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方法文章

通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

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DOI：

10.3791/62249

⸱

2021年2月4日

 ,  ,  , 
1Department of Breast Medical Oncology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Morgan Welch Inflammatory Breast Cancer Clinic and Research Program, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Radiation Oncology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。

摘要

脑转移是多种癌症常见且具有毁灭性的表现形式。仅在美国，每年就有约20万名患者被诊断为脑转移。尽管在改善原发性乳腺癌和全身恶性肿瘤患者的生存预后方面已取得显著进展，但临床脑转移患者的预后依然极差，这凸显了迫切需要开发针对这一致命疾病的新治疗药物和策略。缺乏合适的实验模型一直是阻碍脑转移生物学研究及治疗进展的主要障碍之一。本文中，我们描述了一种通过尾静脉注射建立的脑转移异种移植小鼠模型，所用细胞系来源于炎性乳腺癌（IBC）——一种罕见且侵袭性强的乳腺癌类型，该细胞系内源性存在HER2基因扩增。通过萤光素酶和绿色荧光蛋白标记细胞，以监测脑转移情况，并利用生物发光成像、荧光体视显微镜和组织学评估对转移负荷进行定量分析。小鼠能够稳定且一致地形成脑转移灶，从而可用于研究转移过程中的关键调控因子，并为新治疗策略的临床前测试提供平台。

引言

脑转移是全身恶性肿瘤常见且致命的并发症。大多数脑转移瘤来源于肺、乳腺或皮肤的原发性肿瘤，这三类肿瘤合计占所有病例的67%至80%1,2。脑转移发病率的估计值在每年10万至24万例之间，但由于转移性癌症患者很少进行尸检，这些数字可能被低估3。与无脑转移的患者相比，发生脑转移的患者预后更差，总体生存率更低4。目前对脑转移的治疗手段主要是姑息性治疗，且未能显著改善大多数患者的生存结局5。因此，脑转移仍是临床重大挑战，迫切需要更深入地理解脑转移进展的机制，以开发更有效的治疗方法。

实验模型的使用为深入理解乳腺癌脑转移进展的具体机制提供了重要见解，并使得多种治疗策略的有效性得以评估6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16。然而，能够准确且完整地模拟脑转移发展复杂过程的模型极为有限。目前已通过不同给药途径将癌细胞接种至小鼠体内，建立了多种体内实验模型，包括原位接种、尾静脉注射、心内注射、颈动脉注射以及颅内注射。每种技术均有其优缺点，已有文献对此进行了综述3。然而，这些小鼠模型均无法完全复制脑转移的临床进展过程。

炎性乳腺癌（IBC）是原发性乳腺癌中一种罕见但侵袭性强的亚型，此类患者发生脑转移尤为常见。IBC约占乳腺癌病例的1%至4%，但在美国，其导致的乳腺癌相关死亡占此类死亡总数的10%，比例显著偏高17,18。IBC以快速转移著称；事实上，约三分之一的IBC患者在确诊时已出现远处转移19,20。就脑转移而言，IBC患者的脑转移发生率高于非IBC患者21。近期，我们证明了MDA-IBC3细胞系——该细胞系来源于一名ER-/PR-/HER2+ IBC患者的恶性胸腔积液，在小鼠异种移植模型中可重现IBC特征——在经尾静脉注射后，相较于肺转移，更倾向于在小鼠体内形成脑转移，因此该细胞系是研究脑转移发生机制的良好模型16。

本文描述了通过尾静脉注射MDA-IBC3细胞建立脑转移模型的操作步骤，并介绍了利用立体荧光显微镜和荧光素酶成像评估转移负荷的方法。该方法已被用于发现乳腺癌脑转移的关键介导因子，并用于评估治疗干预措施的有效性16,22,23。该技术的不足之处在于其无法完全模拟脑转移过程中的所有步骤。然而，其主要优势包括实验结果稳定且可重复，能够涵盖与转移相关的生物学过程，如肿瘤细胞入血、经肺循环以及向脑组织外渗，且操作技术相对简便。

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方案

本方法已获得MD安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。包含所有步骤的示意图流程见图1。

1. 细胞准备

注意：MDA-IBC3（ER-/PR-/HER2+）细胞系由Woodward博士实验室建立24，并使用荧光素酶-绿色荧光蛋白（Luc-GFP）质粒进行了稳定转导。

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1 µg/mL氢化可的松、5 µg/mL胰岛素和1%抗生素-抗有丝分裂剂的Ham's F-12培养基中培养转导细胞。
  2. 将MDA-IBC3-Luc-GFP细胞接种于T-75培养瓶中，在37 °C、5% CO2条件下培养至细胞融合。在细胞达到足够融合度进行传代前，每3天更换一次培养基。
  3. 通过移除培养基，用10 mL 1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，即无钙、无镁）洗涤每个培养瓶，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）来收获细胞。在37 °C孵育3–5分钟，直至细胞脱落。
  4. 向培养瓶中加入5 mL完全培养基以收集细胞，并将全部内容物转移至15 mL离心管中（根据所需细胞总数可优化为50 mL离心管）。在290 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞。
    注：完全培养基指添加了10%胎牛血清（FBS）、1 µg/mL氢化可的松、5 µg/mL胰岛素和1%抗生素-抗有丝分裂剂的Ham's F-12培养基。
  5. 弃去上清液。然后用10 mL 1× DPBS洗涤细胞，在290 × g条件下离心5分钟以沉淀细胞，并小心弃去上清液。用1 mL新鲜1× DPBS重悬细胞，并通过反复吹打充分混匀。
  6. 为制备单细胞悬液，使用40 µm无菌细胞筛过滤细胞。
  7. 使用自动细胞计数仪计算细胞密度。
    注：为减少计数误差，可制备不同稀释度的细胞样本，分别计数后取平均值，以确定细胞浓度（细胞数/mL）。
    1. 取2 µL细胞悬液 + 8 µL 1× DPBS，配制1:5稀释样本。
    2. 取1 µL细胞悬液 + 9 µL 1× DPBS，配制1:10稀释样本。
    3. 加入10 µL 0.4%台盼蓝染液。通过反复吹打数次，充分混匀样本。
    4. 轻轻将10 µL样本加入计数板载片的半月形加样区。确保无气泡产生；等待30秒，使细胞沉降稳定后再进行计数。
  8. 用 1× DPBS将细胞稀释至每100 µL含5 × 105或1 × 106个细胞的密度。将细胞悬液转移至1.7 mL微量离心管中，用于尾静脉注射。将细胞置于冰上直至注射，以维持细胞活性。

2. 尾静脉注射

  1. 使用 4 至 6 周龄的雌性裸鼠 SCID/Beige 小鼠。
  2. 准备一支 30 G 注射器，吸取 100 µL 细胞悬液。彻底排除所有气泡。
  3. 将小鼠放入直径约 1 英寸的啮齿类动物固定器中，以方便尾静脉注射，并防止注射过程中因活动造成损伤。
  4. 使用酒精棉片（含 70% 乙醇）轻轻擦拭小鼠尾巴 3 至 4 次，并保持 5 至 10 秒，使尾静脉更清晰可见。
  5. 以 15 至 30° 角度将注射器插入小鼠尾部，缓慢将细胞悬液注入尾静脉。
  6. 轻柔拔出注射器，并用棉片按压尾部数秒，以帮助止血。
  7. 将小鼠放回笼中，并在注射后 2 至 4 小时检查，确保未出现不良反应。

3. 脑转移负荷的评估

  1. 制备稀释的D-荧光素溶液。
    ​注意：储备液浓度为47.6 mM（15.15 mg/mL），使用浓度为1.515 mg/mL。
    1. 向D-荧光素瓶中加入5 mL的1×DPBS。
    2. 将2.5 mL溶液分别加入两个50 mL锥形管中。
    3. 再次向D-荧光素瓶中加入5 mL的1×DPBS进行冲洗，并将2.5 mL冲洗液分别加入每个50 mL锥形管中。
    4. 再次向瓶中加入5 mL的1×DPBS并重复冲洗过程，共冲洗两次。
    5. 向每个50 mL锥形管中加入1×DPBS，使总体积达到66 mL（每管约33 mL）。每管中应含有约33 mL溶液。
    6. 充分混匀各管溶液，然后将两管溶液合并至无菌过滤装置（150 mL PES滤膜，孔径0.45 µm）中。
    7. 过滤溶液后，将滤液分装至无菌棕色1.7 mL微量离心管中。
  2. 通过荧光素酶成像检测脑转移灶。
    1. 将D-荧光素置于冰上解冻，注射前涡旋混匀。
    2. 用酒精棉片清洁注射部位，使用0.5 mL胰岛素注射器每只小鼠腹腔注射100 µL D-荧光素，每笼小鼠使用一支新注射器。
    3. 注射10分钟后，使用连接小动物诱导舱的兽用麻醉机，以2% O2-2.5%异氟烷麻醉小鼠5分钟。
    4. 启动活体成像系统。当第一笼小鼠处于麻醉状态时，对下一笼小鼠进行D-荧光素注射。
    5. 将小鼠放入活体成像系统中，采集腹侧和背侧图像。选择曝光时间为2分钟，视野选择E选项（全身模式），点击Acquire。随后保存图像（图2）。
      ​注意：若图像显示发光信号饱和，请减少曝光时间。
  3. 通过GFP成像检测脑转移灶。
    1. 脑组织制备。
      1. 细胞注射后约8–10周，或当小鼠因脑转移负荷而濒临死亡时，根据IACUC批准的方案，通过吸入过量异氟烷后行颈椎脱位法处死小鼠。
      2. 异氟烷麻醉后行颈椎脱位处死小鼠，用70%乙醇溶液喷洒小鼠体表，用剪刀去除头部及耳部毛发。随后在颈部颈区做切口（注意避免完全切断头部）。切开颅骨并取出脑组织，小心分离脑组织。
      3. 将收集的脑组织放入组织包埋盒中。
      4. 将包埋盒转移至盛有冷1×DPBS的容器中。
        ​注意：脑组织样本在1×DPBS中存放时间不应超过1小时。若需同时收集多个脑样本，应分批处死小鼠（每轮不超过10只）。
    2. 体视显微镜成像。
      1. 将完整脑组织置于100 cm培养皿盖上。
      2. 开启体视显微镜和紫外光源，将光源调至位置3，物镜设为0.5×，以便观察整个脑组织，如图3A（红框）所示。
      3. 点击Live view（图3A，绿框）。
      4. 在脑组织腹侧朝上时调整焦距。
      5. 在软件中选择GFP（若细胞标记为GFP）或TXRED（若细胞标记为RFP）（图3A，黄框），在显微镜上选择相应滤光片，拍摄图像。
        ​注意：SOLA光源强度应保持在约30%；若GFP信号过强，应降低强度直至获得合适信号。
      6. 保持样本位置不变，开启明场光源，选择BF模式（图3A，黄框），拍摄图像。
      7. 将脑组织翻转至背侧朝上，重复上述步骤。
        ​注意：根据病灶大小，同一GFP阳性脑转移灶可能在腹侧和背侧均可见。在此情况下，应避免对同一病灶重复定量。图像以TIFF格式保存（可保留图像文件中的全部信息）。
      8. 以TIFF格式保存图像（可保留图像文件中的全部信息）。
      9. 对所有样本重复上述步骤。
      10. 将TIFF图像转换为JPEG格式，以便在未安装专用软件的计算机上打开（文件 | 导入/导出 | 转换文件）。
      11. 为合并荧光图像与明场图像，同时打开两幅图像，进入文件 | 合并通道，选择对应通道（GFP为绿色，明场为BF），点击确定，保存合并后的图像。
      12. 为定量脑肿瘤面积，使用荧光图像。选择测量 | 手动测量 | 面积，启用自动选择功能（图3B，绿框），将箭头移至GFP阳性区域并点击，系统将自动生成选区；再次点击确认选区，所有测量数据将显示（图3B，红框）。若存在多个GFP阳性区域，重复该操作。
    3. 获取脑组织图像后，按照常规组织固定流程使用10%中性缓冲福尔马林进行固定。
      1. 脑组织固定后，进行标准组织学切片，随后行苏木精-伊红染色以确认脑转移灶的存在，并进行免疫组织化学染色以检测特定标志物。
        注意：免疫细胞化学染色在UT MD Anderson癌症中心病理核心实验室完成，该实验室具备针对已知标志物的标准化免疫组织化学染色流程。

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结果

基于标记细胞有助于在临床前小鼠模型中监测和可视化脑转移的原理，我们用Luc和GFP标记MDA-IBC3细胞，以便通过生物发光成像和荧光体视显微镜监测脑转移并量化转移负荷。将标记后的MDA-IBC3细胞注射至免疫缺陷的SCID/Beige小鼠尾静脉后，出现脑转移的小鼠比例较高（即66.7%至100%）16,23,25注射后最早可在8周时通过荧光素酶成像检测到脑转移病灶 (图2) 或立体荧光显微镜（图4）。GFP成像使我们能够检测、计数并计算每个转移病灶的面积。成像后，将部分脑转移组织用甲醛固定，并进行苏木精和伊红染色，以验证脑转移病灶的存在（图 5A）以及用于免疫组织化学染色以检测特定蛋白质标志物（图5...

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讨论

该实验方案包含多个关键步骤。细胞置于冰上保存的时间不应超过1小时，以维持其活性。注射前应使用酒精棉片擦拭小鼠尾部，注意避免用力过猛或擦拭次数过多，以防损伤尾部皮肤。确保细胞悬液中无气泡，以防止小鼠因血管栓塞而死亡。注射时针头角度应保持在45°或更低，以避免刺穿尾部血管，并确保至少将针头的1/3插入尾静脉，以保证所有细胞成功注入。注射体积可根据小鼠体重进行调整，但注射的细胞总数应尽可能保持一致。在本方案中，所使用的SCID/Beige小鼠均为4至6周龄，体重介于15至20 g之间。对于体重低于15 g的小鼠，注射体积可调整为少于100 µL；否则，注射体积为100 µL。脑组织从颅骨取出后，必须在1×DPBS中保存不超过1小时，随后立即进行体视显微镜成像，以防止信号减弱和组织退化。进行免疫荧光成像时，脑组织不应置于福尔马林中固定，因为福尔马林会产生内源性自发荧光，干扰高质量图像的获取。我们注意到，荧光素酶成像并不总能检测到脑转移灶，尤其是非常微小的病灶；然而，通过体视显微镜进行GFP成像则可显示所有病灶。此外，GFP成像能够显示多个病灶，而荧光素酶成像则无法做到。

根据用户偏好，可对...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢MD Anderson放射肿瘤学系的Christine F. Wogan（理学硕士，ELS）对本文稿进行的科学编辑，感谢MD Anderson外科组织学核心实验室的Carol M. Johnston在苏木精-伊红染色方面的协助。我们感谢MD Anderson兽医医学与外科核心实验室对动物实验提供的支持。本研究由以下基金资助：Susan G. Komen职业催化剂研究基金（CCR16377813，授予BGD）、美国癌症协会研究学者基金（RSG-19–126–01，授予BGD）以及德克萨斯州罕见与侵袭性乳腺癌研究计划。部分资助来自美国国立卫生研究院国家癌症研究所的癌症中心支持（核心）基金P30 CA016672，授予德克萨斯大学MD Anderson癌症中心。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>细胞培养
1000 µL型移液器吸头，经滤膜过滤Genesee Scientific23430
10 mL 血清移液管Genesee Scientific12-112
抗生素-抗真菌剂 赛默飞世尔科技152400621%
15 mL 离心管（批量）Genesee Scientific28103 
康宁  500 mL Hams F-12 培养基 [+] L-谷氨酰胺GIBICO Inc. USAMT10080CV
Countess II 自动细胞计数仪（Invitrogen）赛默飞世尔科技AMQAX1000
1× DPBS赛默飞世尔科技21-031-CV
Eppendorf Centrifuge 5810REppendorf 
胎牛血清（FBS）GIBICO Inc. USA1600004410%
Fisherbrand  无菌细胞筛（40 μm)赛默飞世尔科技22-363-547
氢化可的松Sigma-AldrichH08881 µg/mL
胰岛素 赛默飞世尔科技125850145 µg/mL
Invitrogen Countess 细胞计数板载玻片赛默飞世尔科技C10228 
MDA-IBC3 细胞系MD 安德森癌症中心由Woodward博士的实验室制备24
荧光素酶–绿色荧光蛋白（Luc–GFP质粒System BiosciencesBLIV713PA-1
1.7 mL 透明无菌离心管Genesee Scientific24282S
Olympus 10 µ低吸附屏障吸头，L型，盒装，无菌Genesee Scientific23-401C 
经TC处理的培养瓶（T75），250 mL，带透气盖Genesee Scientific25-209
0.4% 台盼蓝染色液，用于 Countess 自动细胞计数仪赛默飞世尔科技T10282
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红赛默飞世尔科技25200114
<强>尾静脉注射
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/BeigeEnvigoSCID/beige 小鼠
BD 胰岛素注射器，配 BD Ultra-Fine 针头，0.5 mL，30G×1/2" (12.7毫米)BD328466
Plas Labs  布鲁姆式啮齿类动物固定器Plas Labs 551BSRR01-288-32A订购自 Thermo Fisher Scientific
Volu 溶剂供应商多样性合作伙伴 乙醇 95% SDA（190 Proof）赛默飞世尔科技5042087270% 已使用
<强>成像
BD 低剂量  U-100 胰岛素注射器BD329461
一次性 PES 滤器，0.45 μm µmFisherbrandFB12566501过滤系统以灭菌D-荧光素
D-荧光素BiosynthL8220-1g储备浓度 = 47.6 mM (15.15 mg/mL)；使用浓度 = 1.515 mg/mL
1.7 mL 微量离心管 棕色Genesee Scientific24-282AM
异氟烷Patterson VeterinaryNDC-14043-704-06用于麻醉蒸发器的液态麻醉剂
IVIS 200 PerkinElmer用于荧光素酶成像的设备，可同时对最多5只小鼠进行成像，并配备麻醉机
带盖塑料容器 Fisherbrand02-544-127
组织包埋盒赛默飞世尔科技1000957
Webcol 酒精消毒液 Covidien6818
<强>体视显微镜成像
体视显微镜 AZ100 尼康模型 AZ-STGE软件 NIS-ELEMENT
10% 甲醛Fisher ChemicalSF100-4
TC处理培养皿 100x20 mmGenesee Scientific25202

参考文献

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