒组成，其中纳米颗粒成分为聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-PLA）27,34，二者相互作用形成超分子网络。更具体而言，十二烷基修饰的羟丙基甲基纤维素聚合物（HPMC-C12）与PEG-PLA纳米颗粒表面发生动态相互作用，并在这些纳米颗粒之间起到桥接作用，从而形成聚合物网络27,34。这些动态的多价相互作用使得材料在注射过程中可发生剪切变稀，并在给药后迅速自愈合。PNP水凝胶组分可通过简单的单锅反应轻松制备，且PNP水凝胶仅需将两种组分简单混合即可在温和条件下形成35。由于制备简便，该水凝胶平台具有高度的规模化转化潜力。通过调节配方中聚合物和纳米颗粒组分的质量百分比，可控制PNP水凝胶的力学性能和网络孔径。此前针对该平台的研究表明，PNP水凝胶具有高度的生物相容性、可生物降解性以及非免疫原性28,30,31。总体而言，该类水凝胶在生物医学领域具有广泛的应用前景，涵盖术后粘连预防、组织工程与再生、药物缓释以及免疫工程等方面。

方案

在开始本方案之前，有必要采用先前已发表的方法合成 HPMC-C12 和 PEG-PLA27,28,29,30,31,36,37,38。

1. 通过纳米沉淀法合成纳米颗粒（NP）

注意：本节描述单批次纳米颗粒（NPs）的合成，可制备250 µL含20 wt% NPs的缓冲溶液（每批次含50 mg干燥的PEG-PLA聚合物）。在相关步骤中提供了增加批次数量的注意事项。

  1. 称取 50 mg PEG-PLA 聚合物 至一个 8 mL 玻璃闪烁瓶中，加入 1 mL 乙腈。涡旋振荡至完全溶解。
    注意：若需放大批次数量，可线性放大此步骤，并将所需总量的聚合物和溶剂加入单个闪烁瓶中。
  2. 在装有小型搅拌子的 20 mL 玻璃闪烁瓶中加入 10 mL 超纯水，置于搅拌台上，设定转速为 600 rpm。
    注意：即使第 1.1 步已放大，仍需为每个等效批次准备独立的闪烁瓶用于沉淀。例如，对于溶解于 4 mL 乙腈中的 200 mg 聚合物，应准备 4 个 20 mL 闪烁瓶。
  3. 通过纳米沉淀法形成纳米颗粒（NPs），使用 200 µL 移液器将 1 mL 聚合物溶液逐滴加入水中。搅拌 2 分钟。由于 PEG-PLA 中的 PLA 嵌段不溶于水，因此会自组装形成核壳结构的纳米颗粒，其中疏水性 PLA 嵌段构成核心，亲水性 PEG 嵌段构成外壳。
  4. 通过动态光散射（DLS）验证颗粒尺寸。
    注意：本步骤专为市售的酶标仪及其配套软件编写（见材料表）。若使用其他仪器，请参考仪器制造商提供的样品制备方法。
    1. 取 20 µL 纳米颗粒溶液，加入 80 µL 超纯水进行稀释（分析浓度：1 mg/mL PEG-PLA 纳米颗粒）。每孔加入 30 µL 至透明底黑色 384 孔板中（每样本设三个复孔）。
    2. 使用 DLS 酶标仪，选择软件中预设的程序选项，测定各样品的流体动力学半径和多分散系数。以典型程序为例，设定数据采集参数为每次采集持续 2–5 秒，共采集 5–10 次 DLS 测量值，然后根据球状蛋白质模型计算每孔的平均粒径及分布。为形成具有稳定流变性能的水凝胶，所得颗粒的流体动力学直径应为 30–50 nm，且多分散系数（PD）< 0.2。
      注意：若纳米颗粒尺寸小于预期，可在第 1.1 步中使用 75% 乙腈 / 25% 二甲基亚砜（DMSO）的混合溶液。通常，增加溶剂中 DMSO 的比例可增大颗粒尺寸。
  5. 将纳米颗粒溶液从 20 mL 闪烁瓶转移至离心过滤装置中，在 4500 × g 条件下离心 1 小时，浓缩至体积小于 <250 µL。
  6. 用所需缓冲液（如磷酸盐缓冲液（PBS））重悬至 20 wt% 纳米颗粒浓度。将离心过滤装置中的内容物用移液器转移至已称重的微量离心管或玻璃闪烁瓶中（置于天平上操作）。使用少量缓冲液（50–100 µL）冲洗滤膜，确保回收全部纳米颗粒。加缓冲液至总质量为 250 mg。
    注意：在重悬过程中可合并不同批次。纳米颗粒储备液可在 4 °C 下保存约 1 个月，切勿冷冻。如需长期保存，使用前需通过 DLS 检测颗粒尺寸和多分散系数。

2. 水凝胶的配制及药物或细胞的包封

注意：本节描述了1 mL 2:10 PNP水凝胶的制备方法，其中“2:10”表示含2 wt% HPMC-C12 和10 wt% 纳米颗粒（总固体聚合物含量为12 wt%），以及88 wt% 的缓冲液、药物溶液或细胞悬液。可通过调整配方比例获得具有不同力学性能的水凝胶。例如，细胞沉降和细胞活力实验结果中所示的数据即使用了1:5 PNP水凝胶。

  1. 配制6 wt% HPMC-C12的PBS（或所选其他缓冲液）储备液。溶解48小时，以确保聚合物充分分散。
    注：HPMC-C12储备液在室温下可稳定保存数月。但建议在4 °C下储存，以抑制微生物生长。
  2. 将333 mg的6 wt% HPMC-C12储备液加入1 mL鲁尔锁式注射器中。
  3. 向一个微量离心管中加入500 µL的20 wt% NP储备液。再加入167 µL PBS，并用移液器吹打混匀。使用针头将稀释后的NP溶液吸入另一个1 mL鲁尔锁式注射器中。
    注：若需负载药物，应计算药物在水凝胶中的目标终浓度，并将相应量的药物加入与NP混合的167 µL PBS中。若原位检测（如监测药物稳定性）需要分子探针，则以与负载药物类似的方式加入探针。若需负载细胞，应计算细胞在水凝胶中的目标终浓度，并将相应数量的细胞加入与NP混合的167 µL PBS中。
  4. 采用弯头混合法混合两种水凝胶组分（HPMC-C12和NP）35。
    1. 将鲁尔弯头连接器连接至装有NP溶液的注射器（可选地，该溶液中还可含有药物或细胞）。推动NP溶液通过弯头，直至弯头开口端可见液面。稍向后拉动，再连接装有HPMC-C12溶液的注射器。
      ​注：应尽量减少弯头连接处的空气，以防止混合过程中在整个水凝胶中产生和分散气泡。当使用弯头混合器混合细胞时，应更加轻柔操作，避免过快混合导致细胞受到高剪切力而死亡。
    2. 将两种溶液在弯头混合器中来回泵送约60个循环，直至形成均匀的不透明白色水凝胶材料。
    3. 将全部水凝胶体积推入一支注射器中。取下空注射器，并回拉装有水凝胶的注射器活塞，以回收弯头连接器中的材料。用针头或堵头密封。
      ​注：由于混合过程中的死体积，需考虑约300 µL的水凝胶体积损失。例如，若需要700 µL的最终水凝胶体积，则应制备1 mL水凝胶。可通过使用更大体积的注射器放大水凝胶制备过程。但对于较硬的水凝胶配方（如2:10），由于注射器筒体与弯头或针头直径的比值增大，使用体积大于3 mL的注射器进行混合和注射可能会变得困难。
    4. 将水凝胶储存在注射器中，置于室温下。但如果封装了药物，除非药物制造商另有说明，建议在4 ˚C下储存。切勿冷冻该材料。

3. 测定水凝胶配方的流变学性质

注意：本方案专门用于 材料表 中提及的商用流变仪，并配合使用直径为 20 mm 的锯齿状平板几何结构。若使用其他仪器，请参考制造商提供的样品制备说明。

  1. 为进行流变学表征，制备至少 700 µL 的 PNP 水凝胶。
  2. 将材料注入锯齿状流变仪平板的中心。所需材料体积取决于所选的间隙几何参数。作为参考，700 µm 的间隙需要约 400–500 µL 材料。
  3. 将流变仪降至修整间隙（500–1000 µm），并在上部流变仪平板接触 PNP 水凝胶时缓慢旋转，以确保间隙被均匀且完全地填充。
  4. 检查 PNP 水凝胶的加载情况，确保其覆盖整个流变仪平板表面。使用刮刀或塑料修边工具轻轻修剪并去除多余材料，使材料表面略高于平板，形成轻微凸起。
  5. 将流变仪降至最终的几何间隙，并确认样品已干净、正确地加载。
  6. 采用振荡测试（如应变幅值扫描或频率扫描）或流动测试（如剪切速率扫描或阶跃测试）测量样品的力学性能。
    ​注：在所示的代表性数据中，振荡幅值测试在 10 rad/s 的恒定频率下进行；振荡频率扫描在 1% 的恒定应变下进行，该应变位于幅值扫描的线性黏弹性范围内；剪切速率扫描从高剪切速率到低剪切速率进行39。所有测试均在室温下完成，每十倍频程采集 10 个数据点。测试参数可能需要根据配方的特性进行调整。将较硬的 PNP 材料（如 2:10 配方）暴露于高剪切速率下可能导致材料从流变仪平板上被甩出，造成力学性能表征不准确，并在连续测试之间需要重新加载样品。下方所示的代表性数据可用于质量控制测试中的对比参考。

4. 体外药物释放的表征

  1. 通过将玻璃毛细管切割至所需长度来制备毛细管。使用一次性刮勺或移液器吸头将少量环氧树脂推入毛细管一端，形成封堵，以密封每根毛细管的一端。根据制造商推荐的时间让环氧树脂固化。
    注意：毛细管的长度必须短于注射针头的长度。建议使用内径为2–3 µm的管材，使得2.5英寸长度的毛细管总体积至少可达300 µL。
  2. 在含有目标药物的注射器中配制至少500 µL的PNP水凝胶材料。每个样品组分别使用独立的注射器进行制备。
  3. 使用长型皮下注射针头（22G，4英寸），将100–200 µL的PNP水凝胶注入每根毛细管底部。每个样品组至少制备三根毛细管（三重复）。
  4. （可选）将装有水凝胶的毛细管放入锥形离心管中，在1000 × g 条件下离心1分钟，以确保水凝胶表面均匀。可根据需要重复此步骤，并调整离心时间和速度，以进一步平整材料表面。
    警告：确保离心机平衡良好。
  5. 使用注射器和针头或移液器，小心地在毛细管内的水凝胶上方加入200–300 µL的PBS缓冲液。操作过程中不得接触或扰动水凝胶表面。用盖子或塞子密封毛细管，或至少覆盖两层石蜡膜。
  6. （可选）将样品在37 °C下孵育，以模拟体内条件。
  7. 根据预期的药物释放时间尺度，在选定的时间点，使用注射器和针头小心地完全移除每根毛细管中的PBS，避免扰动水凝胶表面。移除的体积用新鲜PBS替代。将收集的样品分装并在适当条件下储存。
    注意：步骤4.3、4.5和4.7 中推荐的体积和时间点可根据材料中的载药量及药物向液相上清中释放的速度进行优化，以覆盖不同时间尺度下的体外药物释放情况。对于缓释药物，可选择的时间点示例包括6小时、1天、3天、1周和2周。分装样品也可在获取后立即分析，无需储存。
  8. 研究结束后，采用适当的方法（如ELISA、HPLC或荧光检测法）对分装样品进行分析，以定量各时间点释放的药物量40,41,42。检测方法的选择取决于目标药物的性质。
    ​注意：体外释放研究可用于比较不同水凝胶配方或药物负载之间的释放行为。体外释放的时间尺度通常不能直接反映体内释放的预期时间尺度。

5. 表征凝胶包埋胰岛素的热稳定性

  1. 每组样品制备至少 1.2 mL 的 PNP 水凝胶。按照第 2.3 节所述步骤，将胰岛素（药物负载物）和硫黄素 T（ThT）（分子探针）加载到 PNP 水凝胶中。
    注意：胰岛素聚集并因此失活的主要机制是通过形成淀粉样纤维。ThT 是一种合适的分子探针，因为它在淀粉样纤维存在时会产生强烈的荧光信号，从而实现对胰岛素聚集的原位监测。根据感兴趣的药物负载物不同，可通过不同的方法监测聚集过程。对于所示的代表性数据，胰岛素的终浓度为 6.7 或 10 mg/mL，ThT 的终浓度为 25 µM。
  2. 使用 21 G 针头，将每孔 200 µL 的 PNP 水凝胶注入黑色 96 孔板中。每组样品至少设置三个重复。使用光学透明的粘性封板膜密封板孔，防止蒸发。
  3. 将板放入配备温度控制、振荡和动力学读数程序的酶标仪中，并开始读数程序。代表性数据使用市售酶标仪（见材料表）在以下条件下获得：
    1. 加速老化条件：在 37 ˚C 下持续线性振荡（410 cpm，5 mm）。
    2. 数据采集：激发/发射波长为 450 nm/482 nm，每 20 分钟读数一次
      ​注意：若无具备温度控制、振荡和动力学读数功能的酶标仪，可将板置于培养箱内的振荡平台上，并在选定时间点手动在上述波长下读取数据。
  4. 以每组随时间变化的平均荧光信号绘制数据图。可通过设定一个任意信号阈值来量化聚集时间43。
    注意：对于下方所示的代表性数据，阈值定义为 750,000 任意荧光单位（AFU）。该值选择为高于测量基线，同时仍能充分捕捉由荧光信号急剧上升所指示的聚集起始点。
  5. 当样品发生聚集或肉眼可见开始脱水时，终止实验。

6. 评估细胞活力

  1. 根据上述方案制备至少 2 mL 含有所需细胞浓度的 PNP 水凝胶（通常为 1 - 5 × 106 个细胞/mL）。每个样本组分别使用单独的注射器准备。
  2. 使用 21G 针头，将 150 µL PNP 水凝胶注入透明底 96 孔板的每个孔中；每孔为一个重复。每个样本组在每个时间点应设置 3–5 个重复。以 50 × g 离心 2 分钟，使水凝胶在孔内均匀铺展。
  3. 在水凝胶上方加入 100 µL 适当的细胞培养基。每天更换一次培养基，弃去旧培养基并加入 100 µL 新鲜培养基。
  4. 第 1 天，针对每个样本组指定时间点的重复孔，移除水凝胶上方的培养基。在每个孔的水凝胶上方加入 50 µL 2 mM 的钙黄绿素 AM 溶液。孵育 30 分钟。
    注意：钙黄绿素 AM 可用于识别和标记活细胞。在活细胞内，非荧光性的钙黄绿素 AM 经乙酰氧甲基酯水解后，被细胞内酯酶转化为绿色荧光 钙黄绿素。
  5. 使用共聚焦显微镜对 96 孔板中每个孔的中心区域进行成像。扫描至少 300 µm2 的区域，并采集至少跨越 150 µm 的 z 轴层扫图像。采用共聚焦显微镜的波长设置，检测钙黄绿素的荧光信号（激发/发射波长：495 nm/515 nm）。
  6. 根据需要，在后续各个时间点重复步骤 6.4 和 6.5 。
  7. 分析每幅图像时，使用 FIJI 或类似软件将所有 z 轴层扫图像合并为单层最大强度投影图像。量化每幅图像中的荧光细胞数量。将各时间点的荧光细胞数量与第 1 天的荧光细胞数量相比，所得比值即为 PNP 水凝胶中细胞的相对存活率。

7. 评估细胞沉降

  1. 计算制备终浓度为 5 × 106 个细胞/mL、体积为 500–700 µL 的 PNP 水凝胶所需的细胞数量。将细胞重悬于 1 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，使细胞浓度为 1 × 106 个细胞/mL。加入 50 µL 的 2 mM 钙黄绿素 AM（calcein AM）对细胞进行染色。将细胞与染料共同孵育 10 分钟。
  2. 在适当条件下离心细胞，弃去 PBS，并将细胞重悬于所需体积的 PBS 中，以制备 500–700 µL 目标 PNP 水凝胶。
    注意：推荐的离心速度和时间通常可在相应产品的技术文档中找到。
  3. 按照第 2 节实验方案，使用染色后的细胞（终浓度为 5 × 106 个细胞/mL）制备 500–700 µL 的 PNP 水凝胶。
  4. 使用 21G 针头，将 100–200 µL 含染色细胞的 PNP 水凝胶注入比色皿底部。每个样品应设置三个重复。注射时在比色皿内来回移动针头，以防止气泡形成。
  5. 成像应立即进行（时间 t = 0），将比色皿侧放，对整个比色皿底部的矩形区域进行成像。利用共聚焦显微镜的拼接扫描功能，对整个区域进行成像，并在 100 µm 深度范围内进行三维 z 轴层扫成像。为便于后续观察，可使用共聚焦显微镜软件将所有图像拼接并生成最大强度投影图，以获得大范围的单幅图像；也可在个人计算机上使用 FIJI 软件进行处理44,45。
  6. 完成成像后，将比色皿直立放置。
  7. 在 1 小时和 4 小时时间点再次成像，观察细胞是否在水凝胶中发生沉降，或是否仍保持悬浮状态。
    注意：上述时间点仅为建议，可根据需要进行调整。
  8. 分析每幅图像时，将所有 z 轴层扫图像合并为单个最大强度投影平面图像。使用 FIJI 或类似软件，通过测量比色皿中心垂直方向上的荧光强度分布，定量分析细胞的沉降程度。

结果

PNP水凝胶的制备与表征
PNP水凝胶通过混合两种主要组分形成——疏水改性的HPMC聚合物和PEG-PLA纳米颗粒（图1a）。治疗性载药物质最简便地加入到用于在水凝胶制备前稀释纳米颗粒组分的额外缓冲液中。为了便于后续的生物医学表征，可采用弯头混合法，该方法能够简便且可重复地混合两种组分（图1b）。充分混合后，水凝胶在注射器中应感觉坚实，但在压力下可屈服并从标准针头（图示21G）中挤出（图1c）。注射后，水凝胶应迅速固化为类固态材料，抵抗重力引起的流动。为全面表征水凝胶并确保批次间产品的一致性，应使用流变仪通过多种不同实验对样品进行分析。使用流动扫描和阶跃剪切实验方案可分别轻松观察凝胶的剪切稀化和自愈合能力（图2a、b）。对于较硬的凝胶（如2:10配方），在剪切速率从0.1增至100 s-1的流动扫描过程中，用户应观察到黏度至少下降两个数量级，以模拟注射过程中的力学条件。阶跃剪切实验应显示在高剪切阶段黏度下降数个数量级，并在低剪切阶段迅速恢复（恢复时间<5秒）至基础黏度水平。在线性黏弹性范围内通过振荡剪切频率扫描实验对储能模量和损耗模量进行表征，应显示在0.1–100 rad s-1频率范围内呈现类固态特性（图2c）。特别是对于较硬的配方（如2:10水凝胶），通常不应在低频区观察到储能模量与损耗模量的交点。若出现此类交点，可能表明起始材料质量存在问题，包括改性HPMC或PEG-PLA聚合物，或PEG-PLA纳米颗粒的尺寸与分散性。需注意的是，对于较弱的水凝胶配方（如1:5水凝胶），可预期出现交点现象。对PNP水凝胶进行振荡剪切振幅扫描表明，材料在施加高应力之前不会屈服，表明这些材料具有屈服应力，即材料开始流动所需达到的应力阈值。

表征 PNP 水凝胶的释放动力学
设计用于药物递送的 PNP 凝胶时，一个关键步骤是对所选配方的药物释放动力学进行表征。目前有多种技术可用于此目的，但在早期配方开发过程中，一种简单的体外方法即可提供有用的数据（图 3a）。通过调节 HPMC-C12 或纳米颗粒（NPs）的用量来改变 PNP 水凝胶中的聚合物含量，是调控这些水凝胶力学性能和网络孔径的最直接方法，而这会直接影响载荷在聚合物网络中的扩散行为及其从材料中释放的速率（图 3b）。对于尺寸大于动态网络孔径的载荷（即高分子量或大流体力学半径的分子），研究人员应预期其从水凝胶储库中的释放为缓慢的、以溶蚀为主导的过程。若配方的动态网络孔径大于或等于载荷的尺寸，则载荷可通过扩散主导的方式释放，该过程可使用传统的载荷扩散与释放模型进行描述46,47,48,49。根据释放曲线的形状，研究人员可重新设计水凝胶配方，以调节其向更慢（例如增加聚合物含量）或更快（例如减少聚合物含量）的释放方向转变。

评估治疗性载荷的稳定性
在开展临床前或细胞研究之前，确定治疗性载荷在水凝胶制剂中的稳定性至关重要。与其他用于包封药物的合成方法相比，PNP 水凝胶通过将载荷混合到本体材料中，以温和的方式进行包封，因此不太可能对载荷造成损伤。这些研究表明，PNP 水凝胶还能稳定易受热不稳定性影响的载荷（例如胰岛素），显著延长其货架期，并减少对冷链储存和运输的依赖（图 4）。重要的是，需在载荷包封入水凝胶后立即评估其状态，并在长期储存后再次评估。这些数据表明，在持续热应力和机械应力条件下储存 28 天后，使用简单的荧光检测法测量胰岛素聚集情况，结果显示胰岛素在水凝胶中仍保持稳定。对于无法获得合适微孔板检测方法的情况，可采用另一种替代技术，即对载荷进行圆二色性测量，该方法特别适用于确定蛋白类药物的二级结构。

测定细胞在 PNP 水凝胶中的存活率与分散状态
许多治疗性细胞需要黏附基序以维持其存活，因此在将 PNP 水凝胶用于细胞治疗时，引入整合素识别基序（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽）是关键步骤50。构成纳米颗粒（NPs）的模块化 PEG-PLA 聚合物可通过简单的“点击”化学反应对 PEG 冠层进行化学功能化修饰28,51。在本示例中，将具有细胞黏附性的 RGD 肽连接至 PEG-PLA 聚合物，以促进细胞与 PNP 水凝胶结构的相互作用。缺乏黏附位点的配方会导致包封细胞的存活率较低，因为这些细胞无法增殖，而含有此类黏附基序的配方则可支持细胞生长（图 5a、b）。包封的细胞可用钙黄绿素 AM 或其他合适的荧光染料（例如 CFSE）进行标记，以便通过荧光显微镜进行细胞计数。在优化过程中，应将功能化后的水凝胶与未经修饰的 PNP 水凝胶进行比较，以确认整合素功能化配方是否确实提高了细胞的存活率和增殖能力。若整合素功能化配方的效果与未修饰水凝胶相当，则可能表明用于引入黏附基序的偶联化学反应存在失败。

研究人员在使用合适的水凝胶配方时，应预期包封的细胞能够均匀地分散在水凝胶介质中。这将有助于在水凝胶给药过程中实现细胞剂量的一致性和可预测性，并确保给药后细胞在水凝胶中的局部滞留。细胞的分布情况可通过荧光显微技术轻松确定。细胞可用适当的染料进行标记，然后通过共聚焦显微镜成像。图像可通过视觉进行评估（图5c），也可使用ImageJ软件对图像垂直方向（或预期因重力导致细胞沉降的任意方向）的平均荧光强度进行定量分析（图5d）。如果水凝胶配方强度不足，无法在较长时间内维持细胞悬浮状态，则会发生细胞沉降现象，如图5中的1:1配方所示。增加聚合物含量可解决因细胞沉降导致的细胞分布不均问题。

聚合物-纳米颗粒水凝胶合成示意图；注射器混合；注射序列实验。
图 1：通过混合两种组分可轻松形成聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶。（a）第一种组分为十二烷基修饰的羟丙基甲基纤维素（HPMC-C12）溶液，第二种组分为聚乙二醇-嵌段-聚乳酸（PEG-PLA）纳米颗粒溶液，并可包含任何治疗性载荷。将这两种组分轻柔混合后，可得到一种可注射水凝胶，其中 HPMC-C12 聚合物通过与 PEG-PLA 纳米颗粒之间的动态多价相互作用实现物理交联。（b）照片展示了使用两个注射器进行混合以制备凝胶的过程，每个注射器分别装有一种 PNP 水凝胶组分。通过使用鲁尔锁紧弯头连接器将两个注射器连接，可在无菌条件下轻松混合两种组分，从而获得无气泡且已预装入注射器的水凝胶，可立即使用。为便于演示，纳米颗粒溶液被染成蓝色。（c）PNP 水凝胶的注射及其再固化过程演示。（i）装有 PNP 水凝胶并连接 21G 针头的注射器。（ii）注射过程中水凝胶受到剪切力作用，导致聚合物与纳米颗粒之间的相互作用暂时断裂，从而呈现类流体状态。（iii）注射后，聚合物与纳米颗粒之间的动态相互作用迅速重新形成，使水凝胶自愈合为固体状态。（iv）形成的固体水凝胶在低于其屈服应力的外力（如重力）作用下不会流动。为便于演示，PNP 水凝胶被染成蓝色。请点击此处查看该图的高清版本。

黏度和模量图的流变学分析；剪切速率、频率、应力数据；2:10, 1:5。
图 2：两种 PNP 水凝胶配方的流变学表征。 配方以聚合物质量分数:NP 质量分数表示。（a）PNP 水凝胶从低到高剪切速率的稳态剪切流动扫描。黏度随剪切速率的变化关系用于表征剪切稀化特性。（b）PNP 水凝胶在低剪切速率（白色背景；0.1 s−1）至高剪切速率（红色背景；10 s−1）之间的振荡剪切速率下的黏度变化，展示 PNP 水凝胶的自愈合特性。每种剪切速率持续施加 30 秒。（c）不同 PNP 水凝胶配方在恒定 1% 应变下，弹性储能模量 G′ 和黏性损耗模量 G″ 随频率的变化关系。（d）在恒定频率 10 rad/s 下进行应变扫描，以表征 PNP 水凝胶的弹性储能模量 G′ 和黏性损耗模量 G″ 随应力的变化关系。该流变学表征可用于质量控制的对比分析。本图改编自 Grosskopf 等人28。请点击此处查看此图的放大版本。

水凝胶扩散过程示意图，随时间变化的聚合物网络渗透性分析图
图 3：牛血清白蛋白（BSA）从 PNP 水凝胶中的体外释放。 配方表示为聚合物质量百分比 : 纳米颗粒质量百分比（wt.%: wt.%）。(a) 描述体外释放实验流程的示意图。随时间从载有 PNP 水凝胶的毛细管中取出等分试样。(b) BSA 从 1:10 PNP、2:5 PNP 和 2:10 PNP 中的体外释放情况，以指定时间点收集的质量占整个实验期间总收集质量的比例表示（数据以均值 ± 标准差表示；n = 3）。通过吸光度测定检测 BSA。 请点击此处查看该图的放大版本。

胰岛素聚集图；单独胰岛素与胰岛素在1:5、2:10比例下的比较；显示阈值。
图4通过ThT检测法评估胰岛素在PNP水凝胶中的热稳定性。 配方表示为聚合物质量百分比：纳米颗粒质量百分比（polymer wt.%: NP wt.%）。在加速老化条件下，胰岛素在1:5和2:10的PNP水凝胶中均保持未聚集状态超过28天 37 °C 并持续震荡。在PBS中配制的胰岛素的聚集时间为20 ± 4小时（均值 ± 标准差，聚集阈值为750,000 AFU）。数据表示为平均值 n 4 次实验重复（AFU，任意荧光单位）。该图已根据 Meis 等人的研究修改。38 请点击此处以查看此图的放大版本。

RGD对细胞生长的影响比较。荧光显微镜图像及随时间变化的细胞数量图。
图5细胞在PNP水凝胶中的存活率及沉降情况。 (a,b) 人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在PNP水凝胶中的细胞活力研究。a在1:5 PNP水凝胶中具有和不具有细胞黏附性精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序偶联至PEG-PLA纳米颗粒的活hMSCs的代表性图像。hMSCs在共聚焦成像前经钙黄绿素染色30分钟。比例尺代表 100 µm. (b第6天的细胞活力定义为图像中荧光细胞数量相对于第1天荧光细胞数量的比例（数据以均值 ± 标准差表示； n = 3). (c，d) 使用hMSCs进行的细胞包封和沉降实验。（c）Calcein AM染色的hMSCs在1:1 PNP水凝胶（上排）和1:5 PNP水凝胶（下排）中包封后0至4小时的最大强度图像，用于定量分析细胞沉降情况。比例尺为1 mm。d沿水凝胶垂直剖面的hMSCs平均水平像素强度。该图改编自Grosskopf等。28 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶易于制备，可通过直接注射或导管递送等微创方式实现治疗性细胞和药物的长期局部递送。本方案描述了PNP水凝胶的配制方法以及用于确保所得材料质量的表征手段。超分子PNP水凝胶可规模化生产，通过改性纤维素聚合物与聚合物核壳纳米颗粒的简单混合即可形成。现有方法描述了通过简单的肘部混合操作，在注射器中预先装载并形成凝胶的简便流程。通过对各组分进行质量控制检测，例如使用动态光散射（DLS）监测纳米颗粒的尺寸和分布，研究者可重复地制备出具有稳定流变特性的PNP水凝胶材料。通过调节HPMC-C12或纳米颗粒（NPs）的用量，可调控所得PNP水凝胶的网络孔径和刚度。这些特性可根据特定的生物医学应用需求进行优化；结合本文详述的流变学方法，研究者可表征PNP水凝胶的剪切稀化和自愈合性能，从而优化其在特定应用中的表现。本文还描述了体外释放研究的方法；研究者可通过这些实验表征目标药物释放的相对时间尺度，为后续的体内研究提供依据。通过稳定性研究，研究者还可评估这些材料在长时间及极端温度条件下维持敏感生物治疗剂结构完整性和稳定性的能力，在降低生物治疗剂对冷链依赖方面展现出广阔的应用前景。最后，通过简单的细胞活力检测，可评估细胞在PNP材料内的生长与迁移行为，该特性在细胞治疗和支架材料领域具有潜在应用价值。

本课题组已发现PNP水凝胶平台具有多种极具前景的应用价值27。PNP水凝胶已被用于亚单位疫苗的缓释递送，能够使抗原与佐剂的释放动力学相匹配，从而增强体液免疫反应的强度、持续时间和质量31。研究发现，PNP水凝胶的孔径尺寸小于大多数常用水凝胶，因此可有效减缓分子货物的扩散并实现缓慢释放。PNP水凝胶独特的组织黏附性和力学性能还被用于构建物理屏障，以防止术后粘连；手术后将其喷覆于器官的大面积表面即可实现该功能30。PNP水凝胶也被证实是有效的细胞递送载体，其力学特性实际上可保护细胞免受注射过程中针头内机械力的损伤，从而提高细胞存活率29。当纳米颗粒（NPs）与细胞黏附肽偶联后，细胞可附着并与PNP基质相互作用，保持活性状态。采用这种方法，与使用液态载体的方法相比，PNP水凝胶可显著提高注射干细胞的局部滞留能力28。此外，PNP水凝胶已被证明可在严苛的加速老化条件下防止包封胰岛素的热诱导聚集，提示这类材料可能有助于降低对温度敏感药物冷藏保存的需求38。

总体而言，本文所述的方法将使研究团队能够制备并探索作为生物材料的 PNP 水凝胶。这些实验方案提供了可在实验室规模合成足够水凝胶材料的技术，以支持体外和体内研究。上述研究表明，这些材料的动态交联结构使其适用于多种生物医学应用，既允许包埋细胞的主动运动，又能限制分子货物的被动扩散。预计研究人员将发现 PNP 平台是一种易于使用且功能强大的工具，可用于通过可控药物递送来改善临床治疗效果，并用于研究细胞募集和力生物学等基本生物学机制。

披露

这些作者没有需要披露的内容。

致谢

本研究由比尔人类系统免疫学中心提供资金支持 & 梅琳达·盖茨基金会（OPP1113682）和比尔 & 比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1211043）。C.M.M. 获得斯坦福大学研究生奖学金及斯坦福 Bio-X William 和 Lynda Steere 研究生奖学金支持。A.K.G. 感谢获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金以及斯坦福大学科学与工程研究生奖学金中的 Gabilan 研究金。S.C. 获得美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助编号 F32CA247352 的支持。作者们还诚挚感谢 Appel 实验室成员，包括 Gillie Roth 博士、Anthony Yu 博士、Lyndsay Stapleton 博士、Hector Lopez Hernandez 博士、Andrea d'Aquino 博士、Julie Baillet 博士、Celine Liong、Ben Ou、Emily Meany、Emily Gale 以及 Anton Smith 博士，多年来为协助 Appel 实验室开发这些实验方案所付出的努力与时间。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
21G 针头BD305165PNP 水凝胶注射
22G，4 英寸皮下注射针头Air-TiteN224体外释放研究
384 孔板，黑色，透明底Corning3540动态光散射（DLS）
96 孔板，黑色Fisher Scientific07-200-627生物稳定性研究
96 孔板，透明Corning3599细胞活力与沉降研究
钙黄绿素 AMThermo Fisher ScientificC3100MP细胞活力与沉降研究
毛细管McMaster-Carr8729K66体外释放研究
离心过滤装置Fisher ScientificUFC901024纳米颗粒浓缩
比色皿Millipore SigmaBR759015-100EA细胞活力与沉降研究
DLS 微孔板读板仪Wyatt TechnologyDynaPro II Plate Reader动态光散射（DLS）
环氧树脂VWR International300007-392 (EA)体外释放研究
皮下注射针头Air-Tite8300015027体外释放研究
鲁尔接头弯头连接器Cole-ParmerEW-30800-12PNP 水凝胶配制
鲁尔锁式注射器Fisher Scientific14-955-456PNP 水凝胶配制
磷酸盐缓冲液（1×）Fisher Scientific10010049PNP 水凝胶配制
塑料刮刀Thomas Scientific1229F13流变学表征
微孔板读板仪BioTekSynergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader生物稳定性研究
微孔板密封膜Excel ScientificTS-RT2-100生物稳定性研究
重组人胰岛素GibcoA11382II生物稳定性研究
流变仪TA InstrumentsDHR-2 Rheometer流变学表征
硫黄素 TSigma-AldrichT3516-5G生物稳定性研究

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可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用
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