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用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

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DOI：

10.3791/62251

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2021年6月12日

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1Physics of Fluids group, Department of Science and Technology, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 2BIOS Lab-on-a-Chip group, Max Planck Center Twente for Complex Fluid Dynamics, MESA+ Institute for Nanotechnology and Technical Medical (TechMed) Center, University of Twente, 3Department of Biotechnology and Nanomedicine, SINTEF Industry, 4Department of Circulation and Medical Imaging, Norwegian University of Science and Technology, 5Department of Health Research, SINTEF Digital, 6Cancer Clinic, St. Olav’s Hospital, 7Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内 用于捕捉相关空间和时间尺度的显微技术。

摘要

微泡造影剂在超声介导的药物递送应用中具有广阔前景。将药物包载于纳米颗粒中可降低其全身毒性并延长药物在体内的循环时间。在一种新型的微泡辅助药物递送策略中，纳米颗粒被整合至微泡壳层内部或表面，从而实现通过超声触发并局部释放纳米颗粒所携带的药物。为了实现高效且可控的释放，必须深入理解在广泛超声参数空间内的释放机制。本系列实验方案适用于壳层含有荧光标记的微泡。本文重点介绍负载聚(2-乙基丁基氰基丙烯酸酯)聚合物纳米颗粒并掺杂改性尼罗红染料的微泡，这些纳米颗粒被固定于变性的酪蛋白壳层中。微泡通过剧烈搅拌制备，使全氟丙烷气体在含有酪蛋白和纳米颗粒的液相中形成分散体系，随后微泡壳层自发组装而成。为在纳米颗粒释放过程的所有相关时间尺度上对纳米颗粒稳定的微泡进行表征，需要采用多种显微镜技术。纳米颗粒的荧光特性使得能够利用共聚焦显微成像单个微泡，从而揭示纳米颗粒在壳层内的分布情况。 体外 以每秒1000万帧的超高速明场显微成像可揭示气泡在超声辐照下的动力学行为。最后，通过每秒50万帧的荧光显微镜成像可最佳地观察气泡壳中纳米颗粒的释放。为表征药物递送 体内，通过在背侧皮肤折叠窗室中植入的肿瘤模型，利用活体显微镜研究纳米颗粒在血管内的触发释放及其跨过内皮层的外渗过程，观察时间尺度为数分钟。这些互补表征技术的结合，可在多个时间和空间尺度上深入揭示微泡及其携带载荷释放行为的独特信息， 体外 和 体内.

引言

超声是应用最广泛的医学成像技术。它具有无创、快速、安全、成本效益高和便携等优点1,2,3。然而，血液对超声的散射能力较弱，可通过静脉注射超声造影剂来增强血池的对比度3。这种增强的血池对比度可用于定量评估器官灌注，以辅助诊断，例如，用于冠状动脉疾病4和转移性肝病5的检测。事实上，肿瘤血管系统已被证实是一个重要的预后因素6。目前，大量研究致力于微泡介导的靶向分子成像，并致力于设计可用于治疗目的的造影剂。

市售超声造影剂通常由包膜微泡悬浮液组成7,8，其直径范围为 1 µm 至 10 µm9。由于超声造影剂微泡略小于红细胞7，因此可安全到达最小的毛细血管，而不会引起阻塞3。与组织相比，微泡的超声背向散射系数显著增加10，这归因于其可压缩的气体核心11。此外，微泡的回波具有高度非线性，即其频谱包含驱动频率的谐波和次谐波。同时，回波强度强烈依赖于微泡的共振响应12。由于组织仅产生线性散射，因此在谐波成像中，少量微泡即可实现高检测灵敏度13,14。这种非线性对比信号甚至足够强，可用于在体内追踪单个微泡15。

超声造影剂的外壳可防止气泡溶解和融合，从而延长其在血池中的循环时间16外壳可由脂质、聚合物或变性蛋白质组成3,8它可降低界面张力，从而限制拉普拉斯压力驱动的溶解作用17 并形成对气体扩散的阻抗屏障18为了进一步提高稳定性，造影微泡通常充入在血液中溶解度低的高分子量气体。11微泡外壳显著改变了微泡对超声辐照的响应11未包被 气泡具有特征性的共振频率，该频率与其尺寸成反比。由于脂质包膜具有固有的刚性，包裹脂质层的气泡相较于无包膜气泡，其共振频率更高。3此外，外壳通过膨胀粘度耗散能量，这是包膜气泡阻尼的主要来源。3稳定外壳的另一个优势在于其可进行功能化修饰， 例如， 通过将靶向配体结合到微泡表面实现靶向。这种靶向性使这些微泡具有多种应用，尤其适用于超声分子成像14,19.

微泡造影剂在超声介导的药物递送应用中具有广阔前景。微泡在血管受限空间内振荡时，可在毛细血管壁上引起微流以及局部的法向应力和剪切应力3。在高声压条件下，大幅振荡可能导致微泡发生剧烈的惯性空化而崩塌，进而引起血管破裂或内陷20。这些剧烈现象可诱导产生诸如声致通透性等生物效应21，促进治疗药物通过内皮壁的细胞间隙或跨细胞途径进入间质组织。此外，该过程还可能增强治疗药物穿过富含基质的肿瘤细胞外基质21,22以及生物膜23,24的能力，尽管这一机制目前尚不明确26。

超声介导的药物递送在临床前研究27,28和临床试验中均显示出良好的应用前景22。此外，在使用相对低频超声（约1 MHz）时，已有报道表明微泡可在局部且短暂地增加血脑屏障通透性，从而促进药物进入脑实质，这一现象在临床前和临床研究中均有证实29,30,31,32,33,34。

超声介导的药物递送通常有两种方法：治疗物质可与微泡共同给予，或附着在微泡壳上，或被装载于微泡壳内28,35,36第二种方法在药物递送效率方面已被证明更为高效37微泡可通过其外壳附着或直接将载有药物或遗传物质的纳米颗粒（如脂质体或聚合物纳米结构）掺入外壳内进行装载。35,36负载纳米颗粒的微泡可通过（聚焦）超声激活，实现纳米颗粒的局部释放28,33,38,39,40若此类微泡与细胞直接接触，已有研究表明 体外 有效载荷甚至可以通过一种称为声学打印（sonoprinting）的过程沉积到细胞质膜上34,35.

微泡超声辐照的超声参数空间十分广泛，且 体内 生物条件进一步增加了复杂性。因此，聚焦超声与载有纳米颗粒的微泡相结合，为靶向治疗领域带来了挑战。

本研究的目的是提供一系列可用于详细成像微泡响应的实验方案，以超声参数为变量，研究导致微泡外壳破裂及随后释放荧光标记外壳材料的机制。该套方案适用于外壳含有荧光染料的微泡。 图1 展示了由挪威特隆赫姆 SINTEF 开发的聚合物-纳米颗粒-蛋白质稳定的微泡的示意图。这些微泡内充满全氟丙烷气体（C3F8）且稳定外壳的纳米颗粒含有NR668，这是一种尼罗红荧光染料的亲脂性衍生物38,43纳米颗粒由聚(2-乙基丁基氰基丙烯酸酯)（PEBCA）构成，并经过聚乙二醇（PEG）修饰。PEG功能化可减少单核吞噬细胞系统对纳米颗粒的调理作用和吞噬作用，从而延长其在体内的循环时间14,44因此，聚乙二醇化可增加到达靶部位的纳米颗粒数量，从而提高治疗效果16. 图2 展示了四种显微镜方法的使用如何使研究人员能够覆盖所有相关的时间和长度尺度。需要注意的是，光学显微镜可达到的空间分辨率受衍射极限的限制，该极限取决于光的波长以及物镜和样品照明光源的数值孔径（NA）。45对于当前系统，光学分辨率极限通常为200 nm。此外，活体显微镜可用于亚细胞水平的成像。46本研究中所用的纳米颗粒与蛋白稳定的微泡，其适用于活体显微成像的最小尺度为小毛细血管的尺寸（≥10 µm）。 体外 高速光学成像（每秒1000万帧）和高速荧光成像（每秒50万帧）实验用于单个微泡的研究。纳秒时间尺度下的高速明场成像适用于研究振动微泡的时间分辨径向动力学。相比之下，高速荧光显微镜可直接可视化荧光标记纳米颗粒的释放过程。此外，可利用Z轴扫描三维（3D）共聚焦显微镜和扫描电子显微镜研究微泡壳层结构（后者实验方案未包含在本研究中）。活体显微成像采用多光子显微镜对背侧窗室中生长的肿瘤进行成像，以实时获取局部血流信息及荧光标记纳米颗粒的命运动态。 体内47这些显微技术的结合最终提供了对治疗性微泡制剂在超声作用下行为的详细洞察 体外 和 体内.

方案

注意：所有实验程序均经挪威动物研究管理机构批准。本方案中所用材料的详细信息可参见 材料表.

1. 微泡的制备

注意：本研究中关注的微泡为蛋白质和纳米颗粒稳定的微泡，其制备方法此前已有描述28,33,48。因此，本文仅对该制备方案进行简要概述。 

  1. 首先，使用移液器将超纯水与含0.5 wt% 酪蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）以及含0.21 wt% 荧光染料NR668（改良型尼罗红）标记的1 wt% 纳米颗粒在无菌玻璃压盖小瓶（10 mL，直径2 cm）中混合。聚合物纳米颗粒采用微乳液聚合法制备，方法如Mørch et al.38所述。
    注意： 此处染料作为模型药物，用于可视化纳米颗粒的释放过程。操作纳米颗粒溶液时，应穿戴实验服、护目镜和手套。若发生溶液洒漏，应立即用100%丙酮擦拭清除。
  2. 用橡胶塞密封小瓶，轻微混匀后，将小瓶置于室温超声水浴中处理10分钟，以消除可能存在的团聚物。将分散装置的搅拌头置于距玻璃小瓶底部约0.5 cm处。使用连接至气体容器的玻璃移液器，向含有溶液的小瓶顶空部分通入全氟丙烷气体，直至溶液开始轻微冒泡。
    注意：在分散装置底部缠绕自封膜，以防止搅拌过程中玻璃小瓶滑动。
  3. 使用分散装置在1935 × g（转速24,000 rpm，旋转半径3 mm）条件下剧烈搅拌4分钟。随后用橡胶塞封闭小瓶，并密封保存以备后续使用。
    注意：搅拌过程使气体被包裹于液体中，微泡壳层随后自发组装，无需额外活化步骤。
  4. 将多余的酪蛋白和纳米颗粒溶液储存于4 °C，并用100%丙酮清洗分散装置。

2. 单个气泡成像

  1. 共聚焦显微镜
    1. 样品制备
      1. 将气泡溶液稀释以实现单个微泡成像，步骤如下：取一支玻璃压盖小瓶，其中装有按照第1节所述方法制备的微泡，将排气针头（19 G–21 G）插入瓶中。将小瓶倒置，使大气泡远离瓶口密封处。
      2. 将另一支小（约1 mL）注射器的针头（19 G）插入倒置的小瓶中，从小瓶中吸取少量气泡悬液，并将注射器中的内容物转移至小管中，以便下一步更易于移液。
        注意：所提取悬浮液的体积直接取决于气泡悬浮液的类型和浓度。本实验中提取了0.2 mL。
      3. 使用移液器将微泡悬液（来自第1部分）用过滤后的PBS稀释，使其浓度约为2 × 105 至 6 × 105 微米级气泡/毫升，以实现单个气泡成像。
        ​注意：根据气泡类型的不同，建议洗涤气泡悬液以去除游离的荧光染料。对于将荧光染料注入壳层的气泡，此步骤尤为重要。洗涤气泡时，需将气泡悬液稀释（例如， 通过取100 µL气泡溶液加入10 mL PBS中，混匀后离心（通常离心速度约为100 × g最后，用移液器吸除含有微泡的上清液，用于后续分析。剩余溶液含有游离的荧光颗粒，可弃去。根据需要重复洗涤步骤。
      4. 向混合物中加入甘油以增加介质的黏度，消除由布朗运动引起的移动，否则这种移动会干扰相对较慢的共聚焦Z轴层扫成像。
        ​注意：甘油的用量取决于所成像气泡的类型（此处约为50%）。对于某些类型的气泡，甘油可能会对稳定性产生不利影响49然而，在共聚焦成像下约30分钟内，气泡未表现出明显变化。此外，甘油可能改变微泡的声学响应特性，因此只能用于不对接微泡进行超声辐照的成像方法。
      5. 将微泡悬液置于具有薄壁的腔室中，以实现最佳成像，例如通道载玻片。
    2. 成像方案
      1. 打开共聚焦显微镜，选择合适的物镜以及共聚焦显微镜成像过程中所需的激光器和扫描仪。
        注意：此处使用60倍水浸物镜，分辨率为0.08 µm/像素，根据气泡大小选择成像区域为256 × 256像素或128 × 128像素。在这些特定实验中，使用488 nm激光器和振镜扫描器。发射波长取决于所用荧光染料，通常为宽带。
      2. 在明场下找到微泡，然后切换至共聚焦显微镜。设定共聚焦显微镜扫描所需的顶部和底部平面。采集Z轴堆栈图像以观察三维结构，Z方向步长设为100 nm。
  2. 明场显微镜技术
    1. 光学系统的组装
      注意：明场显微镜装置的示意图如图所示 图3A为确保超声波无干扰传播，水浴设有两个开口：一个用于光源，另一个用于超声换能器。光学系统由一台（模块化）显微镜、一台高速相机及匹配的光学元件组成。由于微泡振荡的周期通常在1 µs量级（使用1 MHz超声波），相机的帧率应设置为至少每秒500万帧。此处，相机设置为每秒1000万帧（256 × 400像素）进行拍摄，共采集256帧（25.6 µs），以完整捕捉气泡动力学的全部细节，包括高次谐波。
      1. 将具有合适放大倍数、工作距离和数值孔径（NA）的水浸物镜安装到显微镜上。
        ​注意：尽管水分会逐渐蒸发，仍选用水浸物镜以保持稳定的工作距离。此处选用的水浸物镜放大倍数为60倍，工作距离为2 mm，数值孔径（NA）为1。
      2. 使用峰值功率输出至少为1 kW的频闪灯进行照明，并在显微镜与相机之间放置管镜，以确保尽可能少的环境光到达高速相机的传感器。
      3. 使用可调光卤素光源对单个微泡进行聚焦，并对光学和声学系统进行准直，以实现实时成像。
    2. 声学系统的组装
      1. 使用可编程任意波形发生器和功率放大器（56 dB增益）驱动换能器，以产生平滑的包络和波形。将示波器连接至任意波形发生器以监测信号。将个人计算机连接至任意波形发生器，通过自行编写的脚本程序设定入射声压波形。
      2. 使用脉冲/延迟发生器作为主触发器，以同步光学和声学系统。设置脉冲/延迟发生器和相机软件的触发延迟，使记录在超声发射后16 µs开始，以确保超声波能够到达微泡。在记录开始前1.5 µs触发光源，以保证微泡振荡期间的充分照明（参见 图3B （用于时序图）。
      3. 选择一个具有合适中心频率的换能器。将其放置于水浴的开口中，使其相对于光轴呈一定角度，以尽量减少样品池膜产生的反射，并降低驻波的形成。 
        注意：此处使用中心频率为2.25 MHz、焦距为1的单元素聚焦浸入式换能器" 和0.75的元素直径" 以35°角相对于光轴放置。传递函数的校准需使用与声学系统中相同的放大器进行。使用光纤水听器，根据超声发射频率，校准换能器从电压幅度到压力幅度的传递函数。
    3. 选择样品支架
      1. 使用具有光学和声学透明膜且体积足够大的样品 holder，以便在同一样品中对多个单个微泡进行成像。
        注意：此处使用体积为10 mL、膜面积为25 cm²的细胞培养盒，其顶部和底部均配有可打开的盖子，以方便细胞接种和后续分析。2，使用膜厚为175 µm的膜。由于下层膜的声学反射，以及显微镜物镜和上层膜反射波的干扰， 原位 声压可能与任意波形发生器上设定的数值不同。将换能器相对于样品架膜呈一定角度放置可减少驻波的形成，但可能会增加膜表面的反射。
      2. 确保样品可完全浸没，并位于换能器和显微镜物镜的焦距范围内。使用连接至三维微调定位平台的铝制支架，以独立移动样品 holder。
    4. 光学与声学系统的对准
      1. 为实现三维平移以对准装置，将水浴槽连接至XY平移台，并将平移台固定于光学平台，以确保实验过程中装置不发生移动。随后，向水浴槽中注水，并开启可调光卤素光源。在对准过程中，将显微镜物镜移至一侧，以避免超声波反射。
      2. 将一个针式水听器（0.2 mm）连接至样品支架臂上，并将其置于水浴中，使水听器尖端位于物镜视野范围内。打开放大器和任意波形发生器，使用5到10个超声波周期的单脉冲，脉冲重复频率设为15 Hz。确保水听器尖端在显微镜图像中居中且聚焦清晰。调节水槽在XY方向的位置以及针式水听器在Z方向的位置，直至获得最大声压幅值。
      3. 调节显微镜焦距，重新对准水听器的尖端。
        注意：本方案可确保显微镜焦点与换能器焦点之间的对准。对准后请勿更改显微镜和换能器的位置。
    5. 样品制备
      1. 重复步骤 2.1.1.1 至 2.1.1.3 以制备样品溶液。稀释气泡溶液以实现单个气泡成像，并排除相邻气泡之间的声学相互作用。
      2. 打开样品 holder 的出口。使用注射器将样品溶液注入样品 holder 的另一开口，直至完全充满。确保样品 holder 内无气泡，以避免与超声场发生不必要的相互作用。
      3. 关闭样品 holder 的两个阀门，并将样品 holder 垂直于光轴放置。
        注意：移动过程中需保持装有样品的样品台水平，以防止气泡向样品台一侧偏移。
    6. 成像方案
      1. 通过上述内部编写的脚本，在任意波形发生器中设置所需的超声驱动频率和声压。
        注意：此处的声压波为单次爆发，共40个周期，采用8个周期的高斯渐变脉冲。实验中使用的超声频率为1 MHz、2 MHz或3 MHz，声压幅值范围为81 kPa至1200 kPa。
      2. 使用XYZ载物台移动装有样品溶液的样品 holder，定位显微镜焦点处的单个微泡。从样品 holder 的一个角落开始观察视野，并确保微泡边缘清晰可见且处于焦点位置（参见 图3C 以获得理想的摄像视角）。
      3. 将先前连接至卤素灯的光纤一端改接到闪光灯上，确保另一端仍与水浴装置相连。启动记录。
      4. 根据所需的超声设置（频率和声压），重复步骤 2.2.6.2 至 2.2.6.3，每次将含有微泡的细胞培养盒在焦平面内移动至少 2 mm，以确保视野中的微泡未在先前的实验中受到超声辐照。
        注意：此处每个实验重复约 20 次。当整个样品 holder 被超声辐照后，需将样品 holder 中的溶液排空，并用新鲜的样品溶液重新填充，以进行后续实验。
    7. 数据分析
      1. 采用编程环境，根据研究问题进行数据分析，并在图像处理后执行边缘检测。利用测量图像区域特性的函数，确定气泡的质心以及每个气泡周围强度分布的导数，以检测气泡的轮廓（从而获得气泡半径） R）。从单个微泡随时间变化的半径中提取相关参数。
        注意：在本研究中，使用编程环境对单个微泡的录制图像进行二值化和滤波处理。通过自行编写的脚本计算每个微泡周围强度轮廓的导数。
  3. 荧光显微镜技术
    1. 光学系统的组装
      1. 构建荧光显微镜实验装置（图 4A），所用的相同载玻片用于第2.2节所述的明场显微镜观察。
        注意：2.3 节中所述装置可与 2.2 节所述明场显微镜装置联用。联用荧光显微镜与明场显微镜可在成像纳米颗粒释放过程的同时，实现对微泡气体核心的可视化观察。
      2. 将高速相机设置为以每秒500,000帧（400 × 250像素）的速度记录128帧（256 µs）。
        ​注意：由于荧光成像的光强有限，且颗粒递送过程的时间尺度长于气泡动力学过程，因此成像时间较明场实验更长。
      3. 选择功率足够高、能提供充足光照且具有合适激发波长的激光器，并确保其与声光调制器耦合，以避免样品发生漂白。
        ​注意：本研究中采用5 W连续波激光器，激发波长为532 nm，用于激发纳米颗粒的荧光。
      4. 放置一个分束器、二向色镜和陷波滤光片 在激光器与显微镜物镜之间安装滤光片，以将激发光引导至样品，同时允许荧光发射光到达相机。
    2. 声学系统的组装
      1. 使用与2.2.2节相同的声学装置对微泡进行超声辐照。在这些特定实验中，将换能器更换为单元素聚焦浸入式换能器，其中心频率为2.25 MHz，焦距为1.88"，以及1的元素直径"将其相对于光轴倾斜35°放置，以最小化样品 holder 膜的反射并减少驻波的形成。
    3. 光学与声学系统的对准
      1. 重复第2.2.4节中描述的步骤。
    4. 样品制备
      1. 按照第2.2.5节所述制备样品溶液。
    5. 成像方案
      1. 通过上述内部编写的脚本，在任意波形发生器上设置所需的超声驱动频率和声压幅值。
        注意：此处声压波设定为单次超声脉冲，共140个周期，采用10个周期的高斯 taper 脉冲。与研究气泡动力学所需的脉冲相比，诱导生物效应通常需要更长的脉冲持续时间。实验中使用的超声频率为1 MHz、2 MHz或3 MHz，声压幅值范围为81 kPa至1200 kPa。
      2. 在脉冲/延迟发生器上，设置激光触发延迟，以便在记录期间对微泡释放的纳米颗粒进行荧光激发。
        注意：在这些特定实验中，触发延迟时间为 20 µs 之间 和170 µs 总持续时间 150 µs。时序图如图所示。 图4B.
      3. 使用XYZ载物台移动装有样品溶液的样品 holder，定位显微镜焦点处的单个微泡。首先选择样品 holder 的一个角落作为视野起点；参见 图 4C 以获得微泡界面清晰可见且聚焦的理想摄像视野。启动录像。
      4. 根据所需的超声设置（频率和声压），重复步骤 2.3.5.3，每次将含有微泡的细胞培养盒在光学平面内至少移动 2 mm，以确保视野中的微泡未在先前的实验中受到超声照射。
        ​注意：本研究中，每个实验重复约10–20次。当整个样品池被超声辐照后，需将样品池清空，并重新注入新鲜样品溶液以进行后续实验。实验间移动样品池的距离取决于声束尺寸。
    6. 数据分析
      1. 根据研究问题分析荧光显微镜记录。针对每个微泡，通过目视判断在荧光显微镜实验中是否发生了纳米颗粒的递送。若观察到单个微泡的气体核心处有纳米颗粒脱离并沉积至样品支架膜上，则手动记录该情况 分娩发生 在编程环境中。

3. 活体显微成像

  1. 背侧皮肤褶窗室手术（先前已有描述26,47,50）
    1. 在植入窗室前，将动物适应环境一周。雌性和雄性小鼠均可使用，年龄无特殊要求，但需确保小鼠体重至少为22–24 g，以保证皮肤具有足够的延展性。
    2. 在全身麻醉下进行手术，并在术中和术后给予镇痛治疗。通过皮下注射给予芬太尼（0.05 mg/kg）、美托咪啶（0.5 mg/kg）、咪达唑仑（5 mg/kg）和水（比例为2:1:2:5），剂量为每10 g体重0.1 mL。使用加热垫或加热灯维持动物体温。
    3. 轻柔牵拉动物背部的双层皮肤，使其夹在窗室的两个对称聚甲醛框架之间。通过将两枚螺钉穿过双层皮肤并沿窗室上缘缝合，固定窗室。
    4. 移除皮肤褶一侧窗室圆形框架内的皮肤组织。在去除皮肤的位置放置直径为11.8 mm的盖玻片，形成观察组织的窗口。
    5. 使用皮下注射阿替美唑（2.5 mg/kg）、氟马西尼（0.5 mg/kg）和水（比例为1:1:8），剂量为每10 g体重0.1 mL，作为拮抗剂终止麻醉。将动物置于加热恢复架中过夜。在动物饮水中添加25 mg/mL的恩诺沙星，以预防手术部位感染。
  2. 肿瘤模型构建
    1. 将癌细胞在37 °C、5% CO2条件下，于含10%胎牛血清以及100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的适当培养基中培养。
      NOTE: 本方案中使用了人骨肉瘤（OHS）细胞系，但也可使用其他细胞系。
    2. 在步骤3.1.5的次日，使用异氟烷（诱导时5%，维持时1–2%）对动物进行数分钟麻醉。取下盖玻片，加入30 µL含5 × 106个癌细胞的培养基，然后重新放回盖玻片。
    3. 成像前让肿瘤生长2周，在此期间每周至少监测动物体重和健康状况3次。
  3. 光学系统组装
    1. 根据具体研究问题，使用合适的显微镜和物镜，在超声处理过程中进行活体成像（如先前研究26所述）。实验装置的示意图见图5A。
      ​NOTE: 本特定实验使用了一台多光子显微镜，配备20倍水浸物镜（数值孔径NA为1.0，工作距离2 mm）和脉冲激光器。图像以共振扫描模式采集，速度为每秒31帧（512 × 512像素），视场为400 × 400 µm2，激发波长为790 nm。两个磷化镓铟砷探测器前的滤光片分别为长通590 nm和带通525/50 nm，用于荧光信号检测。
  4. 声学系统组装
    1. 将合适的超声换能器安装于定制的波导中，波导位于物镜下方，与光轴成45°角，以最小化背侧皮肤褶窗室盖玻片的反射并减少驻波形成。用蒸馏并脱气的水填充波导，并在波导顶部涂抹超声耦合凝胶。
  5. 光学与声学系统的对准
    1. 将光轴与超声焦点对齐。将光纤水听器置于物镜焦点处。然后开启放大器和任意波形发生器，以短脉冲（5–10个周期）、脉冲重复频率100 Hz激励换能器，并移动超声换能器，使水听器在示波器上检测到的信号压力达到最高。
      ​NOTE: 对准后切勿改变换能器位置。
  6. 成像方案
    1. 将连接至XY位移平台的加热动物固定装置（定制设计）置于波导与物镜之间，并补充更多耦合凝胶。对动物实施麻醉，并建立尾静脉导管。将小鼠放入加热固定装置中，固定窗室。在窗室盖玻片顶部滴加一滴水，移动物镜到位，开始对肿瘤组织成像。
    2. 图5B展示了实验的时间序列图，显示了事件顺序。静脉注射荧光标记的2 MDa葡聚糖（30 µL，4 mg/mL，生理盐水稀释），以显示血管结构，并通过XY平移平台移动小鼠，找到具有合适血管的视野。在超声处理前记录基线图像。根据研究问题以及显微镜和染料的具体情况，调整帧率、视场和记录时长。
      ​NOTE: 本实验中以每秒31帧、视场400 × 400 µm2进行连续成像，持续5分钟。
    3. 在任意波形发生器上设定所需的超声驱动频率、脉冲长度和声压幅值。
      NOTE: 本实验使用1 MHz频率，脉冲长度10 ms，负峰值压力幅值介于0.2 MPa至0.8 MPa之间。采用0.5 Hz或0.1 Hz的脉冲重复频率，以便在超声脉冲间隔期间有新的微泡重新灌注至处理区域。
    4. 静脉注射50 µL微泡（2 × 108 至 5 × 108 个微泡/mL），并在成像的同时施加超声，具体操作如文献26所述。
  7. 数据分析
    1. 根据研究问题，使用（开源）图像处理软件和编程环境（如文献26所述）分析图像，以确定血管参数（直径、分支、血流速度和方向）、纳米颗粒在血管中的聚集情况，以及葡聚糖和纳米颗粒在肿瘤组织中外渗的动力学过程和渗透深度。

结果

按照本实验方案所述方法制备的微泡，采用多种显微镜技术在不同时间尺度下进行了分析。

共聚焦显微镜下纳米颗粒的荧光（图6A）表明，外壳的颗粒分布不均匀。其他显微技术也可用于气泡表征。例如，图6B展示了采用扫描电子显微镜观察微气泡的整体结构，如先前研究34中所示。

径向动力学和现象学气泡行为可通过所述方法进行研究 体外 一种明场显微成像方法，其中以每秒一千万帧的速度对微泡进行成像。通过自行编写的脚本提取单个微泡随时间变化的半径。此类径向响应的示例如下所示 图7.

如 2.3.6 节所述，典型的成功纳米颗粒递送过程的图像序列如图 8A所示。当激光照射到微泡时，由于荧光效应，可见嵌入微泡壳中的纳米颗粒发光。在超声辐照驱动下，荧光纳米颗粒从微泡的气体核心脱离，并沉积在样品 holder 的膜上。最后，激光关闭，荧光纳米颗粒不再被激发。荧光标记载荷递送失败的情况通常如图 8B所示的图像序列，其中荧光纳米颗粒在超声暴露期间仍停留在完整微泡的壳上并发光。

在超声过程中利用实时活体多光子显微镜，研究了超声联合微泡对血液中纳米颗粒行为的影响、肿瘤血管通透性的增强以及纳米颗粒递送效率的提升。可根据声学压力、频率和脉冲持续时间，表征纳米颗粒向细胞外基质渗透的程度和动力学特征。超声处理的效果可能因血管的大小和形态以及微泡所受空间限制的不同而有所差异。还可确定超声处理对血流状态和方向的影响。图 9 展示了一个随时间推移纳米颗粒外渗的实验示例，该实验在机械指数（MI）为 0.8 的条件下进行26。活体多光子显微镜的结果揭示了超声辐照期间纳米颗粒外渗的空间和时间分布特征，这对于全面理解超声介导纳米颗粒递送的机制以及优化相关技术具有重要意义26。

荧光纳米颗粒示意图，聚合物层，变性蛋白质；尺寸约1-10 μm。
图1：包裹荧光标记的聚合物纳米颗粒的微泡示意图，纳米颗粒位于变性酪蛋白壳层中。 微泡的直径通常介于1 µm至10 µm之间。纳米颗粒的直径主要分布在100 nm至200 nm范围内38。缩写：C3F8 = 八氟丙烷气体。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示显微镜方法的长度与时间尺度图：明场、荧光、共聚焦和活体显微。
图 2：明场、荧光、共聚焦和活体显微镜相关时间与长度尺度的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

超声显微镜装置配备高速相机；含微泡的细胞培养；结果分析。
图3：明场显微镜实验的示意图。（A）实验装置，（B）时序图，以及（C）典型的记录帧。图（C）中的比例尺 = 10 µm。缩写：fps = 帧/秒。请点击此处查看该图的放大版本。

超声气泡动力学实验装置；激光、显微镜、相机；时序图；气泡成像结果。
图 4：荧光显微镜实验的示意图。（A）实验装置，（B）时序图，以及（C）一个典型的记录帧。图（C）中的比例尺 = 10 µm。缩写：fps = 帧每秒。请点击此处查看该图的放大版本。

微泡注射的超声光学装置，含数据时间线和荧光结果。
图 5：活体显微镜实验的示意图。 （A）实验装置，（B）时序图，以及（C）典型的记录图像。 （C）中的比例尺 = 50 µm。绿色代表葡聚糖-FITC，红色代表纳米颗粒。缩写：GaAsP = 磷化砷化镓。 请点击此处查看该图的放大版本。

用于形貌与结构分析的纳米颗粒荧光及扫描电镜图像。
图6：单个纳米颗粒-蛋白稳定化微泡的三维结构。 （A）采用共聚焦显微镜显示纳米颗粒，（B）采用扫描电子显微镜显示三维结构。（B）经34许可复制。图（A）比例尺 = 5 µm；图（B）比例尺 = 2 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

超声中的气泡动力学；显示振荡的时间与半径关系图的实验装置。
图7：在1 MHz超声频率和142 kPa声压振幅作用下，一个半径为2.89 µm的纳米颗粒-蛋白稳定微泡的典型球形振荡。 （A-D）来自高速记录的图像及其对应的气泡半径随时间变化曲线（底部）。比例尺 = 5 µm，红线表示初始半径。照明轮廓（任意单位）以黄色表示。放大倍数为120倍。 请点击此处查看该图的放大版本。

细胞融合过程；时间延时显微镜，A-B 比较；荧光发射；0-180 µs 时间间隔。
图8：高速荧光显微镜拍摄的图像序列。（A）在2 MHz超声频率和600 kPa声压振幅下，对由纳米颗粒和蛋白稳定的微泡进行超声辐照，成功递送荧光标记的纳米颗粒。（B）在2 MHz超声频率和210 kPa声压振幅下，对由纳米颗粒和蛋白稳定的微泡进行超声辐照，纳米颗粒递送失败。比例尺 = 10 µm。放大倍数为120倍。请点击此处查看此图的放大版本。

神经元活动的荧光显微镜延时成像，示意图显示60秒内的动态成像。
图9在1 MHz超声频率和800 kPa声压振幅条件下，对纳米颗粒-蛋白稳定的微泡进行超声辐照后的活体显微成像。 (A) 血管内的纳米颗粒，以及 (B) 白色虚线框所示区域的图像序列A）显示葡聚糖（绿色）和纳米颗粒（红色）的外渗。比例尺 = 50 µm放大倍数为20倍。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

结合了不同的光学显微技术，以获取纳米颗粒从微泡表面传递到周围介质各个步骤的信息。体内成像用于观察微泡的振荡、纳米颗粒从微泡壳的释放、血管外渗以及穿透肿瘤细胞外基质的过程。体外成像相比更复杂的体内实验体系，可实现对多种超声参数的快速筛选。结合多种成像模式的优势在于能够在不同时间尺度上获得互补的信息，这一特性对于表征和优化微泡以实现有效递送并获得治疗效果至关重要。该方法适用于研究所有类型微泡的递送机制，包括携带荧光标记纳米颗粒和药物的微泡体系。

用于研究单个微泡的显微镜方法中最关键的步骤如下。对于荧光显微镜，应将纳米颗粒进行荧光标记，以便可视化颗粒的释放过程。此外，样品溶液应充分稀释，以在共聚焦、明场和荧光显微镜方法中分离出单个微泡进行分析。另外，选择合适的超声驱动频率和声压以最有效地激发微泡（即在其共振状态）非常重要。如果研究问题涉及纳米颗粒载荷的递送，则适当的超声参数应纳入研究范围。除了共振条件外，这些微泡还应在或超过其纳米颗粒释放阈值的条件下驱动，通常需要相对较高的声压幅度（MI > 0.3）51。对于明场显微成像，关键是要选择具有足够高帧率的高速相机，以最小化运动模糊并避免混叠效应。

明场显微镜主要受限于成像帧率和可用光源的强度；更高的帧率可提供更详细的时间分辨信息以观察气泡动力学过程，但由于曝光时间更短，需要更强的照明。原则上，可通过增加激光光源的强度来提高荧光成像的帧率，从而更细致地研究颗粒释放过程。然而，即使使用高量子产率的荧光染料，高强度激光也会被荧光标记的微泡吸收并产生热量。这种热量可能干扰相关实验，在极端情况下甚至引发光热空化现象。52因此，在实际操作中，所施加的激光能量密度存在上限。然而，高强度的激光照射也可被有意用于诱导脂质体释放颗粒53温度影响气泡动力学及超声响应，具体取决于气泡类型54因此，如果 体外 并且要客观比较活体内外方法， 体外 本方案中讨论的方法应在 37 °C 下进行。另一个局限性是 体外 本文讨论的方法存在一个局限性，即气泡并非处于自由场环境中，因为微气泡会漂浮在样品支架膜下方。此外，在对单个微气泡成像时存在选择偏倚。然而，通过对单个气泡进行重复实验，可以研究气泡尺寸的影响，并消除混杂因素——尺寸分布的干扰。若能在气泡浓度不至于引起气泡间相互作用的前提下，理解气泡响应随尺寸变化的规律，则可据此计算任意气泡群体的响应。 最后，明场和荧光显微镜方法均可提供包含微泡的二维（2D）图像信息。若研究问题需要超越二维成像的分析，可通过将本方案中描述的装置与侧向成像装置结合，实现多平面成像，从而解析气泡的三维（3D）行为。55.

研究微泡的另一种方法是声学表征56然而，测量单个微泡的回波需要在超声束内定位并分离出单个微泡56，这通常通过使用细管或光镊或声镊技术来解决57,58为了通过声学方法测量气泡尺寸，可在远高于微泡共振频率的条件下，于几何散射 regime 对微泡进行超声辐照，该条件不会引发微泡的体积振荡。59. 一种的使用 "声学相机" 是一种用于成像单个微泡在超声作用下径向动力学的方法，其中使用高频超声探头来测定微泡对低频驱动波的径向响应60该方法的缺点是仅能用于确定微泡半径的相对变化；因此，还需另一种方法来确定气泡的绝对半径。 例如，通过光学成像61,62当微泡暴露于高于其共振频率的超声波时，此类方法的缺点是在如此高的频率下，穿透深度会降低59，限制了其可用性 体内 应用。其他形式的显微镜也可用于微泡研究，例如扫描电子显微镜、原子力显微镜和透射电子显微镜63然而，这些替代显微技术可达到的空间和时间分辨率通常较为有限，且存在以下缺点：成像通常通过离线分析在超声暴露之前或之后进行，且通量通常较低63另一种替代方法是使用光散射法，该方法可用于实时研究单个微泡的径向动力学，但与声学散射方法相比，其信噪比较低。64.

在超声暴露期间进行实时活体显微成像是一种强大的方法，可用于获取关于血管结构、微泡、纳米颗粒或其他分子（例如本例中的葡聚糖）在超声作用下行为的新见解。进行实时活体显微成像的一个普遍限制是仅能对组织的微小区域成像，且光在组织中的穿透深度有限。如果成像视野内的血管中微泡和/或纳米颗粒数量极少，则几乎无法获得有关纳米颗粒行为及其外渗的信息。此外，由于视野有限，光路与超声路径之间的精确对准至关重要。如果超声压力足够高以致引起微泡破裂，则还需选择合适的脉冲重复频率，以确保在两次超声脉冲之间有新的微泡重新灌注进入成像区域。此外，由于超声会在观察窗室的盖玻片和物镜表面发生反射，因此将超声换能器以一定角度放置非常重要，可减少反射，避免驻波形成，从而防止校准后的压力场发生畸变。另一个实际问题是，显微镜系统需要留出足够的空间，以便在物镜上方或下方安装超声换能器和波导。背侧观察窗室中的肿瘤因受到腔室和盖玻片的限制而厚度有限；但如有需要，也可采用其他模型，例如乳腺脂肪垫中的皮肤褶肿瘤65，或对各器官中肿瘤进行腹腔活体成像66。此类肿瘤可在相应的微环境中正位生长，因而更具临床相关性。

本研究中描述的方法阐明了荧光标记微泡在利用气泡和超声进行药物递送基础研究中的潜力。这种显微镜方法的结合为微泡对超声辐照及其相关声学参数空间的响应提供了有价值的见解，并在相关的时间和长度尺度范围内清晰地展示了微泡及其载荷的行为特征。

披露

作者声明不存在利益冲突。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 MS/s 双通道任意波形发生器型号 8026Tabor Electronics任意波形发生器（可编程）
2100 LENI放大器，用于窗式腔体装置
2 MDa 葡聚糖Sigma-Aldrich
33522 AAgilent Technologies任意波形发生器，用于窗式腔体装置
A1RNikon Instruments共聚焦显微镜
ACE ISCHOTT可调光交流卤素光源
AtipemazolOrion Pharma唤醒动物的解毒剂
BaytrilBayer恩诺沙星
BD Neoflon 24 GBecton Dickinson & Company尾静脉导管
BNC 模型 575Berkely Nucleonics Corporation脉冲/延迟发生器
Branson 2510 超声波清洗机Branson超声波清洗槽
通道载玻片Ibidi
CLINIcell 25Laboratoires Mabio International细胞培养盒（体积 10 mL，膜面积 25 cm2，膜厚 175 µm）
CohlibriLightline激光器（5 W，激发波长 532 nm）
DP03014 数字荧光示波器Tektronix示波器
芬太尼Actavis Group HF小鼠麻醉剂
胎牛血清Sigma-Aldrich细胞培养基补充剂
光纤水听器Precision Acoustics用于对准
氟马西尼Fresenius Kabi唤醒动物的解毒剂
加热动物固定装置定制设计一种钢制固定装置，其内部腔体大小适合小鼠侧卧放置，窗式腔体平放并用两侧螺丝固定。腔体下方装置上有一个孔，用于确保换能器与皮肤之间的声学接触。该装置加热至最高 37°C，温度由插入小鼠直肠的温度探头反馈控制。该装置安装在 XY 定位平台上，以便独立移动动物，从而成像窗式腔体的不同区域
Hyper Vision HPV-X2Shimadzu高速摄像机
ImageJ美国国立卫生研究院 和威斯康星大学光学与计算仪器实验室开源图像处理程序
体内 SliceScopeScientifica多光子显微镜
异氟烷Baxter
ISOTONBeckman Coulter过滤的磷酸盐缓冲盐水溶液
LUMPLFLN60XWOlympus水浸物镜（放大倍数 60x，工作距离 2 mm）
MaiTai DeepSeeSpectra-Physics脉冲激光器
MATLABMathworks编程环境
美托咪定Orion Pharma小鼠麻醉剂
咪达唑仑Accord Healthcare Limited小鼠麻醉剂
Milli-QMerck超纯水
MVS 7010 高强度氙气频闪灯PerkinElmer频闪灯
Panametrics-NDT C305Olympus单元件聚焦浸入式换能器（中心频率 2.25 MHz，焦距 1"，直径 1"）
Panametrics-NDT V304Olympus单元件聚焦浸入式换能器（中心频率 2.25 MHz，焦距 1.88"，直径 1.25"）
青霉素Sigma-Aldrich在将肿瘤植入动物前添加至细胞培养基中
全氟丙烷气体F2 Chemicals
Roswell Park Memorial Institute 1640Gibco Thermo-Fisher细胞培养基
Safe-Lock 管Eppendorf
链霉素Sigma-Aldrich在将肿瘤植入动物前添加至细胞培养基中
T 25 basic ULTRA-TURRAXIKA 实验室技术分散工具
TDS 210Tektronix示波器，用于窗式腔体装置
换能器Precision Acoustics Ltd用于窗式腔体装置
U-TLUOlympus管镜
VBA100-200Vectawave放大器
窗式腔体定制制作用于窗式腔体装置
XLUMPLFLN20 XWOlympus20x 水浸物镜
XY(Z) 平移台Thorlabs

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用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法
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