通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

摘要

我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。

摘要

脑转移是多种癌症常见且具有毁灭性的表现形式。仅在美国，每年就有约20万名患者被诊断为脑转移。尽管在改善原发性乳腺癌和全身恶性肿瘤患者的生存预后方面已取得显著进展，但临床脑转移患者的预后依然极差，这凸显了迫切需要开发针对这一致命疾病的新治疗药物和策略。缺乏合适的实验模型一直是阻碍脑转移生物学研究及治疗进展的主要障碍之一。本文中，我们描述了一种通过尾静脉注射建立的脑转移异种移植小鼠模型，所用细胞系来源于炎性乳腺癌（IBC）——一种罕见且侵袭性强的乳腺癌类型，该细胞系内源性存在HER2基因扩增。通过萤光素酶和绿色荧光蛋白标记细胞，以监测脑转移情况，并利用生物发光成像、荧光体视显微镜和组织学评估对转移负荷进行定量分析。小鼠能够稳定且一致地形成脑转移灶，从而可用于研究转移过程中的关键调控因子，并为新治疗策略的临床前测试提供平台。

引言

脑转移是全身恶性肿瘤常见且致命的并发症。大多数脑转移瘤来源于肺、乳腺或皮肤的原发性肿瘤，这三类肿瘤合计占所有病例的67%至80%^1,2。脑转移发病率的估计值在每年10万至24万例之间，但由于转移性癌症患者很少进行尸检，这些数字可能被低估³。与无脑转移的患者相比，发生脑转移的患者预后更差，总体生存率更低⁴。目前对脑转移的治疗手段主要是姑息性治疗，且未能显著改善大多数患者的生存结局⁵。因此，脑转移仍是临床重大挑战，迫切需要更深入地理解脑转移进展的机制，以开发更有效的治疗方法。

实验模型的使用为深入理解乳腺癌脑转移进展的具体机制提供了重要见解，并使得多种治疗策略的有效性得以评估^{6,7,8,9,10,11,}

方案

本方法已获得MD安德森癌症中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》。包含所有步骤的示意图流程见图1。

1. 细胞准备

注意：MDA-IBC3（ER^-/PR^-/HER2⁺）细胞系由Woodward博士实验室建立²⁴，并使用荧光素酶-绿色荧光蛋白（Luc-GFP）质粒进行了稳定转导。

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1 µg/mL氢化可的松、5 µg/mL胰岛素和1%抗生素-抗有丝分裂剂的Ham's F-12培养基中培养转导细胞。
2. 将MDA-IBC3-Luc-GFP细胞接种于T-75培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下培养至细胞融合。在细胞达到足够融合度进行传代前，每3天更换一次培养基。
3. 通过移除培养基，用10 mL 1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS，即无钙、无镁）洗涤每个培养瓶，并加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）来收获细胞。在37 °C孵育3–5分钟，直至细胞脱落。
4. 向培养瓶中加入5 mL完全培养基以收集细胞，并将全部内容物转移至15 mL离心管中（根据所需....

结果

基于标记细胞有助于在临床前小鼠模型中监测和可视化脑转移的原理，我们用Luc和GFP标记MDA-IBC3细胞，以便通过生物发光成像和荧光体视显微镜监测脑转移并量化转移负荷。将标记后的MDA-IBC3细胞注射至免疫缺陷的SCID/Beige小鼠尾静脉后，出现脑转移的小鼠比例较高（即66.7%至100%）^16,23,25注射后最早可在8周时通过荧光素酶成像检测到脑转移病灶 (图2) 或立体荧光显微镜（图4）。GFP成像使我们能够检测、计数并计算每个转移病灶的面积。成像后，将部分脑转移组织用甲醛固定，并进行苏木精和伊红染色，以验证脑转移病灶的存在（图 5A）以及用于免疫组织化学染色以检测特定蛋白质标志物（图5.......

讨论

该实验方案包含多个关键步骤。细胞置于冰上保存的时间不应超过1小时，以维持其活性。注射前应使用酒精棉片擦拭小鼠尾部，注意避免用力过猛或擦拭次数过多，以防损伤尾部皮肤。确保细胞悬液中无气泡，以防止小鼠因血管栓塞而死亡。注射时针头角度应保持在45°或更低，以避免刺穿尾部血管，并确保至少将针头的1/3插入尾静脉，以保证所有细胞成功注入。注射体积可根据小鼠体重进行调整，但注射的细胞总数应尽可能保持一致。在本方案中，所使用的SCID/Beige小鼠均为4至6周龄，体重介于15至20 g之间。对于体重低于15 g的小鼠，注射体积可调整为少于100 µL；否则，注射体积为100 µL。脑组织从颅骨取出后，必须在1×DPBS中保存不超过1小时，随后立即进行体视显微镜成像，以防止信号减弱和组织退化。进行免疫荧光成像时，脑组织不应置于福尔马林中固定，因为福尔马林会产生内源性自发荧光，干扰高质量图像的获取。我们注意到，荧光素酶成像并不总能检测到脑转移灶，尤其是非常微小的病灶；然而，通过体视显微镜进行GFP成像则可显示所有病灶。此外，GFP成像能够显示多个病灶，而荧光素酶成像则无法做到。

根据用户偏好，可对.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>细胞培养
1000 µL型移液器吸头，经滤膜过滤	Genesee Scientific	23430
10 mL 血清移液管	Genesee Scientific	12-112
抗生素-抗真菌剂	赛默飞世尔科技	15240062	1%
15 mL 离心管（批量）	Genesee Scientific	28103
康宁  500 mL Hams F-12 培养基 [+] L-谷氨酰胺	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II 自动细胞计数仪（Invitrogen）	赛默飞世尔科技	AMQAX1000
1× DPBS	赛默飞世尔科技	21-031-CV
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf
胎牛血清（FBS）	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  无菌细胞筛（40 μm)	赛默飞世尔科技	22-363-547
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
胰岛素	赛默飞世尔科技	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess 细胞计数板载玻片	赛默飞世尔科技	C10228
MDA-IBC3 细胞系	MD 安德森癌症中心		由Woodward博士的实验室制备24
荧光素酶–绿色荧光蛋白（Luc–GFP质粒	System Biosciences	BLIV713PA-1
1.7 mL 透明无菌离心管	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µ低吸附屏障吸头，L型，盒装，无菌	Genesee Scientific	23-401C
经TC处理的培养瓶（T75），250 mL，带透气盖	Genesee Scientific	25-209
0.4% 台盼蓝染色液，用于 Countess 自动细胞计数仪	赛默飞世尔科技	T10282
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	赛默飞世尔科技	25200114
<强>尾静脉注射
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige 小鼠
BD 胰岛素注射器，配 BD Ultra-Fine 针头，0.5 mL，30G×1/2" (12.7毫米)	BD	328466
Plas Labs  布鲁姆式啮齿类动物固定器	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	订购自 Thermo Fisher Scientific
Volu 溶剂供应商多样性合作伙伴 乙醇 95% SDA（190 Proof）	赛默飞世尔科技	50420872	70% 已使用
<强>成像
BD 低剂量  U-100 胰岛素注射器	BD	329461
一次性 PES 滤器，0.45 μm µm	Fisherbrand	FB12566501	过滤系统以灭菌D-荧光素
D-荧光素	Biosynth	L8220-1g	储备浓度 = 47.6 mM (15.15 mg/mL)；使用浓度 = 1.515 mg/mL
1.7 mL 微量离心管 棕色	Genesee Scientific	24-282AM
异氟烷	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	用于麻醉蒸发器的液态麻醉剂
IVIS 200	PerkinElmer		用于荧光素酶成像的设备，可同时对最多5只小鼠进行成像，并配备麻醉机
带盖塑料容器	Fisherbrand	02-544-127
组织包埋盒	赛默飞世尔科技	1000957
Webcol 酒精消毒液	Covidien	6818
<强>体视显微镜成像
体视显微镜 AZ100	尼康	模型 AZ-STGE	软件 NIS-ELEMENT
10% 甲醛	Fisher Chemical	SF100-4
TC处理培养皿 100x20 mm	Genesee Scientific	25202