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方法文章

从特纳综合征（45,XO）胎儿细胞生成诱导性多能干细胞用于下游建模该综合征相关的神经功能缺陷

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⸱

DOI：

10.3791/62240

⸱

2021年12月4日

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Karnataka, India-576104, 2Department of Medical Genetics, Manipal Hospitals

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了通过核转染递送附加体质粒，从胎儿组织成纤维细胞生成无整合的诱导多能干细胞（iPSCs），并进一步阐述了用于iPSC鉴定及神经元分化的实验方法。

摘要

染色体非整倍性可导致严重的先天性畸形，包括中枢神经系统畸形以及胎儿死亡。产前遗传学筛查仅为诊断性手段，无法阐明疾病机制。尽管来自非整倍体胎儿的细胞是携带染色体非整倍性的宝贵生物材料，但这些细胞寿命较短，限制了其在后续科研实验中的应用。诱导性多能干细胞（iPSC）模型的建立是一种有效的细胞制备方法，可实现非整倍体特征的长期保存。这类细胞具有自我更新能力，并可分化为类似于胚胎发育过程中的特化细胞，因此iPSC是研究早期发育事件的优良工具。特纳综合征（TS）是一种与X染色体完全或部分缺失相关的罕见疾病，其特征包括不孕、身材矮小、内分泌、代谢、自身免疫和心血管系统疾病，以及神经认知缺陷。本方案描述了从TS（45,XO）胎儿组织中分离并培养成纤维细胞，通过核转染递送附加体型重编程质粒生成无整合的TSiPSC，随后进行表征分析的完整流程。重编程获得的TSiPSC首先通过活细胞碱性磷酸酶染色进行初步筛选，再通过广泛检测多能性生物标志物进行深入验证。挑选出的克隆通过机械法解剖，连续传代数次后，获得稳定自我更新的细胞用于后续实验。这些细胞表达多能性转录因子OCT4、NANOG、SOX2，以及多能干细胞典型的细胞表面标志物SSEA-4和TRA1-81。重编程后，原始的45,XO核型得以保留。TSiPSC能够形成拟胚体，并分化为表达谱系特异性生物标志物的内胚层、中胚层和外胚层细胞（SRY BOX17、MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β、βIII TUBULIN）。外源附加体型质粒在细胞中自发丢失，在传至第15代后已无法检测到。这些TSiPSC是研究特纳综合征相关神经认知缺陷背后异常分子与细胞神经发育过程的宝贵细胞资源。

引言

非整倍体会导致人类出生缺陷或先天性畸形以及妊娠丢失。约50%至70%的妊娠丢失样本显示出细胞遗传学异常。在妊娠早期丢失的非整倍体胚胎难以获取用于实验分析，因此有必要开发其他能够紧密模拟人类胚胎发育的模型。已利用携带遗传病诊断结果的细胞所衍生的诱导性多能干细胞（iPSCs）来模拟代表性遗传异常及其对胎儿发育的影响1,2,3,4。这些iPSCs类似于发育中胚胎的上胚层细胞，能够重现胚胎形成的早期事件，有助于理解并表征早期哺乳动物胚胎中细胞谱系的发育程序与模式形成。此前由产前诊断检测中获得的非整倍体综合征（如X单体（特纳综合征）、8三体（瓦尔科尼综合征2型）、13三体（帕陶综合征）以及部分11号与22号染色体三体（埃马纽埃尔综合征））的皮肤成纤维细胞和羊水细胞所衍生的iPSCs，已为研究发育失败机制提供了重要见解4。

特纳综合征（TS）是一种罕见疾病，其特征为女性不孕、身材矮小、内分泌和代谢紊乱、自身免疫性疾病风险增加，以及易患心血管疾病5。尽管它是唯一可存活的单体综合征，但仍可导致胚胎发育过程中死亡，引起自然流产6。存活的TS患者其细胞中均存在不同程度的X染色体物质异常。核型从一条X染色体完全缺失（45,XO）到嵌合体如45,XO/46,XX；45,XO/47,XXX，以及环状染色体的存在、Y染色体物质的存在等5。

该综合征的诊断通常通过对有症状个体的血液进行核型分析，以及对绒毛组织进行绒毛取样（CVS），以检测早期的非整倍体综合征。由于非整倍体综合征约占自然流产病例的30%，因此在发生自然流产后，常规会对妊娠产物（POC）进行核型分析。这些含有细胞遗传学异常的胎儿细胞，包括绒毛组织及其来源的诱导多能干细胞（iPSCs），为研究非整倍体综合征提供了宝贵的生物材料资源4,6。此前已有研究通过逆转录病毒重编程技术从羊水细胞4、通过逆转录病毒重编程从绒毛组织成纤维细胞（经产前诊断获得） 6、通过仙台病毒重编程从外周血单个核细胞7，以及通过慢病毒重编程从特纳综合征（TS）患者皮肤成纤维细胞中建立TS来源的iPSCs4。由于我们实验室的主要研究方向是理解发育失败的机制，因此我们从自然流产的妊娠产物（POC）中，特别是其中的绒毛组织部分，建立了TS来源的iPSCs8。从该胎儿组织中分离出的所有细胞均具有45,XO核型，并成功诱导生成了具有相同核型的iPSCs。这些iPSCs具有独特性，因为它们是首次从流产胎儿组织中建立的，为研究与非整倍体相关的妊娠失败提供了宝贵的资源。本文详细介绍了通过附加体质粒重编程技术，从这一独特细胞来源生成iPSCs的方法学流程。

早期的iPSC生成方法使用病毒转导和转座子来递送重编程因子。诱导细胞获得多能性的方法已从使用整合型逆转录病毒载体9、可切除的慢病毒载体10，11以及基于转座子的方法12，发展到非整合型腺病毒载体13和基于仙台病毒的载体14。尽管基于逆转录病毒和慢病毒的重编程效率较高，但其会导致重编程因子整合到宿主染色体中，引起插入突变，从而对iPSC产生不可预知的影响。此外，基于病毒的重编程阻碍了iPSC的转化应用。研究人员已探索RNA-based系统15和直接蛋白递送16，以彻底消除与病毒和DNA转染相关的潜在风险。然而，这些方法被证明效率较低。

2011年，Okita 等人报道了通过shRNA抑制TP53可提高附加型质粒重编程的效率。他们还用非转化型LMYC（小细胞肺癌相关MYC）替代cMYC，以增强hiPSCs的安全性。这些附加型质粒表达5种重编程因子：OCT4、LIN28、SOX2、KLF4、LMYC以及针对TP5317,18的shRNA。这些载体在染色体外维持，并在连续传代培养过程中逐渐从重编程细胞中丢失，因此可在10–15代内获得无外源基因整合的细胞系。核转染（Nucleofection）是一种特殊的电穿孔技术，可将核酸直接递送至宿主细胞的细胞核内，是将重编程质粒导入多种细胞类型的高效方法。附加型质粒成本较低，可在一定程度上弥补核转染的高成本。在优化条件下，该方法具有高效性和可重复性，能够从多种体细胞中稳定产生iPSCs。在本方案中，我们描述了通过核转染附加型重编程质粒，从胎儿组织来源的成纤维细胞中生成iPSCs的方法。具体内容包括从胎儿绒毛膜绒毛中分离成纤维细胞、质粒纯化、核转染、从重编程培养板中挑取克隆以及建立稳定的iPSCs系的详细操作步骤。

确认新生成的iPSCs中存在多能性特征至关重要。这包括证明多能性相关因子的存在（例如碱性磷酸酶表达、NANOG、SSEA4、Tra 1-80、Tra 1-81、E-cadherin；通常通过免疫荧光或基因表达检测来显示），以及通过三胚层分化能力鉴定三个胚层的形成 体外 分化实验以验证其分化潜能，核型分析以确定染色体组成，STR分型以确认与亲代细胞的遗传一致性，验证外源基因的丢失情况，以及其他更严格的检测 体内 畸胎瘤形成和四倍体补偿等检测。本文描述了核型分析、活细胞碱性磷酸酶染色、通过免疫荧光检测多能性相关生物标志物的表征方案， 体外 分化检测实验及外源基因丢失的验证方法19.

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方案

FCV 毒株由班加罗尔玛希普尔医院提供，并已获得玛希普尔医院伦理委员会批准。

注意：所有缓冲液和溶液的成分见表1。

1. 从胎儿绒毛膜绒毛（FCV）中分离成纤维细胞

  1. 样本采集及胶原酶消化组织
    1. 在无菌条件下用磷酸盐缓冲液（PBS）收集绒毛膜绒毛（FCV），并在室温下运送至细胞培养实验室。
    2. 将绒毛转移至60 mm培养皿中，用含1×抗生素-抗真菌素溶液（PBS-AA）的PBS反复洗涤数次（至少4次），然后用移液器彻底去除PBS-AA。
    3. 用1 mL胶原酶混合液（5 mg/mL）在37 °C处理绒毛膜绒毛5分钟。
    4. 加入含10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中和反应，将消化液转移至15 mL离心管中，在225 × g条件下离心5分钟，收集解离的绒毛及释放的细胞沉淀。
  2. 传代培养与细胞库扩增
    1. 将解离后的绒毛连同释放的细胞接种于含5 mL完全培养基（如AmnioMAX）的T25培养瓶中，培养至获得融合的成纤维细胞单层。
    2. 进一步扩增成纤维细胞以制备细胞库，用于后续转染和表征实验，步骤如下：
      1. 向含有FCV成纤维细胞的T25培养瓶中加入2 mL 0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育3–5分钟以解离细胞。
      2. 孵育后，加入与胰蛋白酶等体积的FBS以中和酶活性。
        注：也可使用含FBS的培养基按1:3的胰蛋白酶:培养基比例中和胰蛋白酶。
      3. 将解离的细胞收集至15 mL离心管中，在225 × g条件下离心5分钟，获得细胞沉淀。
      4. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL完全培养基中。
      5. 取500 µL细胞悬液分别接种至60 mm组织培养处理的培养皿中，并补加培养基至总体积5 mL。该1:2的传代比例在后续传代中亦保持一致。
  3. 冷冻保存
    1. 按照步骤1.2.2.1–1.2.2.3所述方法，使用0.05%胰蛋白酶进行酶解消化，并获得细胞沉淀。
    2. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL冻存液中，冻存液由1:9比例的二甲基亚砜（DMSO）与FBS组成。
    3. 将悬液转移至无菌冻存管中，并将冻存管放入程序冻存盒中。
    4. 在-80 °C过夜冷冻，次日转移至液氮（-196 °C）中长期保存。

2. 质粒DNA的提取与验证

  1. 细菌细胞制备
    1. 将含有三个独立质粒 pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK 和 pCXLE-hUL（来自 Addgene）的 E. coli 甘油菌株分别划线接种于 LB-氨苄青霉素琼脂平板上。
    2. 挑取单菌落接种至 5 mL LB-氨苄青霉素液体培养基中，37 °C、10 × g 振荡培养 8 小时。
    3. 取 200 µL 上述预培养菌液接种至 100 mL LB-氨苄青霉素液体培养基中，37 °C 振荡过夜培养。
    4. 将过夜培养的菌液在 4 °C 条件下以 6000 × g 离心 15 分钟，收集菌体沉淀。
  2. 使用中量质粒纯化试剂盒进行质粒提取
    1. 用 4 mL 重悬缓冲液重悬菌体沉淀。
    2. 加入 4 mL 裂解缓冲液，剧烈颠倒 4–6 次以充分混匀，室温孵育 5 分钟。
    3. 加入 4 mL 预冷的中和缓冲液，颠倒离心管 4–6 次以充分混匀，冰上孵育 15 分钟。
    4. 在 4 °C 条件下以 ≥20,000 × g 离心 30 分钟，将上清液转移至新离心管中，再次以 ≥20,000 × g 在 4 °C 离心 15 分钟。
    5. 用 4 mL 平衡缓冲液对层析柱进行平衡处理。
    6. 将上清液上样至层析柱中。
    7. 用 10 mL 洗涤缓冲液洗涤层析柱两次。
    8. 用 5 mL 预热（65 °C）的洗脱缓冲液洗脱 DNA。
    9. 向洗脱的 DNA 中加入 3.5 mL 异丙醇以沉淀 DNA，充分混匀后在 4 °C 条件下以 ≥15,000 × g 离心 30 分钟，小心弃去上清液。
    10. 用 2 mL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀，在 4 °C 条件下以 ≥15,000 × g 离心 10 分钟，小心弃去上清液。
    11. 将 DNA 沉淀室温干燥 5–10 分钟，用适量 PCR 级水溶解，获得终浓度为 1 µg/mL 的 DNA 溶液。
      ​注意：请勿使用缓冲液溶解 DNA，因其不适合电穿孔实验。陈旧的质粒 DNA 制备样品无法获得重编程克隆。
  3. 通过 EcoRI 限制性酶切验证质粒
    1. 将 15 µL 无核酸酶水、2 µL 10× 酶切缓冲液、1 µg 质粒 DNA 和 1 µL EcoRI 酶混合，轻轻混匀。
    2. 将反应体系置于 37 °C 金属浴中孵育 15 分钟。
    3. 将酶切后的质粒样品与 6× DNA 凝胶上样染料混合，在含 0.5 µg/mL 溴化乙锭的 1× TAE 缓冲液中进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，同时设置 DNA 标准分子量标记。待 DNA 条带充分分离后成像。预期的 EcoRI 酶切片段大小分别为：pCXLE-hOCT3/4-shp53-F 为 6,834 bp、3,758 bp 和 1,108 bp；pCXLE-hUL 为 10,200 bp 和 1,900 bp；pCXLE-hSK 为 10,200 bp 和 2,500 bp。

3. 核转染

  1. 细胞沉淀
    1. 将分离的胎儿绒毛膜绒毛成纤维细胞在含5 mL完全培养基的T25培养瓶中培养至80-90%汇合度。
    2. 用PBS洗涤细胞两次，并按照步骤1.2.2.1 - 1.2.2.3所述进行胰酶消化处理。
    3. 去除上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL低血清培养基（例如Opti-MEM）中。用血细胞计数板计数细胞，并取106个细胞用于核转染。在225 × g下离心5分钟，彻底去除上清液。
  2. 试剂配制与核转染
    1. 通过混合0.5 mL补充剂和2.25 mL核转染溶液（均来自试剂盒）配制核转染试剂。
    2. 取100 µL核转染溶液加入1.5 mL离心管中。向管中加入pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSK和pCXLE-hUL质粒各1 µg。将步骤3.1.2中获得的106个细胞轻轻重悬于该混合液中。
    3. 将细胞-DNA悬液转移至电转杯（试剂盒提供）中，确保样品均匀覆盖电转杯底部且无气泡。盖上电转杯盖，插入电转仪中，选择核转染程序U-23（高效模式）并启动。
    4. 从电转仪中取出电转杯，加入1 mL完全培养基。轻柔地将内容物转移至已加入4 mL完全培养基的60 mm组织培养处理的培养皿中（终体积为5 mL）。将细胞置于37 °C、湿润的CO2培养箱中孵育。
    5. 24小时后，检查细胞是否贴壁，并完全更换培养基。
      注：核转染后细胞死亡率较高，仅有少量活细胞能够贴壁。
    6. 在完全培养基中继续培养细胞10天，随后转入多能性培养基中培养20天。
      ​注：需定期观察细胞，追踪重编程过程中发生的形态学变化（如上皮样形态及紧密集落形成），以确认实验进展。在多能性培养基中培养约20天后，可观察到约25个iPSC集落。

4. iPSC 克隆的挑选与扩增

  1. 从重编程培养板中挑选克隆
    1. 使用拉制的玻璃移液管或1 mL注射器针头，手动分离重编程培养皿中形成的类似胚胎干细胞的克隆，并将其转移至预先准备好的、含有经灭活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的培养板中，使用多能性培养基进行培养；或在Matrigel包被的培养板上使用mTESR培养基建立无饲养层的培养体系。
      ​注意：小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）通过酶消化法从小鼠胚胎中分离获得（取自妊娠13–14天的雌性小鼠），并通过丝裂霉素C处理实现有丝分裂失活。通过将重编程培养板中的单个克隆分别接种于不同的培养皿中培养，可建立单克隆细胞群体；或将多个克隆转移至同一培养皿中培养，以建立混合克隆细胞群体。
  2. 将新生克隆机械转移至新鲜饲养层并传代以建立稳定的iPSCs
    1. 在多能性培养基中培养iPSCs，每两天更换一次培养基，每5–7天按1:3比例传代。使用KnockOut血清替代物与DMSO按9:1比例配制的冷冻液进行程序性冻存，以制备细胞库。
      NOTE: 在iPSCs的冻存过程中，使用KnockOut血清替代物而非FBS作为冷冻液成分，因为FBS中的某些成分可能在长期保存过程中诱导多能性细胞发生分化。

5. 诱导多能干细胞的表征

注意：在第五代之后进行包括PCR和多能性生物标志物免疫染色在内的表征研究。核型分析在更晚的代数进行。

  1. 核型分析
    1. 在37 °C、湿润的CO2培养箱中，用秋水仙胺处理一个汇合的60 mm培养皿中的iPSC细胞，持续45分钟。
    2. 用0.05%胰蛋白酶消化收获细胞，并进行离心。弃去上清液，用移液器轻轻吹打残留的培养基以松解细胞沉淀。
    3. 加入5 mL低渗溶液，通过倒置离心管混匀，于37 °C孵育20分钟。在225 × g下离心5分钟。
      注：所得沉淀应呈蓬松状。
    4. 缓慢加入2.5 mL卡诺氏固定液，同时轻弹管壁以松解沉淀。
    5. 将细胞悬液滴加到洁净的玻璃载玻片上，制备用于核型分析的展片。
    6. 用0.15%胰蛋白酶处理载玻片1分钟，用PBS洗涤一次。随后用吉姆萨染液染色4分钟，最后用蒸馏水冲洗。使用适当的软件进行图像采集与分析。
  2. 证明无外源基因状态
    1. 基因组DNA提取
      1. 将20 µL蛋白酶加入1.5 mL微量离心管底部。
      2. 向该微量离心管中加入200 µL用PBS重悬的TSiPSC细胞。
      3. 向样品中加入200 µL Buffer AL，通过脉冲式涡旋混合15秒。
      4. 在56 °C孵育10分钟。
      5. 短暂离心微量离心管，以去除管盖内壁的液滴。
      6. 向样品中加入200 µL乙醇（96–100%），再次通过脉冲式涡旋混合15秒。混合后，短暂离心以去除管盖内壁的液滴。
      7. 小心地将上一步所得混合液转移至微型离心柱（置于2 mL收集管中），注意不要润湿边缘。盖上盖子，在6000 × g下离心1分钟。弃去含有滤液的收集管，将微型离心柱放入一个新的洁净2 mL收集管中。
      8. 小心打开微型离心柱，不润湿边缘的情况下加入500 µL Buffer AW1。盖上盖子，在6000 × g下离心1分钟。将微型离心柱转移至新的洁净2 mL收集管中，弃去含有滤液的旧收集管。
      9. 小心打开微型离心柱，不润湿边缘的情况下加入500 µL Buffer AW2。盖上盖子，在最大转速（20,000 × g）下离心3分钟。
      10. 将微型离心柱放入新的2 mL收集管中，弃去含有滤液的旧收集管。在最大转速下再离心1分钟，以彻底去除可能残留的Buffer AW2。
      11. 将微型离心柱放入一个洁净的1.5 mL微量离心管中，弃去含有滤液的收集管。小心打开微型离心柱，加入200 µL Buffer AE或蒸馏水。室温（15–25 °C）孵育5分钟，然后在6000 × g下离心1分钟。
    2. 外源基因清除状态PCR检测（使用KAPA HiFi PCR试剂盒KR0368）
      1. 确保所有试剂已完全解冻并充分混匀。
      2. 根据表2配制PCR主混合液，包含所有反应组分的适当体积（在冰上配制反应体系）。
      3. 将适量的PCR主混合液、模板和引物分别加入各个PCR管中。
      4. 盖紧各反应管，混匀后短暂离心。
      5. 按照表3进行PCR扩增。
  3. 多能性生物标志物鉴定
    1. 碱性磷酸酶（AP）染色
      1. 每10 cm2培养面积，用1.5 mL DMEM/F-12稀释3 µL 500倍浓缩液，配制1x AP活细胞染色工作液。
      2. 从iPSC培养皿中移除培养基，用DMEM/F-12洗涤一次。将1x AP活细胞染色液加入iPSC细胞中，在37 °C孵育45分钟。
      3. 移除AP染色液，用DMEM/F-12洗涤两次。加入新鲜DMEM/F-12，并在染色后30–90分钟内使用标准FITC滤光片在荧光显微镜下成像。
    2. 多能性生物标志物免疫染色
      1. 用4%多聚甲醛在4 °C过夜固定汇合的iPSC细胞。用PBST（含吐温20的PBS）洗涤三次，每次5分钟。
      2. 在室温下用含0.3% Triton X-100的PBST对细胞进行15分钟透化处理。用PBST洗涤三次。
        ​注：透化处理仅适用于细胞内抗原。
      3. 用含3%牛血清白蛋白（BSA）的PBST在室温下封闭细胞30分钟。加入用1% BSA稀释的1:1000的一抗，4 °C孵育过夜。一抗孵育结束后，用PBST洗涤三次。
      4. 在室温下用1:1000稀释于1% BSA中的二抗孵育细胞5小时。用PBST洗涤三次。
      5. 用0.5 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核染色1分钟。用PBST洗涤一次。
      6. 在荧光显微镜下采集图像。

6. ​体外分化实验

  1. 拟胚体（EB）分化
    1. 将iPSC集落切成小块，收集后接种于低黏附性培养皿中，并加入拟胚体培养基。每3天更换一次培养基，连续培养15天。
      注意：第15天的拟胚体可直接用于三胚层生物标志物的检测。或者，可使用生长因子诱导特定细胞谱系，随后进行生物标志物检测。
  2. 内胚层（肝细胞）分化
    1. 在多能性培养基中以单层培养方式培养iPSCs。
    2. 待细胞融合后，转入含1×胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin Transferrin Selenite）、100 ng/mL激活素A（activin A）的RPMI 1640培养基中培养2天，随后在含30 ng/mL bFGF和20 ng/mL BMP4的RPMI 1640培养基中继续培养9天。每2天更换一次培养基。
    3. 从第10天开始，培养基中添加0.1 µM地塞米松。实验于第20天结束。
  3. 中胚层（心肌细胞）分化
    1. 将第8天的拟胚体接种于0.5% Matrigel包被的培养板中，使用拟胚体培养基。让拟胚体贴壁并塌陷。
    2. 在培养基中添加 20 ng/mL BMP4，并培养 20 天。每 2-3 天更换一次培养基。第 20 天终止实验。
  4. 外胚层（神经元）分化
    1. 将第4天的EB接种于2 µg/cm的培养板上2 在含有胚胎体培养基的IV型胶原包被板中，使胚胎体（EBs）贴壁并塌陷。
    2. 次日，将培养基更换为含2mg/mL葡萄糖、1×胰岛素-转铁蛋白-硒（Insulin Transferrin Selenite）和2.5µg/mL纤连蛋白（fibronectin）的DMEM/F-12培养基。实验于第15天终止。
  5. 脑类器官的形成
    1. 在35 mm组织培养皿中的MEFs上培养TSiPSCs至70-80%汇合度。切割细胞集落并收集至15 mL离心管中。在225 × g下离心5分钟。弃去上清液。
    2. 将菌落碎片重悬于2 mL PBS中洗涤，离心去除上清液。
    3. 加入1 mL 0.05%胰蛋白酶，轻敲试管以使细胞脱落。将试管置于37 °C孵育3–4 min，使菌落碎片解离为单细胞悬液。
    4. 通过加入4 mL含10 µg/mL Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632二盐酸盐（ROCKi）的多能性培养基稀释胰蛋白酶，以中和其活性，防止解离诱导的细胞死亡。
    5. 离心以获得沉淀。弃去上清液，将细胞重悬于2 mL含有10 µg/mL ROCKi的拟胚体培养基中。
    6. 取10 µL细胞悬液进行细胞计数。加入10 µL台盼蓝以检测死细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
    7. 加入适量含ROCKi的拟胚体培养基至细胞悬液中，使每150 µL含有9,000个活细胞。
    8. 在低吸附96孔板的每孔中接种150 µL，置于37 °C、含湿润CO2的培养箱中孵育。24小时后观察成球情况。第2天轻轻吸除培养基，更换为不含ROCKi的新鲜拟胚体培养基。
    9. 第6天，将拟胚体转移至低吸附24孔板的孔中，每孔含500 µL神经诱导培养基，该培养基由DMEM-F12、1% N2添加剂、2 mM GlutaMAX添加剂、1 mM非必需氨基酸和1 µg/mL肝素组成。每2天更换一次培养基。
    10. 在神经诱导培养基中培养5天后，将神经上皮细胞团嵌入Matrigel中。取一张2 cm × 2 cm的Parafilm膜，覆盖在装有200 µL吸头的空吸头盒上。戴手套的手指按压Parafilm膜，使其在吸头盒每个孔上方形成小凹陷。用70%乙醇清洁Parafilm膜以达到消毒目的。
    11. 将Parafilm小方片转移至60 mm培养皿中。使用剪去尖端的200 µL枪头将神经上皮细胞聚集体转移至Parafilm的凹陷处。用移液器吸除多余培养基。
    12. 在神经上皮细胞团上加入30 µL解冻的Matrigel，用移液器吸头将细胞团移至Matrigel中央。将60 mm培养皿置于37 °C培养箱中20–30分钟，使Matrigel聚合。
    13. 加入5 mL脑类器官分化培养基，该培养基由1:1的DMEM-F12: Neurobasal培养基、0.5% N2添加剂、2.5 µg/mL胰岛素、2 mM GlutaMAX添加剂、0.5 mM NEAA、1% B27添加剂以及2.5 mL青霉素-链霉素组成。
    14. 使用无菌镊子将Parafilm膜翻转，轻轻振荡培养皿，直至包埋在Matrigel中的细胞团块从膜上脱落并落入培养基中。将包埋的细胞团块置于湿润的CO₂培养箱中继续培养。2 在37 °C培养箱中培养4天，每隔一天更换一次培养基。
    15. 静置培养4天后，将60 mm培养皿置于放置于培养箱内的轨道摇床中，以50 rpm振荡培养。使用脑类器官分化培养基每3天完全更换一次培养液，持续培养类器官3个月。

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结果

从核型为45XO的自然流产胎儿中生成无整合iPSCs
我们从具有特纳综合征（TS）特异性45,XO核型的特纳综合征患者成纤维细胞（FCV）中分离出成纤维细胞，并利用附加体型重编程质粒对其进行核转染，以生成TS诱导性多能干细胞（TSiPSCs），可用于后续对该综合征特别是其相关的神经功能缺陷进行建模研究。图1a&b）。我们采用非整合型附加体质粒和核转染技术进行转染实验（图1 c&d）。我们通过监测细胞形态学变化来评估重编程是否成功。观察到细胞从成纤维细胞形态转变为上皮样形态，随后形成界限清晰的紧凑集落（图 2a）。转染后约第20天，TSiPSCs呈现出类似人类胚胎干细胞的形态，边缘清晰，核质比高。图2b相比之下，重编程不完全的细胞虽获得上皮样形态，但无法形成致密的克隆集落。

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讨论

建立具有细胞遗传学异常的胎儿组织的稳定细胞模型，对于持续保留缺陷表型是必要的。诱导多能干细胞（iPSC）方法是用于长期保存缺陷特性的最有效的细胞制备手段20。

多能干细胞（PSC）具有自我更新能力，并能分化为类似于早期卵裂胚胎的特化细胞21。因此，PSC 可作为研究早孕期自然流产胎儿中早期分子、细胞及发育缺陷的优良模型。

本文介绍了利用核转染技术结合改良的附加体型载体生成人类诱导多能干细胞（iPSC）的方法。结果表明，该组合是一种高效且稳健的方法，可用于生成无整合的人类iPSC细胞系，这一点已由单次转染即可成功实现重编程的结果所证实。我们通过显微镜观察了FCV成纤维细胞逐步转化为多能性细胞的过程。转染后20天，我们观察到重编程产生的TSiPSC细胞集落，周围仍残留未重编程的FCV成纤维细胞。形态学上，所获得的人类iPSC与实验室中同步培养的胚胎干细胞相似，通常形成结构致密、边缘光亮的细胞集落。集落中的细胞具有较大的细胞核，排列紧密，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

上述研究的经费由马尼帕尔高等教育学院提供。该品系的表征工作部分在印度国家生物科学中心M. M. Panicker的实验室完成。我们感谢Anand诊断实验室在核型分析方面提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.15% 胰蛋白酶赛默飞世尔科技27250018G显带
2-巯基乙醇赛默飞世尔科技21985023多能性与拟胚体培养基
4',6-二脒基-2-苯基吲哚Sigma AldrichD8417免疫细胞化学
激活素ASigma AldrichSRP3003分化检测
活细胞碱性磷酸酶染色赛默飞世尔科技A14353碱性磷酸酶染色
AMAXA Nucleofector IILonza-核转染
AmnioMAX II 完全培养基赛默飞世尔科技，Gibco11269016适用于胎儿绒毛细胞培养的培养基
氨苄青霉素HiMediaTC021质粒纯化
抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 488InvitrogenA11059免疫细胞化学
抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488InvitrogenA11034免疫细胞化学
抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 546InvitrogenA11035免疫细胞化学
抗生素-抗真菌剂赛默飞世尔科技，Gibco15240096污染控制
抗E-钙黏蛋白BD Biosciences610181免疫细胞化学
抗NanogBD Biosciences560109免疫细胞化学
抗OCT3/4BD Biosciences611202免疫细胞化学
抗SOX17BD Biosciences561590免疫细胞化学
抗SOX2BD Biosciences561469免疫细胞化学
抗SSEA4BD Biosciences560073免疫细胞化学
抗TRA 1-81MilliporeMAB4381免疫细胞化学
碱性成纤维细胞生长因子[FGF2]Sigma AldrichF0291多能性培养基
骨形态发生因子4Sigma AldrichSRP3016分化检测
牛血清白蛋白Sigma AldrichA3059封闭
人Ⅳ型胶原蛋白BD Biosciences354245分化检测
胶原酶混合物Sigma AldrichC8051消化胎儿绒毛组织
地塞米松Sigma AldrichD4902分化检测
DMEM F12赛默飞世尔科技11320033分化检测
FastDigest EcoR1赛默飞世尔科技FD0274限制性酶切
纤连蛋白Sigma AldrichF2518分化检测
吉姆萨染色HiMediaS011G显带
冰醋酸HiMediaAS001核型分析用固定剂
葡萄糖Sigma AldrichG7528分化检测
GlutaMAX赛默飞世尔科技35050061多能性与拟胚体培养基
肝素钠Sigma AldrichH3149分化检测
人胰岛素溶液Sigma AldrichI9278分化检测
胰岛素-转铁蛋白-硒酸盐Sigma AldrichI1884分化检测
KAPA HiFi PCR 试剂盒Kapa BiosystemsKR0368OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid赛默飞世尔科技15210040有丝分裂阻滞用于核型分析
KnockOut DMEM赛默飞世尔科技10829018多能性与拟胚体培养基
KnockOut血清替代物赛默飞世尔科技10828028多能性与拟胚体培养基
Luria Bertani 琼脂HiMediaM1151F质粒纯化
基质胶BD Biosciences356234分化检测
MEM 非必需氨基酸赛默飞世尔科技11140035多能性与拟胚体培养基
甲醇HiMediaMB113核型分析用固定剂
肌球蛋白心室重链 α/βMilliporeMAB1552免疫细胞化学
NHDF Nucleofector 试剂盒LonzaVAPD-1001核转染
多聚甲醛（PFA）Sigma AldrichP6148固定细胞
pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene27077游离型重编程质粒
pCXLE-hSKAddgene27078游离型重编程质粒
pCXLE-hULAddgene27080游离型重编程质粒
青霉素-链霉素  赛默飞世尔科技 15070063多能性与拟胚体培养基
鬼笔环肽-异硫氰酸四甲基罗丹明Sigma AldrichP1951免疫细胞化学
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP44171 × PBS 1片PBS溶于200 mL去离子水中，经高压灭菌
储存条件：室温。
PBST - 含 0.05% Tween 20 的 1X PBS
储存条件：室温。
质粒纯化试剂盒-中量提取QIAGEN12143质粒纯化
氯化钾溶液HiMediaMB043核型分析用低渗溶液
QIAamp DNA Blood KitQiagen51104基因组DNA提取
RPMI 1640赛默飞世尔科技11875093肝细胞分化培养基
柠檬酸钠HiMediaRM255核型分析用低渗溶液
Triton X-100HiMediaMB031透化
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）赛默飞世尔科技，Gibco25300054传代培养  胎儿绒毛膜绒毛成纤维细胞
Tween 20HiMediaMB067PBST 的制备
β βIII 微管蛋白Sigma AldrichT8578免疫细胞化学
Y-27632 二盐酸盐Sigma AldrichY0503分化检测

参考文献

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染色体非整倍性诱导多能干细胞生成附加体型重编程成纤维细胞分离多能性标志物拟胚体形成三胚层分化神经认知缺陷
从特纳综合征（45,XO）胎儿细胞生成诱导性多能干细胞用于下游建模该综合征相关的神经功能缺陷
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