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通过免疫荧光染色检测阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样蛋白-β沉积

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DOI：

10.3791/62254

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2021年4月19日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesiology, Jiangsu Province Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology and NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Narcotic and Psychotropic Drugs, Xuzhou Medical University

通讯作者： Chao Liu <chaoliu@xzhmu.edu.cn>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在阿尔茨海默病的神经病理学中，最关键的特征之一是淀粉样蛋白-β的沉积。本方案中，我们描述了在5×FAD转基因小鼠中进行免疫荧光染色以检测斑块中淀粉样蛋白-β积聚的方法。将详细阐述灌注、冷冻切片、染色及定量分析的全过程。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，占全球痴呆病例的60-70%。AD的显著特征之一无疑是大脑中淀粉样蛋白-β（Aβ）的积聚。Aβ是由β-分泌酶和γ-分泌酶对β-淀粉样前体蛋白（APP）进行蛋白水解切割而产生的。在病理条件下，APP的β-切割增加，导致Aβ过度产生，并聚集形成Aβ斑块。由于Aβ斑块是AD病理的典型特征，检测Aβ含量在AD研究中具有重要意义。在本实验方案中，我们介绍免疫荧光染色法以可视化Aβ沉积。本实验所用的小鼠模型为5×FAD，该模型携带五种在人类家族性AD中发现的突变。5xFAD小鼠的神经病理学和行为缺陷已有充分记录，使其成为研究Aβ病理的良好动物模型。我们将介绍包括经心灌注、冷冻切片、免疫荧光染色和定量分析在内的操作流程，以检测5×FAD小鼠中的Aβ积聚。通过该方案，研究人员可在AD小鼠模型中深入探究Aβ病理变化。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，导致全球约60%-70%的痴呆病例，并消耗大量社会资源1。众所周知，β-淀粉样蛋白（Aβ）的积聚是阿尔茨海默病的病理特征之一。淀粉样前体蛋白（APP）是一种存在于多种组织中的整合膜蛋白。Aβ肽段由36-42个氨基酸组成2，由APP经β-分泌酶和γ-分泌酶连续切割产生3,4。APP的切割方式改变或APP基因发生突变可导致Aβ过量生成。Aβ分子可聚集形成寡聚体或纤维，这些聚集物被认为具有神经毒性5,6。在以往的研究中，已证实Aβ的积聚与阿尔茨海默病中的神经元死亡相关7,8,9。

5×FAD（C57BL/6J）转基因小鼠在APP基因中含有3个突变，在PSEN1基因中含有2个突变。细胞内Aβ的积聚最早在1.5月龄时即开始出现。在约2月龄时，可在皮层和海马区观察到细胞外Aβ的积聚。随着年龄增长，Aβ积聚迅速增加10。由于Aβ病理特征已有充分记录，因此该模型是本实验方案的理想动物模型。

本染色方法的目的是在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中可视化并定量脑内Aβ沉积。本文将介绍包括经心脏灌注多聚甲醛、冷冻切片、免疫荧光染色及定量分析在内的实验流程，用于检测5×FAD小鼠中Aβ的积聚情况。该方案是一种可靠且简便的方法，可用于研究AD小鼠模型中的Aβ病理变化。

方案

所有实验操作均经徐州医科大学动物实验伦理委员会批准，并遵循中国政府关于实验动物护理与使用的相关规定指南。

1. 小鼠灌注

注意：灌注步骤的更多细节可参考 William Shain 实验室提供的视频11。

  1. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）对5×FAD（C57BL/6J）转基因小鼠进行麻醉12,13。当小鼠对后肢足垫夹捏无反应时，表明已达到适当麻醉状态。在小鼠未充分麻醉前，不得开始灌注操作。
  2. 使用四枚针将小鼠四肢固定于泡沫板上，使麻醉后的小鼠腹部朝上，四肢充分伸展。用眼科剪在剑突处做一剪口，随后暴露膈肌。
  3. 用手术剪剪开膈肌，并小心沿膈肌切口向上延伸至肋笼上缘。剪断肋骨及胸肌，分离周围结缔组织以暴露心脏。
  4. 找到小鼠的右心房，使用眼科剪将其剪开。
  5. 从左心室注入20 mL 37 °C的PBS（0.01 M，pH 7.2–7.4），以冲洗血液。随后从左心室缓慢注入20 mL室温的4%多聚甲醛（PFA）进行组织固定。PBS和4% PFA的注射速率约为5 mL/min。固定过程中应在数秒内观察到固定震颤。
    注意：4% PFA可刺激眼睛和呼吸道，可能引发过敏反应。该步骤应在通风良好的环境中进行，操作者应佩戴护目镜和口罩。
  6. 使用手术剪剪下头部，用解剖镊小心去除颅骨并取出脑组织。随后将脑组织浸入盛有4 mL 4% PFA的5 mL塑料管中，于4 °C下固定12–24小时。

2. 包埋与冷冻切片

  1. 用4% PFA固定后，将脑组织转移至含有4 mL 15%蔗糖的5 mL塑料管中，4 °C孵育。12–24小时后，脑组织应沉至管底。
  2. 将脑组织转移至含有4 mL 30%蔗糖的5 mL塑料管中，4 °C孵育12–24小时。此后脑组织即可用于包埋。采用15%和30%蔗糖逐步浸泡的目的是对脑组织进行脱水，以避免包埋和冷冻切片过程中细胞内形成冰晶。脱水后的脑组织可在4 °C保存一周。
  3. 在管中保留约1 mL蔗糖溶液与脑组织共存。然后加入等体积的最优切割温度（OCT）包埋剂，并充分混匀。这有助于OCT包埋剂更充分地包裹脑组织。
  4. 在持样头表面涂布一层较厚的OCT包埋剂，并在-21 °C下冷冻，以备冷冻切片。从中间将脑组织沿矢状面切开，取其中一半用于冷冻切片机切片。
  5. OCT包埋剂凝固后，将持样头安装到样品头，并修整成平整的平台表面。将脑组织的一半放置在修整后的表面上，中间面朝下。
  6. 在脑组织周围放置一个锡箔环，以防止OCT包埋剂泄漏，然后向环内填充OCT包埋剂直至完全浸没脑组织。待OCT包埋剂完全凝固后，即可进行切片。
  7. 设定切片厚度为20 µm，腔室温度为-21 °C，样品头温度为-19 °C。从脑组织的头端向尾端进行切片。
  8. 在载玻片上滴加少量PBS。预先用多聚赖氨酸对载玻片进行包被，以防止切片脱落。将切片贴附于载玻片上。若切片发生折叠，可用软毛刷蘸取PBS轻轻展开。
  9. 切片在室温下干燥过夜，随后储存于-20 °C。切片在进行Aβ染色前可在-20 °C保存长达一个月。

3. Aβ 染色步骤

  1. 将切片在室温下复温，干燥载玻片表面，并使用疏水性笔在切片周围画圈，用于抗体孵育。
  2. 将载玻片浸入盛有 PBS 的 30 mL 塑料染色盒中，以洗去 OCT 包埋剂。使用至少 20 mL 的 PBS。
  3. 在切片上加入 100 µL 1x 冷冻切片抗原修复液，在室温下孵育 5 分钟。
  4. 用至少 20 mL 室温 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
  5. 在切片上加入稀释的一抗（6E10），于湿盒中 4 °C 孵育 16–24 小时（一抗稀释液：含 1% BSA、0.3% Triton X-100 和 0.01% 叠氮化钠的 PBS，按 1:500 稀释）。BSA 起封闭作用。
  6. 用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
    注意：步骤 3.7、3.8 和 3.9 需在避光环境中进行。
  7. 将切片置于湿盒中，加入二抗溶液（山羊抗小鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 594，用 PBS 按 1:200 稀释），室温孵育 1 小时。
  8. 用至少 20 mL PBS 洗去二抗，洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    注意：洗涤过程中切勿将 PBS 直接倾倒在切片上，以防切片脱落。保持切片湿润。
  9. 吸去切片周围的液体，每张切片上滴加一滴封片剂，加盖盖玻片并避免产生气泡。
  10. 使用荧光显微镜观察染色切片。保持成像参数一致，避免偏差。将载玻片置于 4°C 避光保存，并在一周内完成分析，因为染色信号会随时间逐渐减弱。

4. 使用 ImageJ 进行 Aβ 聚集的成像与定量分析

  1. 使用连接了数字相机和成像软件的荧光显微镜采集图像。我们采用 Image Pro Plus 软件，成像参数设置如下： Exp Pvw： 450 ms, 实验获取： 450 毫秒； Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw 分辨率： 宽度 1 × 高度 1， 采集分辨率： 宽度 1 × 高度 1 捕获深度： 8位单声道； 增益：Pvw： 13, Acq: 13, Gamma：Pvw： 1, Acq: 1, 偏移： Pvw: -700，采集：-700。
  2. 在 ImageJ Fiji 2.0.0（https://imagej.net/Fiji）中，选择 插件 | 拼接 | MosaicJ 在菜单中。然后选择 文件 | 打开图像序列 打开待拼接的图像（图1A).
  3. 所有选定的图像将显示在底部。手动拼接图像后，选择 文件 | 创建马赛克 (图1B，C，D).
  4. 选择 图像 | 调整 | 亮度/对比度…，并调整图像的亮度和对比度（图3A）。随后即可保存图像（图1E).
  5. 为了定量分析Aβ的聚集情况，通过打开图像 文件 | 打开… 在菜单中（图2A).
  6. 选择 图像 | 类型 | 8位 调整图像至8位。然后使用以下方法选择需要计数的区域 多边形 选择图2B).
  7. 选择 图像 | 调整 | 阈值 选择适当的信号阈值。可通过拖动滚动条或直接在文本框中输入数值来调整阈值（最大值：255，最小值：0）。当切片中所有Aβ信号均变为红色时，该阈值即适用于后续测量（图2C）。确保 暗背景 复选框已被选中。
  8. 选择 分析 | 设置测量… 在菜单中选择要显示的参数 在结果中。确认 积分密度 和 阈值限制 被选中。 积分密度 （总强度）是测量的目标图2D).
  9. 选择 分析 | 测量 以获得结果。结果将显示并可进行统计分析（图 2E).

结果

我们采用上述免疫荧光染色方法，研究了不同年龄的5×FAD小鼠中Aβ沉积的情况。图3展示了使用本实验方案获得的典型结果和次优结果。对5月龄和8月龄的杂合型5×FAD转基因小鼠以及4至6月龄的野生型对照小鼠的脑切片使用6E10抗体进行染色，并在荧光显微镜下观察。图3A显示了小鼠脑矢状切片中斑块形式的Aβ沉积，主要分布在皮层和海马区，其中海马下脚区域的沉积密度最高，这与先前的研究结果一致10。如图所示，6E10抗体可清晰检测到5×FAD小鼠中的Aβ沉积。8月龄5×FAD小鼠脑内Aβ沉积的总荧光密度（总荧光密度 = 面积 × 平均荧光强度；总荧光密度：该区域内荧光强度的总和；平均荧光强度：特定区域内的平均荧光强度；面积：图像中阳性荧光信号的区域）显著高于5月龄5×FAD小鼠（非配对t检验，p = 0.0071），表明Aβ的沉积随年龄增长而逐渐增加。此外，在野生型对照小鼠中未观察到Aβ信号，说明6E10抗体具有良好的特异性。部分次优结果（一只8月龄杂合型5×FAD转基因小鼠和一只8月龄野生型对照小鼠）也展示于图3C中，存在的问题包括切片断裂和边缘卷曲。后续将讨论如何避免此类情况。总体而言，使用6E10抗Aβ抗体进行免疫荧光染色是一种特异性强、可简便定量5×FAD小鼠中Aβ沉积的方法。

使用ImageJ软件将图像序列拼接成全景图的工作流程，包括亮度/对比度调整。
图1．使用ImageJ拼接脑切片图像。（A） 在ImageJ/Fiji菜单中，选择 Plugins | Stitching | MosaicJ 开始图像拼接。（B） 选择 File | Open Image Sequence，并选中需要拼接的图像。根据切片的解剖结构手动拼接图像。（C） 拼接完成后，选择 File | Create Mosaic 生成完整的切片图像。（D） 拼接图像的一个示例。（E） 选择 Image | Adjust | Brightness/Contrast… 调整整幅图像的亮度和对比度。中间面板显示调整菜单。选择 File | Save as… 将图像保存为Tiff或其他格式。请点击此处查看该图的放大版本。

ImageJ 中的图像处理流程；阈值调整与测量设置；结果分析
图2Aβ荧光定量方法。（A） 将图像类型设置为8位 图像 | 类型 | 8位 （B） 使用 多边形 在 ImageJ 菜单中进行选择，并描绘全脑轮廓。 (C) 选择 图像 | 调节 | 阈值… 以排除背景噪声。确保 暗背景 勾选该框。拖动红线或滚动条，直至 Aβ 荧光被正确高亮显示。 (D) 使用 分析 | 设置测量参数 选择将在结果表中显示的内容并设置计数方法。显示“设置测量”菜单。确认 积分密度 和 限制为阈值 被选中。 (E) 选择 分析 | 测量 以获得结果。 积分密度 （表示为IntDen）代表Aβ荧光的总强度（积分密度 = 面积 × 平均值）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

脑组织分析；5xFAD 小鼠模型；荧光显微镜；淀粉样蛋白-β斑块；数据图表
图3. 5×FAD 小鼠中 Aβ 沉积的免疫荧光染色代表性结果。（A） 使用抗Aβ抗体6E10对5月龄和8月龄5×FAD转基因小鼠以及4至6月龄野生型小鼠脑组织矢状切片中的Aβ沉积进行免疫荧光染色。图像由荧光显微镜在4倍或20倍物镜下采集。上图：低倍镜下拼接的全脑图像；下图：高倍镜下的皮层图像。如白色箭头所示，5×FAD组中可清晰观察到Aβ沉积的荧光信号，而野生型组中未观察到Aβ信号。 （B） 柱状图显示了5月龄和8月龄5×FAD转基因小鼠脑内Aβ荧光总强度（积分密度 = 面积 × 平均强度）的定量分析结果。未配对t检验 t检验：**，p < 0.01（每组 n = 3）。误差线表示标准差。 (C) 5×FAD 转基因小鼠（8月龄）与野生型对照小鼠（8月龄）在免疫荧光染色中出现切片质量欠佳的实例。左侧，切片断裂；右侧，切片边缘卷曲。比例尺， 200 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

使用6E10抗体进行免疫荧光染色可特异性检测脑内Aβ的积聚，且易于通过Image J进行定量分析。值得注意的是，该实验方案中某些关键步骤可能影响实验结果。

为防止切片脱落或出现图3C所示的破损现象，需注意以下几个关键点。由于缺氧会导致不可逆的病理生理效应，因此在切开膈肌后应迅速进行灌注，这些效应可能对实验结果产生显著影响11。在进行冷冻切片前，脑组织必须经过适当的固定和脱水处理。冷冻切片机的温度应设置恰当（舱内温度-21 °C，样品头温度-19 °C），并检查切片刀和防卷板的状态。切片刀和防卷板上不得有灰尘或霜冻，且应正确安装到位。在贴附切片前，还应将其充分展平。此外，载玻片应预先包被，以防止染色过程中切片脱落。常用的方法包括多聚赖氨酸或明胶包被。多聚赖氨酸包被的载玻片可直接从公司购买。

染色过程中的某些步骤也会影响结果。孵育前，应将抗原修复液作用于切片，以充分暴露抗原。为防止一抗在孵育过程中蒸发，切片应在湿盒中进行孵育。此外，在二抗孵育后应将切片避光保存，以避免荧光淬灭。目前已开发出多种用于检测Aβ的方法，如硫黄素S染色、刚果红染色和Gallyas银染法，但使用6E10抗体的免疫荧光染色具有独特优势。硫黄素S和刚果红可与所有含β-折叠结构的蛋白质结合，因此这些化学染料在Aβ检测中的特异性较低14,15。与化学染色相比，免疫荧光染色具有更高的特异性。根据先前的高分辨率定位研究，6E10抗Aβ单克隆抗体特异性识别Aβ的第4至第10位氨基酸残基16。以往研究还表明，使用6E10抗体进行免疫染色所检测到的斑块沉积多于Gallyas银染法和硫黄素S染色，提示基于抗体的Aβ检测可能比化学染色方法更敏感17。然而，6E10染色的关键局限性在于，该抗体仍可识别全长APP及其他含有6E10表位的切割肽段，但在5xFAD小鼠中，Aβ斑块以外区域的荧光信号非常微弱。先前研究表明，6E10抗体以构象依赖性和序列依赖性方式结合Aβ肽段16。尽管存在这些局限性，本方案仍是一种实用且特异的方法，有助于研究人员探究阿尔茨海默病（AD）中的Aβ病理变化。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金面上项目（项目编号：81974157）、江苏省教育厅江苏特聘教授项目（授予 C.L.）、江苏省创新与创业团队项目（授予 H.Z.、A. L.、W.W.、C.L. 和 Y.S.）、 徐州医科大学优秀人才启动基金（D2019025）及创新创业训练计划项目（201910313038Z ，授予 Z.S.、Y.X.、M.Z. 和 J.D.）的资助。本研究还得到了国家级基础医学实验教学示范中心（徐州医科大学）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
麻醉
注射器KLMEDICAL1 mL
戊巴比妥钠Sigma-AldrichP3761生理盐水中配制成1%用于腹腔注射
开胸术：
直头精细虹膜剪（约11.5 cm）RWDS12010-11
锐利弯头手术剪（11.5 cm）RWDS14016-11
直头解剖镊（约10.5 cm）RWDF12010-10
灌注
离心管（5 mL）Biosharp
注射器KLMEDICAL20 mL
多聚甲醛VicmedVIH100
PBS 0.01M（pH 7.2–7.4）粉末VicmedVC2001P加入去离子水配制成溶液
固定、脱水与冷冻切片
防脱载玻片CITOTEST18810576.2 mm × 25.4 mm
冷冻切片机LEICACM1950
最佳切割温度包埋剂（OCT）Sakura Finetek4583
蔗糖VETECV900116
免疫荧光染色
荧光显微镜OLYMPUSIX-81
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594Thermo Fisher ScientificA-11005200X
Image-Pro Plus 7.0CMedia Cybernetics科学作图与数据分析软件
免疫组化湿盒（黑色）Sinylab定制300 mm × 100 mm × 38 mm，槽深27 mm，可容纳10张标准载玻片
移液器Thermo Scientific
移液器吸头Well-offer
塑料染色盒Sinylab定制30 mL，可容纳5张标准载玻片
一抗稀释缓冲液本实验室配制100 mL PBS中含1% BSA（1 g）、0.3% Triton X-100（300 µL）、0.01% 叠氮化钠（10 mg）
纯化抗β-淀粉样蛋白（1-16）抗体（6E10）BiolegendSIG-39320500X
冷冻切片快速抗原修复液KeyGEN BioTECHKGIHC0055X
定量分析
Graphpad Prism 8.0.1Graphpad医学绘图软件
Image J Fiji 2.0.0National Institute of Health科学作图与数据分析软件

参考文献

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β淀粉样蛋白淀粉样斑块β淀粉样前体蛋白5xFAD小鼠经心灌注冷冻切片斑块定量

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