从出生后小鼠大脑中分离原代小胶质细胞

摘要

原代细胞培养是体外研究小胶质细胞生物学的主要方法之一。本文中，我们建立了一种从小鼠出生后第1天（P1）至第4天（P4）快速、简便分离小胶质细胞的方法。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的单核吞噬细胞，在维持中枢神经系统稳态和调控炎症过程中发挥关键作用。为了在体外研究小胶质细胞生物学特性，相较于永生化的小胶质细胞系，原代小胶质细胞具有显著优势。然而，从小鼠出生后脑组织中分离小胶质细胞的效率相对较低且耗时较长。在本实验方案中，我们提供了一种快速且易于操作的方法，用于从新生小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞。该方案的整体步骤包括脑组织解剖、原代脑细胞培养以及小胶质细胞分离。采用此方法，研究人员可获得高纯度的原代小胶质细胞。此外，所获取的原代小胶质细胞能够对脂多糖刺激产生反应，表明其保留了免疫功能。综上所述，我们建立了一种简化的高效方法，可用于分离高纯度的原代小胶质细胞，从而促进多种小胶质细胞生物学研究 在体外的开展。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在维持内环境稳态中发挥关键作用，并对神经病理学刺激作出应答¹。近年来，研究人员已开展大量工作以阐明小胶质细胞的生理功能，例如在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）中的作用²。目前，通过单细胞分辨率获得的在CNS发育、衰老和疾病过程中小胶质细胞的转录谱，使我们能够更深入地理解小胶质细胞在健康和病变脑组织中的功能³。先前的研究已在阿尔茨海默病（AD）及其他神经退行性疾病中鉴定出一种与疾病相关的小胶质细胞亚型^4,5,6。该亚群通常位于淀粉样β蛋白（Aβ）沉积区域附近。在这些细胞群体中，与吞噬作用和脂质代谢相关的基因（如 Apoe、Tyrobp）被发现呈上调表达^6,7。然而，调控小胶质细胞动态分子谱变化的亚细胞过程以及细胞外和细胞内信号通路尚未完全阐明。特别是，在神经退行性疾病中导致小胶质细胞慢性活化的机制仍不清楚。因此，深入理解与小胶质细胞相关的细胞机制至关重要，因为小胶质细胞的反应明确参与....

方案

所有动物实验程序均经上海交通大学动物研究委员会和实验动物护理机构管理委员会批准。已尽一切努力最大限度减少动物痛苦。

1. 培养缓冲液、培养瓶和盖玻片的准备

1. 培养基与小胶质细胞培养基：在DMEM中添加10%胎牛血清（FBS），配制普通培养基。小胶质细胞培养基则在DMEM中加入10% FBS和20% LADMAC条件培养基制成。两种培养基均需添加1%青霉素/链霉素。
   1. 制备20% LADMAC条件培养基时，收集LADMAC细胞的培养上清液，以200 × g 离心10分钟，使用0.22 µm细胞滤器过滤，分装后于-80 °C保存。
2. 消化缓冲液：将8 U/mL木瓜蛋白酶和125 U/mL DNase加入DMEM中，配制消化缓冲液。
   注意：为获得最佳效果，消化缓冲液应现配现用。根据仔鼠数量计算所需体积（每2只仔鼠使用1 mL溶液）。
3. 包被培养瓶：使用T25或T75培养瓶用于预接种分离的脑细胞。在脑组织解剖前，用2 mL（T75培养瓶使用4 mL）0.1 mg/mL多聚-L-赖氨酸（PDL）溶液包被T25培养瓶，37 °C孵育至少1小时。吸除PDL溶液，用1×PBS洗涤两次，然后在细胞培养超净台中自然晾干。
   注意：实验中使用的培养瓶规格和数量取决于新生仔鼠的数量。为尽快形成融合的星形胶质细胞层，建议每3–5个脑组织使用一个T25培....

结果

在细胞接种后第7天和第35天，从CX3CR1^+/GFP小鼠中分离得到的原代小胶质细胞如图1所示。如小胶质细胞/巨噬细胞标志物IBA1的免疫荧光染色结果所示，所有IBA1阳性细胞均表达GFP信号，且不表达S100β（星形胶质细胞标志物）和CC1（少突胶质细胞标志物），表明所纯化的GFP阳性细胞确为小胶质细胞。此外，结果显示分离获得的细胞中超过95%为GFP阳性细胞，说明所分离的小胶质细胞纯度很高¹⁰。此外，为了进一步表征原代小胶质细胞在体外的功能特性，将分离的小胶质细胞分别用10 ng/mL和100 ng/mL的LPS处理24小时（如图2所示）。与对照组相比，LPS刺激诱导了活化表型，包括CD68表达上调以及形态转变为具有长而分支突起的阿米巴样形态。这些结果表明，本方案所分离的原代小胶质细胞可用于至少在炎症研究中取得成功。

讨论

本方案基于先前描述的方法并进行了一些修改¹¹。以下列出了提高分离小胶质细胞活力和纯度的建议。首先，在配制用于组织分离和细胞培养的缓冲液时，应注意避免污染。确保手术器械、容器和塑料耗材均为无菌状态。通常，我们在独立的组织培养超净台中进行脑组织解剖，与常规细胞培养所用的超净台分开，以避免交叉污染。其次，对于10–12只仔鼠，组织解剖和接种步骤通常需要经验丰富的研究人员耗时约1.5–2小时。虽然可以进行大规模制备，但操作时间必然延长，尤其是组织解剖所需时间。然而，为减少细胞暴露于损伤信号的时间，应尽快完成细胞分离，以最大限度地降低缺氧和缺血诱导的细胞活化。第三，在处理混合细胞培养物时应轻柔操作，避免破坏星形胶质细胞单层。此外，在分离过程中切勿剧烈摇晃培养瓶，以尽量减少小胶质细胞的过度活化。

在后续的收集步骤中，以往的方案强调机械解离可提高小胶质细胞的得率。例如，Tamashiro et al. 建议以100 rpm的转速振荡培养瓶1小时，以促进小胶质细胞从星形胶质细胞层上脱离¹²。L.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞筛，40 µm	ThermoFisher Scientific	22-363-547
DNase I	Sigma	11284932001
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco by Life Technologies	C11995500BT
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco by Life Technologies	14190-144
胎牛血清（FBS）	Gibco by Life Technologies	10099141
木瓜蛋白酶悬浮液	Sangon Biotech	Papain, Suspension
青霉素-链霉素 100X 溶液	Hyclone	SV30010
多聚-D-赖氨酸	ThermoFisher Scientific	A3890401