从特纳综合征（45,XO）胎儿细胞生成诱导性多能干细胞用于下游建模该综合征相关的神经功能缺陷

摘要

本方案描述了通过核转染递送附加体质粒，从胎儿组织成纤维细胞生成无整合的诱导多能干细胞（iPSCs），并进一步阐述了用于iPSC鉴定及神经元分化的实验方法。

摘要

染色体非整倍性可导致严重的先天性畸形，包括中枢神经系统畸形以及胎儿死亡。产前遗传学筛查仅为诊断性手段，无法阐明疾病机制。尽管来自非整倍体胎儿的细胞是携带染色体非整倍性的宝贵生物材料，但这些细胞寿命较短，限制了其在后续科研实验中的应用。诱导性多能干细胞（iPSC）模型的建立是一种有效的细胞制备方法，可实现非整倍体特征的长期保存。这类细胞具有自我更新能力，并可分化为类似于胚胎发育过程中的特化细胞，因此iPSC是研究早期发育事件的优良工具。特纳综合征（TS）是一种与X染色体完全或部分缺失相关的罕见疾病，其特征包括不孕、身材矮小、内分泌、代谢、自身免疫和心血管系统疾病，以及神经认知缺陷。本方案描述了从TS（45,XO）胎儿组织中分离并培养成纤维细胞，通过核转染递送附加体型重编程质粒生成无整合的TSiPSC，随后进行表征分析的完整流程。重编程获得的TSiPSC首先通过活细胞碱性磷酸酶染色进行初步筛选，再通过广泛检测多能性生物标志物进行深入验证。挑选出的克隆通过机械法解剖，连续传代数次后，获得稳定自我更新的细胞用于后续实验。这些细胞表达多能性转录因子OCT4、NANOG、SOX2，以及多能干细胞典型的细胞表面标志物SSEA-4和TRA1-81。重编程后，原始的45,XO核型得以保留。TSiPSC能够形成拟胚体，并分化为表达谱系特异性生物标志物的内胚层、中胚层和外胚层细胞（SRY BOX17、MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β、βIII TUBULIN）。外源附加体型质粒在细胞中自发丢失，在传至第15代后已无法检测到。这些TSiPSC是研究特纳综合征相关神经认知缺陷背后异常分子与细胞神经发育过程的宝贵细胞资源。

引言

非整倍体会导致人类出生缺陷或先天性畸形以及妊娠丢失。约50%至70%的妊娠丢失样本显示出细胞遗传学异常。在妊娠早期丢失的非整倍体胚胎难以获取用于实验分析，因此有必要开发其他能够紧密模拟人类胚胎发育的模型。已利用携带遗传病诊断结果的细胞所衍生的诱导性多能干细胞（iPSCs）来模拟代表性遗传异常及其对胎儿发育的影响^1,2,3,4。这些iPSCs类似于发育中胚胎的上胚层细胞，能够重现胚胎形成的早期事件，有助于理解并表征早期哺乳动物胚胎中细胞谱系的发育程序与模式形成。此前由产前诊断检测中获得的非整倍体综合征（如X单体（特纳综合征）、8三体（瓦尔科尼综合征2型）、13三体（帕陶综合征）以及部分11号与22号染色体三体（埃马纽埃尔综合征））的皮肤成纤维细胞和羊水细胞所衍生的iPSCs，已为研究发育失败机制提供了重要见解⁴。

特纳综合征（TS）是一种罕见疾病，其特征为女性不孕、身材矮小、内分泌和代谢紊乱、自身免疫性疾病风险增加，以及易患心血管疾病⁵。尽管它是唯一可存活的单体综合征，但仍可导致胚胎发育过程中死亡，引起自然流产

方案

FCV 毒株由班加罗尔玛希普尔医院提供，并已获得玛希普尔医院伦理委员会批准。

注意：所有缓冲液和溶液的成分见表1。

1. 从胎儿绒毛膜绒毛（FCV）中分离成纤维细胞

1. 样本采集及胶原酶消化组织
   1. 在无菌条件下用磷酸盐缓冲液（PBS）收集绒毛膜绒毛（FCV），并在室温下运送至细胞培养实验室。
   2. 将绒毛转移至60 mm培养皿中，用含1×抗生素-抗真菌素溶液（PBS-AA）的PBS反复洗涤数次（至少4次），然后用移液器彻底去除PBS-AA。
   3. 用1 mL胶原酶混合液（5 mg/mL）在37 °C处理绒毛膜绒毛5分钟。
   4. 加入含10%胎牛血清（FBS）的细胞培养基中和反应，将消化液转移至15 mL离心管中，在225 × g条件下离心5分钟，收集解离的绒毛及释放的细胞沉淀。
2. 传代培养与细胞库扩增
   1. 将解离后的绒毛连同释放的细胞接种于含5 mL完全培养基（如AmnioMAX）的T25培养瓶中，培养至获得融合的成纤维细胞单层。
   2. 进一步扩增成纤维细胞以制备细胞库，用于后续转染和表征实验，步骤如下：
      ....

结果

从核型为45XO的自然流产胎儿中生成无整合iPSCs
我们从具有特纳综合征（TS）特异性45,XO核型的特纳综合征患者成纤维细胞（FCV）中分离出成纤维细胞，并利用附加体型重编程质粒对其进行核转染，以生成TS诱导性多能干细胞（TSiPSCs），可用于后续对该综合征特别是其相关的神经功能缺陷进行建模研究。图1a&b）。我们采用非整合型附加体质粒和核转染技术进行转染实验（图1 c&d）。我们通过监测细胞形态学变化来评估重编程是否成功。观察到细胞从成纤维细胞形态转变为上皮样形态，随后形成界限清晰的紧凑集落（图 2a）。转染后约第20天，TSiPSCs呈现出类似人类胚胎干细胞的形态，边缘清晰，核质比高。图2b相比之下，重编程不完全的细胞虽获得上皮样形态，但无法形成致密的克隆集落。

讨论

建立具有细胞遗传学异常的胎儿组织的稳定细胞模型，对于持续保留缺陷表型是必要的。诱导多能干细胞（iPSC）方法是用于长期保存缺陷特性的最有效的细胞制备手段²⁰。

多能干细胞（PSC）具有自我更新能力，并能分化为类似于早期卵裂胚胎的特化细胞²¹。因此，PSC 可作为研究早孕期自然流产胎儿中早期分子、细胞及发育缺陷的优良模型。

本文介绍了利用核转染技术结合改良的附加体型载体生成人类诱导多能干细胞（iPSC）的方法。结果表明，该组合是一种高效且稳健的方法，可用于生成无整合的人类iPSC细胞系，这一点已由单次转染即可成功实现重编程的结果所证实。我们通过显微镜观察了FCV成纤维细胞逐步转化为多能性细胞的过程。转染后20天，我们观察到重编程产生的TSiPSC细胞集落，周围仍残留未重编程的FCV成纤维细胞。形态学上，所获得的人类iPSC与实验室中同步培养的胚胎干细胞相似，通常形成结构致密、边缘光亮的细胞集落。集落中的细胞具有较大的细胞核，排列紧密，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.15% 胰蛋白酶	赛默飞世尔科技	27250018	G显带
2-巯基乙醇	赛默飞世尔科技	21985023	多能性与拟胚体培养基
4',6-二脒基-2-苯基吲哚	Sigma Aldrich	D8417	免疫细胞化学
激活素A	Sigma Aldrich	SRP3003	分化检测
活细胞碱性磷酸酶染色	赛默飞世尔科技	A14353	碱性磷酸酶染色
AMAXA Nucleofector II	Lonza	-	核转染
AmnioMAX II 完全培养基	赛默飞世尔科技，Gibco	11269016	适用于胎儿绒毛细胞培养的培养基
氨苄青霉素	HiMedia	TC021	质粒纯化
抗小鼠 IgG（H+L）Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11059	免疫细胞化学
抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11034	免疫细胞化学
抗兔IgG（H+L）Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	免疫细胞化学
抗生素-抗真菌剂	赛默飞世尔科技，Gibco	15240096	污染控制
抗E-钙黏蛋白	BD Biosciences	610181	免疫细胞化学
抗Nanog	BD Biosciences	560109	免疫细胞化学
抗OCT3/4	BD Biosciences	611202	免疫细胞化学
抗SOX17	BD Biosciences	561590	免疫细胞化学
抗SOX2	BD Biosciences	561469	免疫细胞化学
抗SSEA4	BD Biosciences	560073	免疫细胞化学
抗TRA 1-81	Millipore	MAB4381	免疫细胞化学
碱性成纤维细胞生长因子[FGF2]	Sigma Aldrich	F0291	多能性培养基
骨形态发生因子4	Sigma Aldrich	SRP3016	分化检测
牛血清白蛋白	Sigma Aldrich	A3059	封闭
人Ⅳ型胶原蛋白	BD Biosciences	354245	分化检测
胶原酶混合物	Sigma Aldrich	C8051	消化胎儿绒毛组织
地塞米松	Sigma Aldrich	D4902	分化检测
DMEM F12	赛默飞世尔科技	11320033	分化检测
FastDigest EcoR1	赛默飞世尔科技	FD0274	限制性酶切
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F2518	分化检测
吉姆萨染色	HiMedia	S011	G显带
冰醋酸	HiMedia	AS001	核型分析用固定剂
葡萄糖	Sigma Aldrich	G7528	分化检测
GlutaMAX	赛默飞世尔科技	35050061	多能性与拟胚体培养基
肝素钠	Sigma Aldrich	H3149	分化检测
人胰岛素溶液	Sigma Aldrich	I9278	分化检测
胰岛素-转铁蛋白-硒酸盐	Sigma Aldrich	I1884	分化检测
KAPA HiFi PCR 试剂盒	Kapa Biosystems	KR0368	OriP, EBNA1 PCR
KaryoMAX Colcemid	赛默飞世尔科技	15210040	有丝分裂阻滞用于核型分析
KnockOut DMEM	赛默飞世尔科技	10829018	多能性与拟胚体培养基
KnockOut血清替代物	赛默飞世尔科技	10828028	多能性与拟胚体培养基
Luria Bertani 琼脂	HiMedia	M1151F	质粒纯化
基质胶	BD Biosciences	356234	分化检测
MEM 非必需氨基酸	赛默飞世尔科技	11140035	多能性与拟胚体培养基
甲醇	HiMedia	MB113	核型分析用固定剂
肌球蛋白心室重链 α/β	Millipore	MAB1552	免疫细胞化学
NHDF Nucleofector 试剂盒	Lonza	VAPD-1001	核转染
多聚甲醛（PFA）	Sigma Aldrich	P6148	固定细胞
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	游离型重编程质粒
pCXLE-hSK	Addgene	27078	游离型重编程质粒
pCXLE-hUL	Addgene	27080	游离型重编程质粒
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15070063	多能性与拟胚体培养基
鬼笔环肽-异硫氰酸四甲基罗丹明	Sigma Aldrich	P1951	免疫细胞化学
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P4417	1 × PBS 1片PBS溶于200 mL去离子水中，经高压灭菌 储存条件：室温。 PBST - 含 0.05% Tween 20 的 1X PBS 储存条件：室温。
质粒纯化试剂盒-中量提取	QIAGEN	12143	质粒纯化
氯化钾溶液	HiMedia	MB043	核型分析用低渗溶液
QIAamp DNA Blood Kit	Qiagen	51104	基因组DNA提取
RPMI 1640	赛默飞世尔科技	11875093	肝细胞分化培养基
柠檬酸钠	HiMedia	RM255	核型分析用低渗溶液
Triton X-100	HiMedia	MB031	透化
胰蛋白酶-EDTA（0.05%）	赛默飞世尔科技，Gibco	25300054	传代培养  胎儿绒毛膜绒毛成纤维细胞
Tween 20	HiMedia	MB067	PBST 的制备
β βIII 微管蛋白	Sigma Aldrich	T8578	免疫细胞化学
Y-27632 二盐酸盐	Sigma Aldrich	Y0503	分化检测