从出生后小鼠大脑中分离原代小胶质细胞

摘要

原代细胞培养是体外研究小胶质细胞生物学的主要方法之一。在这里，我们开发了一种从小鼠出生后第 1 天 （P1） 到 P4 的简单快速分离小胶质细胞的方法。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 中的单核吞噬细胞，在维持体内平衡和调节 CNS 的炎症过程中起关键作用。为了在体外研究小胶质细胞生物学，与永生化的小胶质细胞系相比，原代小胶质细胞显示出巨大的优势。然而，从出生后小鼠大脑中分离小胶质细胞的效率相对较低且耗时。在该协议中，我们提供了一种快速且易于遵循的方法，从新生小鼠大脑中分离原代小胶质细胞。该方案的总体步骤包括脑解剖、原代脑细胞培养和小胶质细胞分离。使用这种方法，研究人员可以获得高纯度的原代小胶质细胞。此外，收获的原代小胶质细胞能够对脂多糖攻击做出反应，表明它们保留了免疫功能。总的来说，我们开发了一种简化的方法来有效分离高纯度的原代小胶质细胞，这有助于在体外进行广泛的小胶质细胞生物学研究。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 中的常驻免疫细胞，在维持体内平衡中起着关键作用，体内平衡对神经病理学挑战做出反应¹。最近，已经进行了深入的研究，以弄清楚小胶质细胞的生理功能，例如，在阿尔茨海默病² 中。目前，在 CNS 发育、衰老和疾病过程中获得的单细胞分辨率下的小胶质细胞转录谱有助于更好地了解健康和患病大脑中的小胶质细胞功能³。先前的研究在 AD 和其他神经退行性疾病中发现了一种与疾病相关的小胶质细胞亚型 ^4,5,6。该亚群靠近淀粉样蛋白 β （Aβ） 沉积。发现与吞噬作用和脂质代谢相关的基因（例如 Apoe、Tyrobp）在这些群体中上调 ^6,7。然而，调节小胶质细胞动态分子谱变化的亚细胞过程、细胞外和细胞内信号通路尚不完全清楚。特别是，神经退行性疾病中慢性小胶质细胞激活的机制仍然难以捉摸。因此，了解涉及小胶质细胞的细胞机制至关重要，因为小胶质细胞反应显然有助于大脑发育和神经退行性变的进展。

尽管有几种体内和体外工具可以研究小胶质细胞，但仍存在一些局限性。从技术上讲，很难获得足够数量的高纯度小胶质细胞，用于常规进行实验，例如 western blot，以阐明细胞内信号通路。原代小胶质细胞培养为研究小胶质细胞的生物学提供了一种替代方法。培养的原代小胶质细胞可用于分析基因作后的小胶质细胞吞噬能力，并评估响应炎症刺激的促炎和抗炎细胞因子的产生，以及其他生物学方面，以了解它们在大脑中的作用⁸。在这里，我们提出了一种新的方案，并描述了从新生小鼠大脑中分离和培养原代小胶质细胞的分步说明，重点是获得健康和纯的原代小胶质细胞的关键步骤。

方案

所有动物程序均由上海交通大学动物研究委员会和实验动物护理机构管理小组批准。已尽一切努力减少动物的痛苦。

1. 制备培养缓冲液、培养瓶和盖玻片

1. 培养基和小胶质细胞培养基:用 10% FBS 补充 DMEM 以制备培养基。小胶质细胞培养基是通过向 DMEM 中加入 10% FBS 和 20% LADMAC 条件培养基制成的。向两种培养基中加入 1% 青霉素/链霉素。
   1. 为了制备 20% LADMAC 条件培养基，从 LADMAC 细胞中收集培养基，以 200 x g 离心 10 分钟，使用 0.22 μm 细胞过滤器过滤，然后将等分试样储存在 -80 °C。
2. 消化缓冲液:向 DMEM 中加入 8 U/mL 木瓜蛋白酶和 125 U/mL DNase 来制备消化缓冲液。
   注:为获得最佳结果，消化缓冲液应新鲜制备。根据幼崽的数量计算所需的量（每 2 只幼崽 1 mL 溶液）。
3. 包被瓶:使用 T25 或 T75 培养瓶预铺板分离的脑细胞。在脑解剖之前，用 2 mL（或 T75 烧瓶为 4 mL）的 0.1 mg/mL 多聚-D-赖氨酸 （PDL） 包被 T25 培养瓶，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。吸出 PDL 溶液，用 1x PBS 洗涤两次，然后让培养瓶在细胞培养罩中风干。
   注意:实验中使用的烧瓶的大小和数量取决于产后幼崽的数量。为了让细胞在短时间内到达汇合的星形胶质细胞层，请为 3-5 个大脑准备一个 T25 培养瓶，或为 5 个大脑准备一个 T75 培养瓶。未使用的包被培养瓶可在 4 °C 下储存长达一个月。为了节省时间，可以在实验开始前制备 10x （1 mg/mL） PDL 储备液，并在 -20 °C 下作为一次性等分试样储存。使用前在无菌 1x PBS 中稀释等分试样。
4. 准备盖玻片:用 0.1 M HCl 洗涤商业玻璃盖玻片 1 小时，用高压灭菌水冲洗两次，然后储存在 100% 乙醇中。使用前，用细镊子和燃烧器灯将盖玻片燃烧，以去除残留的乙醇。8 mm 玻璃盖玻片可置于 48 孔板中，12 mm 玻璃盖玻片可置于 24 孔板中。
5. 准备解剖工具:将细剪刀、镊子和不锈钢微勺浸泡在 75% 乙醇中至少 20 分钟。然后将这些工具在组织培养罩中的紫外线照射下放置 30 分钟。

2. 小鼠大脑解剖

注意:为了评估该方案的有效性，这里我们使用 CX3CR1^GFP 敲入小鼠来追踪小胶质细胞⁹。CX3CR1^GFP/GFP 小鼠和野生型 C57BL/6J 雌性在 2 至 8 个月时杂交以产生 CX3CR1^+/GFP 小鼠，两者均最初从商业来源获得。在上海交通大学，将小鼠置于无特定病原体 （SPF） 环境中，在 12-12 h 的明暗循环下饲养。出生后第 1 天至第 4 天的幼崽可用于该方案。

1. 用手术剪刀斩首所有幼崽。为了尽量减少污染，用 75% 乙醇冲洗所有头，然后快速放入冰冷的 1x PBS 中。同时，在 37 °C 水浴中加热消化缓冲液和共培养基。
   注意:一次从一只幼崽中斩首和分离脑组织，以保持结构完整性。为防止污染，所有手术工具应在两次斩首之间放入 75% 乙醇中。
2. 使用精细解剖剪刀剪下头骨和延髓。将不锈钢微勺从切割部位的脑组织下方放入，以从头腔中挤出大脑。将其转移到新的冷藏 6 孔板中，每孔含有 2 mL 预冷的 1x PBS。
3. 切掉并丢弃小脑和嗅球。轻轻地将剩余的脑组织转移到含有 2 mL 预冷 1x PBS 的冷冻 6 孔板中。
   注意:将 4-5 个脑组织放入一个孔中。
4. 对剩余的头部重复相同的程序，直到收集到所有组织。

3. 混合的原代细胞接种

1. 在 6 孔板中吸出 1.5 mL 的 1x PBS，并在弹簧剪刀的帮助下将脑组织完全切碎成小块（约 1 mm²）。
   注意:为了减少细碎屑的数量，不要将组织切碎。
2. 向孔中加入所需量的消化缓冲液（每个大脑 0.5 mL 消化缓冲液），然后将板放入 5% CO₂、37 °C 加湿培养箱中 20 分钟。每 10 分钟旋转一次板。
   注:在孵育期间，用培养基（10% FBS 的 DMEM 溶液）润湿 70 μm 细胞过滤器，然后将细胞过滤器放在新的 50 mL 收集管上。
3. 将板从培养箱中取出，向每个孔中加入 3 mL 培养基以终止木瓜蛋白酶消化。使用 1 mL 移液器轻轻上下移液细胞 10 次。将混合物转移至 15 mL 试管中，静置 1 分钟。在底部可以看到一个混浊的细胞沉淀。要去除大块细胞和细胞碎片，请小心地将细胞悬液通过 70 μm 细胞过滤器，并将流出液收集在 50 mL 收集管中。
4. 将 3 mL 加热的培养基（10% FBS 的 DMEM 溶液）添加到 15 mL 试管中未解离的细胞沉淀中。如步骤 3.3 中研磨 10 次以继续分离。让组织静置 1 分钟，然后将细胞悬液通过过滤器通入 50 mL 收集管。重复此步骤，并丢弃剩余的细胞碎片。
5. 将细胞悬液从 50 mL 收集管转移到 15 mL 管中，并在室温下以 200 x g 离心细胞 10 分钟。
6. 吸出上清液，并将细胞重悬于 5 mL 培养基中。将原代细胞以约 5 x 10⁶ 的细胞密度接种在 T25 或 T75 培养瓶中，并在加湿培养箱（5% CO 2,37°C）中培养。这是此文化计划中的第 0 天。
   注:如果细胞接种在 T25 培养瓶中，则每个培养瓶的最终体积为 5 mL 培养基就足够了。接种到 T75 培养瓶中时，向每个培养瓶中额外添加 5 mL 培养基。

4. 原代小胶质细胞的收集

1. 在第二天（第 1 天）评估混合细胞的汇合度。由于混合细胞以相当高的密度接种，因此星形胶质细胞需要 3-4 天才能达到汇合，从而可以在 1-2 天后收集小胶质细胞。
   注意:如果第二天细胞没有附着在培养瓶底部，请小心;这可能是由于过度消化或粗暴处理引起的细胞污染或细胞死亡。
2. 第 2 天，用 3 mL 温热的 1x PBS 洗涤培养瓶两次，并向每个 T25 培养瓶中加入 3-5 mL 新鲜培养基（T75 培养瓶为 7-10 mL）更换培养基。丢弃的培养基包含细胞碎片和各种类型的细胞，包括神经元、少突胶质细胞和小胶质细胞。
3. 第 4 天，确保附着在培养瓶底部的星形胶质细胞达到 100% 汇合。同时，小胶质细胞亚群松散地附着在混合细胞表面层上，通过握手很容易从表面分离并漂浮在培养基中。将培养基转移到新鲜的 6 孔板中，在此过程中收集培养基中富集的原代小胶质细胞。接下来，为原始 6 孔板上的细胞提供新鲜培养基，以便进一步收集细胞。
   注:在培养基转移之前，轻敲桌子上的培养瓶或在实验室摇床上以 180 rpm 的速度摇动培养瓶 30 分钟，以产生更多细胞。
4. 小心地将 6 孔放入培养箱中，以允许细胞附着。孵育后约 2 小时，所有细胞都将附着在板上。当细胞附着时，用温热的 1x PBS 轻轻洗涤它们两次，以去除细胞聚集体和细胞碎片;然后，为细胞提供 3 mL 新鲜的小胶质细胞培养基。通过每 2 天刷新一次小胶质细胞培养基，分离的小胶质细胞可以在体外维持一个月以上。
   注意:集落刺激因子 1 （CSF1） 是支持小胶质细胞体外存活的重要生长因子。以前的研究报道，CSF1 可以从 LADMAC 细胞系分泌，LADMAC 细胞系是源自小鼠骨髓细胞的转化细胞系。可以通过将 LADMAC 培养物以 200 x g 离心 10 分钟来收集 LADMAC 条件培养基;然后，将上清液通过 0.22 μM 细胞过滤器。通过向培养基中加入 20% LADMAC 条件培养基（10% FBS、DMEM）来制备小胶质细胞培养基。
5. 每 2-3 天，继续从混合细胞培养基中收集小胶质细胞，如步骤 4.4 所示。在培养瓶中培养剩余的混合细胞，并使用它们每 2-3 天持续收获一次小胶质细胞，最长可达 1 个月。
   注:通过从混合培养细胞中收集培养基长达 50 天，可以成功收获小胶质细胞。每次，收集的共培养基将在每个 T75 培养瓶中产生约 ~1-3 x 10⁵ 个小胶质细胞。如果需要，结合小胶质细胞。
6. 使用原代小胶质细胞进行所需的功能测定。

结果

图 1 显示了细胞接种后第 7 天和第 35 天从 CX3CR1 ^{+ /GFP} 收集的原代小胶质细胞。如小胶质细胞/巨噬细胞标志物 IBA1 的免疫荧光染色所示，所有 IBA1 阳性细胞的 GFP 信号均呈阳性，而 S100β（星形胶质细胞标志物）和 CC1（少突胶质细胞标志物）呈阴性，表明纯化的 GFP 阳性细胞确实是小胶质细胞。接下来，发现超过 95% 的分离细胞是 GFP 阳性细胞，表明分离的小胶质细胞是高纯度^{的 10}。此外，为了进一步表征原代小胶质细胞在体外的功能，用 10 ng/mL 和 100 ng/mL LPS 处理分离的小胶质细胞 24 小时（如图 2 所示）。与对照相比，LPS 暴露诱导了激活的表型，包括上调 CD68 的表达并转变为具有长分支过程的变形虫形态。研究结果表明，该方案中分离的原代小胶质细胞至少允许成功的炎症研究。

讨论

该协议基于前面描述的方法，并进行了一些修改¹¹。提高分离的小胶质细胞的活力和纯度的技巧如下。首先，在制备用于组织分离和细胞培养的缓冲液时，要注意避免污染。确保手术工具、容器和塑料设备是无菌的。通常，除了一般细胞培养的细胞培养罩外，我们还在单独的组织培养罩中进行脑解剖，以避免交叉污染。其次，对于10-12只幼崽，组织解剖和接种步骤应花费经验丰富的研究人员约1.5-2小时。大规模制备是可行的，但肯定会延长时间，尤其是组织解剖的时间。但是，最好及时完成细胞分离，以减少细胞暴露于损伤信号，从而最大限度地减少缺氧和缺血诱导的细胞活化。第三，必须轻柔地处理混合细胞培养物，以避免星形胶质细胞单层的破坏。此外，在分离过程中不要剧烈摇晃培养瓶，以尽量减少小胶质细胞的过度激活。

在随后的收集步骤中，先前的方案强调机械解离可以提高小胶质细胞的产量。例如，Tamashiro 等人建议以 100 rpm 的速度摇动培养瓶 1 小时，以增强小胶质细胞与星形胶质细胞层的分离

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞过滤器，40 和微型的;m	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Life Technologies 的 Gibco	C11995500BT
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）	Gibco	14190-144
胎牛血清 （FBS）	Life Technologies 的 Gibco	10099141
木瓜蛋白酶、悬浮液	Sangon Biotech	木瓜蛋白酶、悬浮青
霉素-链霉素 100X 溶液	Hyclone	SV30010
聚-D-赖氨酸	ThermoFisher Scientific	A3890401