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方法文章

利用FRET敏化发射在活细胞中评估蛋白质相互作用

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DOI：

10.3791/62241

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2021年4月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen, 2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

本文内容

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摘要

两种荧光分子之间的弗ör斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。本文提供了一种通过共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射以及供体分子的淬灭来测量活细胞中FRET的实验方案。

摘要

荧光共振能量转移（FRET）是指能量从一个被激发的供体分子非辐射性地转移到受体分子的过程，该过程依赖于分子间的距离和取向，以及供体发射光谱与受体吸收光谱之间的重叠程度。FRET 可用于在活细胞中随时间推移及在不同亚细胞区域研究蛋白质之间的相互作用。文献中已报道了多种基于显微镜强度测量的 FRET 分析算法。本文提供了一种定量 FRET 效率的实验方案和算法，该方法基于对受体分子的敏化发射以及供体分子荧光淬灭的测量。在活细胞中进行比率型 FRET 定量不仅需要确定荧光蛋白之间的串扰（光谱溢出或渗漏），还需要明确显微镜系统的检测效率。本文所提供的实验方案详细说明了如何评估这些关键参数。

引言

基于显微镜的荧光共振能量转移（FRET）分析可用于评估活细胞中蛋白质之间的相互作用。该方法可提供空间和时间信息，包括相互作用发生在细胞内的位置及特定亚细胞区域，以及这种相互作用是否随时间发生变化。

Theodor Förster 于 1948 年奠定了 FRET 的理论基础1。FRET 是一种从激发态供体分子到受体分子的无辐射能量转移过程，其发生依赖于分子间的距离、跃迁偶极子的相对取向，以及供体发射光谱与受体吸收光谱之间的重叠程度。能量转移速率与供体-受体距离的六次方成反比。因此，FRET 可用于测量 1-10 nm 范围内的分子间接近程度。

FRET 与供体分子的其他去激发过程相竞争，导致所谓的供体淬灭和受体的敏化发射。供体淬灭是指发射的供体光子数量减少，而敏化发射是指发射的受体光子数量增加。许多显微镜下的 FRET 分析采用荧光强度测量方法，包括受体光漂白2、供体光漂白2或受体的 FRET 敏化光漂白3。

本文提供了一种逐步的实验方案和数学算法，用于通过供体荧光淬灭和受体敏化发射来定量FRET4,5，该方法通常被称为比例法FRET。尽管已有许多关于如何估算敏化发射的实验方案发表，但能够定量绝对FRET效率的研究仍较少6,7,8,9。在活细胞中定量FRET效率需要确定：（i）荧光蛋白之间的串扰（光谱溢出或渗漏），以及（ii）显微成像系统的检测效率。虽然可通过仅表达单一荧光团的细胞成像来评估串扰，但评估供体与受体荧光的相对检测效率则更为复杂，需要至少知道产生所测信号的供体与受体分子数量之比。然而，在活细胞中表达的荧光分子数量因细胞而异且未知。所谓的α因子用于表征单个激发态供体与受体分子所产生的信号强度之比。在进行活细胞成像且供体与受体分子比例可变的情况下，若要实现定量的比例法FRET测量，必须事先知晓该α因子。使用1:1供体-受体融合蛋白作为校准探针，可用来测定α因子，同时也可作为阳性对照。这种基因连接的探针在细胞内的总表达量未知，但其供体与受体的相对表达量固定且已知为1:1。以下实验方案详细说明了如何构建该1:1探针，并如何利用其进行FRET效率的定量分析。所有计算公式均包含在一个电子表格中，该表格作为补充材料提供，读者可根据下文说明将自己的测量数据填入相应列中。

尽管本实验方案使用GFP-Cherry作为供体/受体组合，但所介绍的方法也可与其他任何FRET组合联用。补充文件1提供了关于青色-黄色组合的详细信息。

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方案

1. 质粒构建

  1. 为构建 eGFP-mCherry1 融合探针，使用带有 mCherry110 的 N1 哺乳动物细胞表达载体（见材料表），通过限制性酶切位点 AgeI 和 BsrGI 插入。
  2. 使用以下寡核苷酸扩增无终止密码子的 eGFP11，获得 SalI-BamHI 片段：N 端引物 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' 和 C 端引物 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'。
  3. 将该 SalI-BamHI 片段插入 N1 载体的多克隆位点，以在绿色和红色荧光蛋白之间引入 RNPPV 连接子（五氨基酸连接子）。
    注意：该连接子使 GFP-Cherry 供体-受体对的平均 FRET 效率约为 0.25–0.3（图 1A）。已有文献讨论了使用不同长度的刚性12和螺旋13连接子来标定测量的 FRET 效率，但本研究中构建融合蛋白无需此步骤。为简化后续描述，我们将荧光蛋白简称为“GFP”和“Cherry”。

2. 细胞培养与转染

  1. 使用任何细胞系（例如，NRK 细胞）在培养基（例如，Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM））中进行 FRET 实验 无 酚红，以减少背景荧光。出于相同原因，建议使用不含酚红的胰蛋白酶。
  2. 当细胞融合度达到80%时，使用1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞，用血球计数板（Neubauer计数室）对悬浮细胞进行计数，并将约10,000个细胞接种至8孔腔室载玻片的每个孔中；或者，从T25培养瓶中完全融合的细胞培养物中，取2 mL移液器的1滴细胞悬液，或从T12.5培养瓶中完全融合的培养物中取5 mL细胞悬液的3滴，进行接种。
  3. 在8孔板（0.8 cm）中培养细胞2/ 孔）中，使用 #1.0 盖玻片，在标准细胞培养条件下进行荧光活细胞显微镜观察37°C 和5% CO₂2).
  4. 接种后24 h，使用合适的市售转染试剂对细胞进行转染（参见 材料表），分别加入GFP、Cherry、GFP/Cherry混合物（1:1混合，即 0.8 μg 和 0.8 μg GFP 和 Cherry 质粒 DNA，以及 GFP-Cherry 嵌合体。
    1. 用于转染，使用 5 μL 转染试剂的 45 μL DMEM的 1.6 μg 质粒DNA。通过轻轻弹击微量离心管进行混匀。
    2. 室温孵育混合物15分钟后，加入1-2 μL 将转染试剂混合物加入8孔腔室载玻片的每个孔中。将带腔室的盖玻片放回培养箱。
  5. 转染后等待20小时再进行活细胞成像，以确保荧光蛋白充分表达、正确折叠和成熟，尤其是红色荧光团。

3. FRET 成像

  1. 在37 °C的加湿加热环境培养箱中对转染细胞进行成像。为将细胞培养基缓冲至生理pH值，使用流速为5%的CO2气体，或添加20 mM HEPES以使细胞培养基不依赖CO2。
  2. 使用共聚焦激光扫描显微镜。按以下设置激发和发射参数，以优化信号并最小化串扰。
    1. 使用氩离子激光的488 nm谱线激发GFP，使用561 nm二极管泵浦固态激光器（或根据可用激光谱线选择543 nm氦氖激光器）激发Cherry。
    2. 在商用共聚焦显微镜的软件中进行如下设置：通过下拉菜单点击按钮，将二向色镜设为488/561。在通道1中使用488 nm激光激发，通过505 - 530 nm（或505 - 550 nm）的发射带通滤光片收集荧光；在通道2中使用长通滤光片>585 nm；在通道3中使用561 nm激光激发，并使用长通滤光片>585 nm（手动输入波长）。也可使用带通滤光片（例如590 - 650 nm或类似范围），其优势在于可排除拉曼散射。
  3. 依次使用两种激光激发，并将成像模式设为逐行切换，使512 × 512像素图像的激发在每一行后交替进行（而非每帧后切换，后者会因在不同激发条件下记录图像时标记蛋白的扩散而破坏FRET检测能力；通过点击按钮设置）。
  4. 通过点击按钮设置包含三幅图像的小型时间序列，以检测是否发生显著的光漂白，并视情况降低激光功率。光漂白率低于1%为最佳。高激光强度还可能导致吸收饱和，从而降低表观FRET效率14。在物镜处测得的激光功率在10-20 μW范围内是安全的。
  5. 首先对表达GFP-Cherry融合构建体的细胞进行成像。设置定义共聚焦图像中每个像素的时间积分激光强度的参数，即像素驻留时间（微秒）、声光可调滤波器（AOTF）透射率（百分比）和缩放倍数（Zoom）。
    1. 使用63倍油镜，并将缩放倍数（Zoom）设为3倍。此设置可提供足够的放大倍数和分辨率，以完整成像整个细胞。目标像素大小为70-80 nm。
    2. 将像素驻留时间设为2-4 μs，并设置488 nm和561 nm激光的AOTF透射率，使图像具有良好的信噪比，无光漂白现象，且无荧光强度饱和的像素。建议调节488 nm和561 nm激光功率，使通道1和通道3的信号水平相近。
    3. 将光电倍增管（平均模式）增益设为600-800。
  6. 使用上述参数对表达GFP-Cherry融合蛋白的15-20个细胞进行成像。15-20个细胞可提供良好的统计学数据，同时将FRET测量实验的总时间控制在数小时内，有助于确保显微系统的稳定性。
  7. 使用相同参数对仅表达GFP、仅表达Cherry、共表达GFP与Cherry以及未转染的细胞进行成像。分别在绿色通道或红色通道中寻找表达细胞。
  8. 随后，对15-20个分别与GFP和Cherry融合的感兴趣蛋白共表达的细胞进行成像。在寻找表达细胞时，应避免长时间曝光，以防荧光蛋白发生光漂白。Cherry的光稳定性低于GFP，若Cherry（受体）发生漂白，将影响FRET分析。
    注意：GFP与Cherry的吸收和发射光谱见补充图1。在连续测量5-6小时后，建议在成像实验结束时重复对若干表达GFP-Cherry嵌合体的细胞进行成像，以确认系统保持稳定，且在整个成像过程中GFP-Cherry融合蛋白的FRET效率未发生显著变化。

4. 利用供体淬灭和敏化发射检测绝对FRET效率的图像分析

注意：此处提供了一个实用的分步指南，介绍如何利用附带的电子表格（补充文件 2）来确定 FRET 效率。相关公式的理论基础和推导过程可参见以往的出版物4,15,16,17。在所述实验条件下，采集以下荧光强度数据。

  1. 测量供体信号 I1 在通道中 1供体通道，使用488 nm激发光，发射波长范围为505-530 nm。
    光谱分析中荧光强度测量的方程
    其中 ID 是不存在受体时在通道1中测得的未淬灭的供体信号，是平均FRET效率，以及 B1 通道1中的平均背景信号。
  2. 测量受体信号 I3 在通道3（受体通道）中，使用561 nm激发，发射波长为 >585 nm
    光谱学方程示意图，侧重吸收与发射分析。
    其中 IA 是受体信号并且 B3 通道3中的背景
  3. 使用488 nm激发，在通道2（能量转移通道）检测FRET信号，发射波长为 >585 nm
    光子学研究的物理方程，发射分析公式，光学光谱方法
    其中，通道2中的信号由四个不同组分构成：（i） ID(1 - E)S1 是淬灭的供体信号渗漏到光谱中的 >585 检测通道（含串扰因子） S1），（ii） IAS2 是由488 nm激光直接激发产生的受体信号（包含串扰因子） S2)，（iii） IDEα 是由激发态供体分子通过FRET引起的受体的敏化发射（α 将在4.8–4.10节中进一步详细说明，以及（iv） B2 是背景信号。
  4. 在未转染或模拟转染的细胞中测量通道1、2、3的平均背景荧光强度；两者均可，差异可忽略。对于所有细胞的测量，使用手绘工具勾画感兴趣区域，并避开具有较强自发荧光的核周囊泡。必须避免这些核周囊泡产生的显著自发荧光干扰。
    1. 将测量值输入到所提供电子表格的 X、Y 和 Z 列中。三个通道的平均背景强度分别输入到 Excel 电子表格的 A2、B2 和 C2 单元格中（补充文件 2).
  5. 测量单独表达 GFP 或 Cherry 的细胞在通道 1、2、3 中的平均荧光强度，并将测量值填入 C、D、E 列和 N、O、P 列。分别减去相应的背景强度（F、G、H 列和 Q、R、S 列）。
  6. 为了计算 E，FRET效率，确定串扰因子 S1 和 S2光谱串扰因子 S1 由仅表达GFP的细胞计算得出
    静态平衡比的公式；数学公式 S₁=(I₂-B₂)/(I₁-B₁)；用于教学。
    在 I 列中输入平均值 S1 到 Excel 电子表格的 D2 单元格中。
  7. 计算光谱串扰因子 S2 来自仅表达Cherry的细胞
    S2=I2-B2/I3-B3，方程，信号比率计算，物理学，数据分析，教学用途
    在T列中输入均值 S2 到 Excel 电子表格的 E2 单元格中。
  8. 确保α因子表示通道1中任意给定数量的激发态GFP分子所产生的信号与通道2中等量激发态Cherry分子所产生的信号之间的关系，并由以下公式定义：
    效率比公式；分数形式；静态平衡概念   荧光定量方程；量子产率 Q 的计算公式
    其中 QA 和 QD Cherry 和 GFP 的荧光量子产率； ηA 和 ηD 通道2和通道1中对受体和供体荧光的检测效率。
    注意：α 因子可通过表达已知绝对量 GFP 和 Cherry 的两个样品来确定。然而，细胞中表达的 GFP 和 Cherry 的确切数量无法获知。因此，我们采用表达 GFP-Cherry 融合蛋白的细胞来计算该因子。在此情况下，尽管供体和受体分子的绝对量仍未知，但其分子数之比确定为 1。
  9. 测量表达GFP-Cherry融合蛋白的细胞在通道1、2、3中的平均荧光强度，并将测量值填入AE、AF、AG列。背景荧光强度已在AH、AI、AJ列中扣除。
  10. 根据GFP-Cherry融合蛋白在通道1、2和3中的荧光强度，按如下方法计算α因子（AJ列）：
    包含吸收校正因子的静态平衡方程在光度分析中至关重要。
  11. 通道1中测得的背景校正后强度（I1 - B1), 2 (I2 - B2）和 3（I3 - B3），分别使用GFP-Cherry嵌合体进行测量。光谱串扰因子 S1 使用仅表达GFP的细胞进行测定（见4.7节）。 εD 和 εA 分别是GFP（供体）和Cherry（受体）在488 nm处的消光系数，可从文献中查得（εGFP = 53,000 M-1cm-1)18 和Cherry的吸收曲线（ε樱桃 ≈ 5560 M-1cm1）。比例  摩尔消光系数比；公式，吸收分析，光谱数据比较 已在 Excel 电子表格的 G2 单元格中输入。将 α 因子的平均值输入到 J2 单元格中。
  12. 使用确定的 α 因子计算 FRET 效率， E，如下所示（AK列）：
    能量效率与强度及背景相关的方程，光学分析公式。
  13. 或者，测定FRET效率， E对于阴性对照，即GFP与Cherry共表达以及单独表达GFP的情况，将Excel表格中GFP-Cherry融合蛋白测量部分的第1、2、3通道的测量值分别加至AD、AE和AF列。以相同方法计算目标蛋白标记为GFP与Cherry之间的FRET效率。
  14. 测定未淬灭的供体荧光强度， ID 作为（I1 - B1)/(1 - E，以及受体强度作为 IA = I3 - B3；这些数值与带标签蛋白的表达水平成正比。
  15. 确定校正后的受体与供体荧光强度比值（QGFP-Cherry 融合蛋白的（AL列）：
    荧光定量方程；量子产率 Q 的计算公式
  16. 对于其他共转染的细胞，计算受体与供体分子的比例 NA/无内容/D 如下所示：
    光谱数据分析与解释中的静态平衡方程公式示意图
    注意：确定该参数的理由 NA/D 比率并绘制平均细胞FRET效率 E 与 NA/无内容/D，其原因是单个供体分子可将能量转移给多个受体，而一个受体分子在任意给定时间内只能从一个供体接收能量。即使由于相互作用的化学计量关系仅允许一个受体与供体结合，根据质量作用定律，增加受体浓度仍会提高与受体形成复合物的供体所占比例。因此，在供体表达量固定（或处于较窄范围）的情况下，FRET 效率应随受体浓度增加而升高 NA/无内容/D绘制FRET效率时 E 与 NA/无内容/D 用于GFP和Cherry的共表达，即阴性探针，然而，观察到增加 NA/无内容可翻译/D 不应导致FRET效率的增加（至少在受体浓度足够低、受体染料与供体染料因邻近而产生随机FRET的情况不存在时）。

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结果

图1 显示了在供体通道（通道1，488 nm激发，505-530 nm发射）、能量转移通道（通道2，488 nm激发，>585 nm发射）和受体通道（通道3，561 nm激发，>585 nm发射）中获得的图像。代表性图像包括仅表达GFP、仅表达Cherry、共表达GFP和Cherry，以及表达GFP-Cherry融合蛋白的细胞。在表达GFP-Cherry融合蛋白的NRK细胞（阳性对照，图2A）和共表达GFP与Cherry的细胞（阴性对照，图2B）中计算得到的平均细胞FRET效率，分别相对于每个细胞中的受体与供体强度比（Q）或分子比 NA/ND 进行作图。图2C 展示了一个如何勾画感兴趣区域并避开具有高自发荧光的核周囊泡的示例。

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讨论

本方案详细介绍了利用基因偶联的一对一荧光蛋白校准探针，通过共聚焦显微镜检测受体的敏化发射及供体分子的淬灭，从而定量FRET的方法。该方法可用于在活细胞的不同亚细胞区域的生理环境中评估蛋白质相互作用。通过应用本文提供的算法，计算图像中每个像素的FRET效率（逐像素FRET），可进一步提高空间分辨率。基于荧光强度的绝对FRET效率测定需要确定串扰（本文中以S因子量化）以及显微镜系统对供体和受体分子的检测效率（以α因子量化）。本文提供了一种可同时量化串扰和检测效率的实验方案。荧光蛋白基因的直接偶联可确保在活细胞中等摩尔表达，从而使得α因子的测定成为可能；而α因子的准确获取又是活细胞中FRET效率定量的前提条件。本方案中的关键步骤包括：正确克隆直接偶联的荧光蛋白嵌合体、转染后留出足够时间以确保荧光蛋白充分成熟、使用处于相似细胞微环境中的荧光蛋白（例如位于细胞质内或质膜胞质侧的荧光蛋白），以及保持显微镜系统的稳定性。

本文所述的实验设置和算法专为GFP-Cherry FRET配对设计。我们在补充文件1中提供了适用于多种青色（ECFP、CyP...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢斯坦福大学医学院神经科学影像服务中心为本项目提供的设备和空间支持。本研究得到了斯坦福癌症研究所和斯坦福妇科肿瘤科的内部资助，以及匈牙利国家研究、开发与创新办公室提供的GINOP-2.3.2-15-2016-00026、GINOP-2.3.3-15-2016-00030、NN129371和ANN135107项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
不含酚红的0.5%胰蛋白酶-EDTA（10倍浓缩液）Thermo Fisher Scientific15400054
Clontech mCherry N1 载体Addgene3553
不含酚红的DMEM培养基Thermo Fisher Scientific11054020
Fugene 6 转染试剂PromegaE2691
HEPES 缓冲液Thermo Fisher Scientific15630080
LabTek 8孔腔室载玻片 #1.0Thermo Fisher Scientific12565470
L-谷氨酰胺（200 mM）Thermo Fisher Scientific25030081

参考文献

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重印与许可

勘误


Formal Correction: Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission
Posted by JoVE Editors on 3/14/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission. The Authors section was updated from:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

to:

György Vámosi1
Sarah Miller2
Molika Sinha2
Maria Kristha Fernandez2
Gabor Mocsár1
Malte Renz2
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

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FRET
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