通过免疫荧光染色检测阿尔茨海默病小鼠模型中的淀粉样蛋白-β沉积

摘要

在阿尔茨海默病的神经病理学中，最关键的特征之一是淀粉样蛋白-β的沉积。本方案中，我们描述了在5×FAD转基因小鼠中进行免疫荧光染色以检测斑块中淀粉样蛋白-β积聚的方法。将详细阐述灌注、冷冻切片、染色及定量分析的全过程。

摘要

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，占全球痴呆病例的60-70%。AD的显著特征之一无疑是大脑中淀粉样蛋白-β（Aβ）的积聚。Aβ是由β-分泌酶和γ-分泌酶对β-淀粉样前体蛋白（APP）进行蛋白水解切割而产生的。在病理条件下，APP的β-切割增加，导致Aβ过度产生，并聚集形成Aβ斑块。由于Aβ斑块是AD病理的典型特征，检测Aβ含量在AD研究中具有重要意义。在本实验方案中，我们介绍免疫荧光染色法以可视化Aβ沉积。本实验所用的小鼠模型为5×FAD，该模型携带五种在人类家族性AD中发现的突变。5xFAD小鼠的神经病理学和行为缺陷已有充分记录，使其成为研究Aβ病理的良好动物模型。我们将介绍包括经心灌注、冷冻切片、免疫荧光染色和定量分析在内的操作流程，以检测5×FAD小鼠中的Aβ积聚。通过该方案，研究人员可在AD小鼠模型中深入探究Aβ病理变化。

引言

阿尔茨海默病（AD）是一种神经退行性疾病，导致全球约60%-70%的痴呆病例，并消耗大量社会资源¹。众所周知，β-淀粉样蛋白（Aβ）的积聚是阿尔茨海默病的病理特征之一。淀粉样前体蛋白（APP）是一种存在于多种组织中的整合膜蛋白。Aβ肽段由36-42个氨基酸组成²，由APP经β-分泌酶和γ-分泌酶连续切割产生^3,4。APP的切割方式改变或APP基因发生突变可导致Aβ过量生成。Aβ分子可聚集形成寡聚体或纤维，这些聚集物被认为具有神经毒性^5,6。在以往的研究中，已证实Aβ的积聚与阿尔茨海默病中的神经元死亡相关^7,8,9。

5×FAD（C57BL/6J）转基因小鼠在APP基因中含有3个突变，在PSEN1基因中含有2个突变。细胞内Aβ的积聚最早在1.5月龄时即开始出现。在约2月龄时，可在皮层和海马区观察到细胞外Aβ的积聚。随着年龄增长，Aβ积聚迅速增加¹⁰。由于Aβ病理特征已有充分记录，因此该模型是本实验方案的理想动物模型。

本染色方法的目的是在阿尔茨海默病（AD）小鼠模型中可视化并定量脑内Aβ沉积。本文将介绍包括经心脏灌注多聚甲醛、冷冻切片、免疫荧光染色及定量分析在内的实验流程，用于检测5×FAD小鼠中Aβ的积聚情况。该方案是一种可靠且简便的方法，可用于研究AD小鼠模型中的Aβ病理变化。

方案

所有实验操作均经徐州医科大学动物实验伦理委员会批准，并遵循中国政府关于实验动物护理与使用的相关规定指南。

1. 小鼠灌注

注意：灌注步骤的更多细节可参考 William Shain 实验室提供的视频¹¹。

1. 通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）对5×FAD（C57BL/6J）转基因小鼠进行麻醉^12,13。当小鼠对后肢足垫夹捏无反应时，表明已达到适当麻醉状态。在小鼠未充分麻醉前，不得开始灌注操作。
2. 使用四枚针将小鼠四肢固定于泡沫板上，使麻醉后的小鼠腹部朝上，四肢充分伸展。用眼科剪在剑突处做一剪口，随后暴露膈肌。
3. 用手术剪剪开膈肌，并小心沿膈肌切口向上延伸至肋笼上缘。剪断肋骨及胸肌，分离周围结缔组织以暴露心脏。
4. 找到小鼠的右心房，使用眼科剪将其剪开。
5. 从左心室注入20 mL 37 °C的PBS（0.01 M，pH 7.2–7.4），以冲洗血液。随后从左心室缓慢注入20 mL室温的4%多聚甲醛（PFA）进行组织固定。PBS和4% PFA的注射速率约为5 mL/min。固定过程中应在数秒内观察到固定震颤。
   注意：4% PFA可刺激眼睛和呼吸道，可能引发过敏反应。该步骤应在通风良好的环境中进行，操作者应佩戴护目镜和口罩。
6. 使用手术剪剪下头部，用解剖镊小心去除颅骨并取出脑组织。随后将脑组织浸入盛有4 mL 4% PFA的5 mL塑料管中，于4 °C下固定12–24小时。

2. 包埋与冷冻切片

1. 用4% PFA固定后，将脑组织转移至含有4 mL 15%蔗糖的5 mL塑料管中，4 °C孵育。12–24小时后，脑组织应沉至管底。
2. 将脑组织转移至含有4 mL 30%蔗糖的5 mL塑料管中，4 °C孵育12–24小时。此后脑组织即可用于包埋。采用15%和30%蔗糖逐步浸泡的目的是对脑组织进行脱水，以避免包埋和冷冻切片过程中细胞内形成冰晶。脱水后的脑组织可在4 °C保存一周。
3. 在管中保留约1 mL蔗糖溶液与脑组织共存。然后加入等体积的最优切割温度（OCT）包埋剂，并充分混匀。这有助于OCT包埋剂更充分地包裹脑组织。
4. 在持样头表面涂布一层较厚的OCT包埋剂，并在-21 °C下冷冻，以备冷冻切片。从中间将脑组织沿矢状面切开，取其中一半用于冷冻切片机切片。
5. OCT包埋剂凝固后，将持样头安装到样品头，并修整成平整的平台表面。将脑组织的一半放置在修整后的表面上，中间面朝下。
6. 在脑组织周围放置一个锡箔环，以防止OCT包埋剂泄漏，然后向环内填充OCT包埋剂直至完全浸没脑组织。待OCT包埋剂完全凝固后，即可进行切片。
7. 设定切片厚度为20 µm，腔室温度为-21 °C，样品头温度为-19 °C。从脑组织的头端向尾端进行切片。
8. 在载玻片上滴加少量PBS。预先用多聚赖氨酸对载玻片进行包被，以防止切片脱落。将切片贴附于载玻片上。若切片发生折叠，可用软毛刷蘸取PBS轻轻展开。
9. 切片在室温下干燥过夜，随后储存于-20 °C。切片在进行Aβ染色前可在-20 °C保存长达一个月。

3. Aβ 染色步骤

1. 将切片在室温下复温，干燥载玻片表面，并使用疏水性笔在切片周围画圈，用于抗体孵育。
2. 将载玻片浸入盛有 PBS 的 30 mL 塑料染色盒中，以洗去 OCT 包埋剂。使用至少 20 mL 的 PBS。
3. 在切片上加入 100 µL 1x 冷冻切片抗原修复液，在室温下孵育 5 分钟。
4. 用至少 20 mL 室温 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
5. 在切片上加入稀释的一抗（6E10），于湿盒中 4 °C 孵育 16–24 小时（一抗稀释液：含 1% BSA、0.3% Triton X-100 和 0.01% 叠氮化钠的 PBS，按 1:500 稀释）。BSA 起封闭作用。
6. 用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟。
   注意：步骤 3.7、3.8 和 3.9 需在避光环境中进行。
7. 将切片置于湿盒中，加入二抗溶液（山羊抗小鼠 IgG (H+L) Alexa Fluor 594，用 PBS 按 1:200 稀释），室温孵育 1 小时。
8. 用至少 20 mL PBS 洗去二抗，洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   注意：洗涤过程中切勿将 PBS 直接倾倒在切片上，以防切片脱落。保持切片湿润。
9. 吸去切片周围的液体，每张切片上滴加一滴封片剂，加盖盖玻片并避免产生气泡。
10. 使用荧光显微镜观察染色切片。保持成像参数一致，避免偏差。将载玻片置于 4°C 避光保存，并在一周内完成分析，因为染色信号会随时间逐渐减弱。

4. 使用 ImageJ 进行 Aβ 聚集的成像与定量分析

1. 使用连接了数字相机和成像软件的荧光显微镜采集图像。我们采用 Image Pro Plus 软件，成像参数设置如下： Exp Pvw： 450 ms, 实验获取： 450 毫秒； Pvw: 1 × 1, Acq: 1 × 1; Pvw 分辨率： 宽度 1 × 高度 1， 采集分辨率： 宽度 1 × 高度 1 捕获深度： 8位单声道； 增益：Pvw： 13, Acq: 13, Gamma：Pvw： 1, Acq: 1, 偏移： Pvw: -700，采集：-700。
2. 在 ImageJ Fiji 2.0.0（https://imagej.net/Fiji）中，选择 插件 | 拼接 | MosaicJ 在菜单中。然后选择 文件 | 打开图像序列 打开待拼接的图像（图1A).
3. 所有选定的图像将显示在底部。手动拼接图像后，选择 文件 | 创建马赛克 (图1B，C，D).
4. 选择 图像 | 调整 | 亮度/对比度…，并调整图像的亮度和对比度（图3A）。随后即可保存图像（图1E).
5. 为了定量分析Aβ的聚集情况，通过打开图像 文件 | 打开… 在菜单中（图2A).
6. 选择 图像 | 类型 | 8位 调整图像至8位。然后使用以下方法选择需要计数的区域 多边形 选择图2B).
7. 选择 图像 | 调整 | 阈值 选择适当的信号阈值。可通过拖动滚动条或直接在文本框中输入数值来调整阈值（最大值：255，最小值：0）。当切片中所有Aβ信号均变为红色时，该阈值即适用于后续测量（图2C）。确保 暗背景 复选框已被选中。
8. 选择 分析 | 设置测量… 在菜单中选择要显示的参数 在结果中。确认 积分密度 和 阈值限制 被选中。 积分密度 （总强度）是测量的目标图2D).
9. 选择 分析 | 测量 以获得结果。结果将显示并可进行统计分析（图 2E).

结果

我们采用上述免疫荧光染色方法，研究了不同年龄的5×FAD小鼠中Aβ沉积的积累情况。图3展示了使用本方案获得的典型结果和次优结果。对5月龄和8月龄的杂合型5×FAD转基因小鼠以及4至6月龄的野生型对照小鼠的脑切片，使用6E10抗体进行染色，并在荧光显微镜下检测。图3A显示了小鼠脑矢状切面中斑块形式的Aβ积累，主要沉积于皮层和海马区，其中海马下脚区域的密度最高，这与先前的研究结果一致¹⁰。如图所示，6E10抗体可清晰检测到5×FAD小鼠中的Aβ积累。8月龄5×FAD小鼠脑中Aβ积累的总荧光密度（总荧光密度 = 面积 × 平均荧光强度；总荧光密度：该区域内荧光强度的总和；平均荧光强度：特定区域内的平均荧光强度；面积：图像中阳性荧光信号的区域）显著高于5月龄5×FAD小鼠（非配对t检验，p = 0.0071），表明Aβ的积累随年龄增长而逐渐增加。此外，在野生型对照小鼠中未观察到Aβ信号，说明6E10抗体具有良好的特异性。一些次优结果（一只8月龄杂合型5×FAD转基因小鼠和一只8月...

讨论

使用6E10抗体进行免疫荧光染色可特异性检测脑内Aβ的积聚，且易于通过Image J进行定量分析。值得注意的是，该实验方案中某些关键步骤可能影响实验结果。

为防止切片脱落或出现图3C所示的破损现象，需注意以下几个关键点。由于缺氧会导致不可逆的病理生理效应，因此在切开膈肌后应迅速进行灌注，这些效应可能对实验结果产生显著影响¹¹。在进行冷冻切片前，脑组织必须经过适当的固定和脱水处理。冷冻切片机的温度应设置恰当（舱内温度-21 °C，样品头温度-19 °C），并检查切片刀和防卷板的状态。切片刀和防卷板上不得有灰尘或霜冻，且应正确安装到位。在贴附切片前，还应将其充分展平。此外，载玻片应预先包被，以防止染色过程中切片脱落。常用的方法包括多聚赖氨酸或明胶包被。多聚赖氨酸包被的载玻片可直接从公司购买。

染色过程中的某些步骤也会影响结果。孵育前，应将抗原修复液作用于切片，以充分暴露抗原。为防止一抗在孵育过程中蒸发，切片应在湿盒中进行孵育...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉
注射器	KLMEDICAL		1 mL
戊巴比妥钠	Sigma-Aldrich	P3761	生理盐水中配制成1%用于腹腔注射
开胸术：
直头精细虹膜剪（约11.5 cm）	RWD	S12010-11
锐利弯头手术剪（11.5 cm）	RWD	S14016-11
直头解剖镊（约10.5 cm）	RWD	F12010-10
灌注
离心管（5 mL）	Biosharp
注射器	KLMEDICAL		20 mL
多聚甲醛	Vicmed	VIH100
PBS 0.01M（pH 7.2–7.4）粉末	Vicmed	VC2001P	加入去离子水配制成溶液
固定、脱水与冷冻切片
防脱载玻片	CITOTEST	188105	76.2 mm × 25.4 mm
冷冻切片机	LEICA	CM1950
最佳切割温度包埋剂（OCT）	Sakura Finetek	4583
蔗糖	VETEC	V900116
免疫荧光染色
荧光显微镜	OLYMPUS	IX-81
山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A-11005	200X
Image-Pro Plus 7.0C	Media Cybernetics		科学作图与数据分析软件
免疫组化湿盒（黑色）	Sinylab	定制	300 mm × 100 mm × 38 mm，槽深27 mm，可容纳10张标准载玻片
移液器	Thermo Scientific
移液器吸头	Well-offer
塑料染色盒	Sinylab	定制	30 mL，可容纳5张标准载玻片
一抗稀释缓冲液	本实验室配制		100 mL PBS中含1% BSA（1 g）、0.3% Triton X-100（300 µL）、0.01% 叠氮化钠（10 mg）
纯化抗β-淀粉样蛋白（1-16）抗体（6E10）	Biolegend	SIG-39320	500X
冷冻切片快速抗原修复液	KeyGEN BioTECH	KGIHC005	5X
定量分析
Graphpad Prism 8.0.1	Graphpad		医学绘图软件
Image J Fiji 2.0.0	National Institute of Health		科学作图与数据分析软件