相变二甲基二十八烷基铵包壳微滴作为一种有前景的药物递送系统：哺乳动物肿瘤细胞三维球体实验结果

摘要

由二甲基二十八烷基溴化铵（DDAB）作为外壳的全氟戊烷微滴表现出优异的胶体稳定性及良好的生物界面特性。DDAB-MDs 被证实可作为高效的药物储库，对细胞质膜具有高亲和力，并在人三阴性乳腺癌（MDA-MB-231）三维模型中显著增强阿霉素的摄取及其抗肿瘤活性。

摘要

在广泛的诊疗应用中，相变全氟碳微滴（MDs）的显著改进依赖于对微滴组分的优化，以提升其合成效率、稳定性和药物递送能力。为此，设计了由阳离子表面活性剂二甲基二十八烷基溴化铵（DDAB）包覆形成的十氟戊烷（DFP）微滴。通过脉冲高功率超声辐照，可在数秒内快速获得高浓度的DDAB-MDs，所得微滴粒径约为1 µm，且分散性低。DDAB壳层所带的高度正ζ电位及其长链饱和烃结构，是稳定微滴及其所载药物的关键因素。DDAB壳层与细胞质膜具有高亲和性，可实现化疗药物在肿瘤细胞界面的局部富集，促进药物摄取。这使得DDAB-MDs成为一种极具潜力的药物递送工具，可在极低药物剂量下表现出显著的抗肿瘤活性。

在此研究中，该方法的疗效显示出可显著增强阿霉素对哺乳动物肿瘤细胞MDA-MB-231三维球状体的作用。该方法的使用 三维（3D）细胞培养以多细胞肿瘤球体（即呈球形的紧密聚集细胞）的形式发展，相较于二维（2D）细胞培养具有诸多优势：除了有望弥合传统 体外 研究和动物实验，将提升进行更具预测性分析的能力 体外 用于临床前药物开发的筛选实验，或评估药物超适应证使用潜力以及新的共靶向策略。

引言

能够确保高抗肿瘤疗效并减少副作用的药物递送载体是主要目标，但仍面临严峻的化学与药学挑战^1,2迄今为止，他们的进展最初受到对比度不足的限制 原位 药物释放与非特异性毒性的临界水平^3,4,5近年来，已开发出多种药物递送系统以改善抗癌药物的给药方式，包括脂质体、聚合物胶束和聚合物囊泡。^6,7,8,9,10这些系统在延长药物循环时间、提高药物选择性的同时，能够减少药物在健康器官和组织中的分布与蓄积，因而展现出良好的应用前景。然而，抗肿瘤化疗药物（如蒽环类药物）的包封制剂却显著降低了药物的细胞内化效率。近年来，刺激响应型微米及亚微米载体（如微泡）¹¹，微滴，杂化金纳米颗粒¹²，纳米水凝胶¹³，PLGA支架和介孔平台¹⁴，因其在靶向性和抑制肿瘤方面具有高度多功能性，可利用多柔比星（Dox）和多西他赛发挥药理作用，正日益受到药理学领域的关注。开创性实验致力于将这些载体转化为高效的抗癌“战士”，以执行多模态任务（即化疗、光热治疗和基因协同治疗）并实现分子成像¹⁵ 为个性化诊疗一体化纳米医学奠定了基础。

在此情境下，相变全氟碳微滴（MDs）因其在实现高载药量、针对生物屏障的微滴壳层化学多功能性、胶体稳定性以及合成效率方面所具备的关键优势而受到评估^11,12作为一种额外优势，通过声学或光学使全氟碳（PFC）核心发生汽化所增强的微滴（MDs）回声性，有助于实现 原位 成像及有前景的治疗效果。此外，通过电离粒子束能量释放产生的微泡核心汽化可用于束流追踪和辐射剂量测定。

本研究旨在开发由双十八烷基二甲基溴化铵（DDAB）阳离子表面活性剂的多用途外壳稳定的全氟戊烷（DFP）微滴。DDAB包覆的微滴满足了理化和生物学方面的各项预期。基于DFP的微滴已被证明是实现生物相容且稳定的全氟碳化物微滴的有价值相变对比剂¹⁶。DDAB晶体凝胶在生理温度下使长链饱和，深入渗透疏水核心，从而稳定微滴及其所载药物。此外，水界面处的高正ζ电位增强了微滴的胶体稳定性。DDAB外壳表面的生物学优势在于其能够在基本不影响哺乳动物细胞的浓度下诱导细菌和真菌死亡，并可结合带负电荷的质膜、抗原蛋白、核苷酸、DNA或纳米颗粒。上述特性可用于在哺乳动物细胞内产生显著的免疫佐剂作用、基因治疗效应及抗肿瘤作用¹⁷。

本文所述的载多柔比星DDAB微泡（Dox@DDAB-MDs）可促进药物释放，以应对高度侵袭性、侵润性强且分化程度低的三阴性乳腺癌细胞。以下介绍一种基于高功率探头超声处理的简单快速制备方法，可在一步法配方中获得粒径分布窄、稳定性高、密度大的DDAB微泡，并实现多柔比星的高效载药。此类特性即使与其他制备方法（如微流控装置和高剪切均质器）相比也具有竞争力¹⁶。

设计高效药物递送载体的另一个主要限制因素是，药物的活性取决于多种参数（例如吸收、分布、浓度），而这些参数只能在真实的生物靶标中获得，单层细胞模型无法反映这些情况¹⁸。因此，新型抗肿瘤制剂的研发历史中充斥着大量体外（in vitro）研究，但遗憾的是，这些研究在动物的临床前模型阶段就已显示出无效性¹⁹。

特别是，由于二维培养体系在药理学研究中存在固有局限性，因此迫切需要从细胞培养转向比体内（in vivo）和离体（ex vivo）研究更为复杂且可靠的系统。在此背景下，体外三维（in vitro 3D）系统应运而生，例如类球体、类器官和器官芯片等，这些系统能够模拟比二维单层培养更复杂的结构形态、活性及生理反应²⁰。从临床前研究的角度来看，模拟细胞微环境的三维细胞模型提供了一个更符合生理相关性的研究框架，有助于深入理解复杂的生物学过程，而传统的单层培养体系在此方面则效果有限^21,22。

在证实DDAB-MDs能够与人乳腺癌细胞的细胞膜相互作用，促进药物在极低（纳摩尔）阿霉素浓度下的内化并导致细胞死亡后，该方法在哺乳动物肿瘤细胞MDA-MB-231的三维球状体中的有效性也已得到验证。

方案

注意：所有试剂和仪器均列于材料表中。

1. 微滴的制备与表征

1. 制备载有阿霉素的 DDAB-MDs
   1. 将 DDAB 粉末溶解于乙醇中，得到终浓度为 10 mM、终体积为 1 mL 的溶液。将 2 mg 阿霉素粉末溶于乙醇中，配制 1 mL 阿霉素储备液。
      警告：阿霉素具有急性经口毒性（类别 4）和致癌性（类别 1B）。仅可在通风橱内操作，并佩戴手套和防护口罩。
   2. 在 15 mL 塑料刻度离心管中，向 300 µL DDAB 溶液（油相）中加入 250 µL DFP。
      注：DFP 纯度为 60%（GC），密度为 1.6 g/mL（20 °C），沸点为 55 °C。阿霉素纯度为 98.0–102.0%（HPLC）。DDAB 纯度 ≥98%（TLC）。乙醇纯度为 97%。
   3. 将 2.15 mL 去离子水轻柔地加入油相中，形成水/油两相混合物。在超声处理前，立即将 10 µL 阿霉素溶液直接注入油相中，以避免大量阿霉素分配进入水相。
   4. 使用高强度超声液体处理器（配备 1/8 英寸钛合金锥形微探头），以脉冲模式（开启 0.7 秒，关闭 0.3 秒）、20 kHz、100 W 条件下超声处理 10 秒，使两相混合物乳化。超声后立即用超滤去离子水（例如 MilliQ 水）将新制备的 MDs 溶液稀释 1.8 倍。
      注：稀释倍数为经验性选择，仅作参考。只要后续离心能获得足够沉淀，MDs 溶液可进一步稀释。
   5. 取 1 mL 所得悬浮液，离心 3 次，每次用超滤去离子水（例如 MilliQ 水）重悬，以去除多余的阿霉素和乙醇。第一次离心条件为 25 °C、360 ×g 离心 3 分钟，第二和第三次离心条件为相同温度和时间下 280 × g。
   6. 最后一次洗涤后，弃去上清液，吸取 5 µL 沉淀物并分散于 2 mL 细胞培养基中用于细胞处理，获得相当于 10 nM 的阿霉素浓度。阿霉素@DDAB-MDs 合成的实验步骤见 图 1。
      注：等效阿霉素浓度定义为在相同体积的阿霉素@DDAB-MDs 悬浮液中所含游离阿霉素的量。
2. 载阿霉素 DDAB-MDs 的表征
   1. 使用动态光散射（DLS）光度计测量粒径分布，并采用 CONTIN 算法分析所得自相关函数图以推导出相应的衰减时间。然后利用衰减时间确定颗粒扩散系数（D）的分布，并通过斯托克斯-爱因斯坦关系式 R_H = k_BT/6πηD 将其转换为流体力学直径分布（2R_H），其中 k_BT 为系统热能，η 为溶剂黏度。
   2. 同时使用明场显微镜结合图像分析软件（例如 Image J）检测粒径及粒径分布，每帧测量至少 100 个液滴的尺寸（共 3 至 4 帧），获得平均值和标准偏差。
      注：DLS 测量时，将 MDs 溶液用超滤去离子水（例如 MilliQ 水）、PBS 或细胞培养基稀释至固定浓度 1.5 × 10⁸ MDs/mL，以避免背向散射。在超滤去离子水、PBS 和细胞培养基中测得的平均粒径分别为 1.1 ± 0.1 µm、1.1 ± 0.25 µm 和 1.2 ± 0.2 µm。离心后从沉淀中回收的 MDs 在误差范围内未显示粒径变化。
   3. 使用显微镜细胞计数板评估 MDs 浓度。计数板包含两个不同计数区域，厚度为 0.10 mm。取 10 µL MDs 悬浮液滴加至计数板上，使用 40 倍长工作距离物镜的光学显微镜观察计数板中 0.25 × 0.25 nm² 方格内的 MDs 数量，并用图像分析免费软件进行分析。
   4. 根据以下公式计算 MDs 浓度，单位为 MDs/mL：
      
   5. 利用阿霉素在 590 nm 处的自发荧光，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像检测细胞内化的阿霉素。采用荧光测定法测定阿霉素含量：将颗粒分散于超滤去离子水或 PBS 中，在 25 °C、360 × g 条件下离心 3 分钟，通过标准曲线测定上清液在 590 nm 处的荧光强度以确定游离药物含量（阿霉素浓度线性范围：2–20 µmol/mL，R² = 0.99）。
      注：从总阿霉素浓度中减去测得值，即可得到包封的阿霉素量。实验需重复三次。阿霉素包封效率为 28% ± 2%，计算方法为 MDs 中阿霉素量除以所投入的总阿霉素量。
   6. 通过离心并重复 步骤 1.2.3 的操作，进行随时间推移的阿霉素释放实验，计算上清液中释放的阿霉素占包封总量的百分比。首次测定后，降低离心速度至 280 × g 以避免 MDs 破裂，重复操作。绘制随时间变化的释放曲线。确认 24 小时内上清液中释放的阿霉素浓度最高不超过 20%。
   7. 使用专用仪器（例如 NanoZetaSizer）在 37 °C 下测定 ζ 电位，并验证所得数值在 90–100 mV 范围内。

2. 在微模制非粘附性基底中制备球形体

1. 制备微模具
   1. 将小型 3D 模具和 1 g 纯琼脂糖粉末放入适合灭菌的容器中，在干燥循环条件下高压灭菌 30 分钟（121 °C）。
   2. 在生物安全柜中，向含有已灭菌琼脂糖的玻璃瓶中加入 50 mL 0.9% 生理盐水（NaCl）溶液，并将其放入微波炉中加热至沸腾以溶解粉末。待熔融琼脂糖冷却至 60 °C 后，用移液器向每个微模具中加入 500 µL，注意避免产生气泡。
      警告：熔融琼脂糖可导致严重皮肤灼伤，需佩戴适当个人防护装备。
   3. 通过轻轻弯曲模具取出凝固的琼脂糖，并移除新形成的基底。将基底放入 12 孔板中，每孔加入 2 mL 新鲜培养基。在孵育箱中孵育至少 15 分钟，使各基底达到平衡。
      注意：提前配制培养基，并通过 0.22 µm 滤膜过滤，以去除可能的颗粒或污染物。
2. 接种细胞
   1. 使用完全培养基（DMEM 添加 1% 青霉素/链霉素、10% 胎牛血清和 1% L-谷氨酰胺）在 37 °C、5% CO₂ 的细胞培养孵育箱中培养 MDA-MB 231 细胞。当 T75 培养瓶中细胞融合度达到约 80% 时，弃去培养基，用 4 mL DPBS 洗涤一次，然后加入 3 mL 胰蛋白酶/EDTA。将培养瓶放回孵育箱，等待细胞脱落。每隔 5 分钟在倒置显微镜下（20×）观察细胞脱落情况。
   2. 用含 10% FBS 的 3 mL DPBS 收集脱落细胞至 15 mL 离心管中，以 235 × g 离心 10 分钟。弃去含有 DPBS 和胰蛋白酶/EDTA 的上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL 新鲜培养基中。取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合，使用血球计数板进行细胞计数。
      注意：收集细胞时，使用含 10% FBS 的 DPBS 中和胰蛋白酶/EDTA，以防止在离心过程中胰酶对细胞造成损伤。
   3. 为获得标称直径为 50 µm 的类球体（约 15 个细胞/类球体），将细胞悬液稀释至最终浓度为 3,840 个细胞/190 µL，可在小型模具中形成 256 个类球体。或者，为获得直径 200 µm 的类球体（约 1,000 个细胞/类球体），根据制造商说明，将细胞悬液稀释至最终浓度为 81,000 个细胞/190 µL，可在大型模具中形成 81 个类球体。
   4. 移除 12 孔板中的培养基，倾斜基底以小心去除细胞接种腔内的液体。向每个基底中加入 190 µL 细胞悬液（逐滴加入），并在组织培养孵育箱中静置 10 分钟，使细胞沉降。
   5. 每孔加入 2 mL 周围培养基，将多孔板放回孵育箱。每隔 24 小时观察类球体形成情况，必要时更换新鲜培养基。
3. 类球体的收获与处理
   1. 在孵育箱中将含有 2 mL 新鲜培养基的 35 mm 培养皿预平衡 10–15 分钟。
   2. 移除基底周围的细胞培养基。用无菌镊子将基底从孔中取出并倒置放入培养皿中。轻轻敲击基底底部，使类球体在重力作用下脱落。
   3. 将含有类球体的培养皿放回孵育箱，以备后续处理。类球体制备流程如 图 2 所示。

3. 类球体处理

1. 从模具中移除上清液，并加入 200 µL 按步骤 1.1.6所述方法制备的 Dox@DDAB-MDs 分散液。
2. 5 分钟后，每孔加入 2 mL 周围培养基以达到平衡。在完成所需处理时间后，按步骤 2.1进行后续操作。

4. 类球体大小和形态的表征

1. 在所需的孵育时间后，使用40倍物镜结合显微镜图像处理软件检测类球体的大小。
2. 测量至少10个类球体的大小，以收集足够的数据进行适当的统计分析，并按照步骤7中所述分析其体积。

5. 增殖/活力检测：活细胞染色荧光显微镜观察

注意：请按照类球体构建的说明操作，直至步骤 2.2.5。

1. 从模具中移除上清液，并加入 200 µL 含 4 µM 钙黄绿素-AM 的 PBS 溶液，室温避光孵育 3 小时。在孵育的最后 20 分钟，加入 10 µg/mL 碘化丙啶以标记死细胞。
2. 按照 步骤 2.3.2 的方法，将基底倒置至培养皿中以收集球状体。
3. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），配备 40x/60x 物镜和 Ar+ 激光器，在染色溶液中对球状体进行成像，适当调节增益和针孔大小，以获得清晰的聚焦图像。

6. 图像分析与采集

1. 透射光与共聚焦二维图像
   1. 打开共聚焦软件（补充文件 A），选择物镜（60x、40x 等）。在右侧面板点击 Trans 以选择透射光通道。
   2. 点击 Live 以实时查看图像并寻找最佳焦平面。点击 Single 停止图像采集。
   3. 对于共聚焦图像，根据所用荧光染料选择 Red 或 Green 激光通道。在针孔部分的下拉菜单中选择 S-aperture，并将增益部分设置为 6.00 B。
   4. 点击 Live ，调整针孔孔径和增益以优化对比度。点击 Single 停止采集并保存图像。通过顶部工具栏选择正确的通道，叠加透射光与共聚焦图像。
2. 共聚焦三维图像
   1. 在右侧面板点击 Z（补充文件 B）。点击红色按钮重置设置。
   2. 选择 Ref 部分，点击 Live 并通过调节焦距在样品内部寻找中位平面。选择 Top 部分并将焦距向上移动，直至样品失焦并消失。
   3. 重复 步骤 6.2.2，向下移动焦距以确定底部平面。
   4. 将步长设置为 0.75 µm。点击 Z-stack，然后点击 Single 开始扫描。将图像保存为 .ics 格式。
3. 光学图像采集与分析
   1. 打开光学显微镜软件，通过点击顶部工具栏的 Play 按钮，使用 40x 长工作距离物镜或 20x 物镜采集图像。点击 Stop 并保存图像。
   2. 在顶部工具栏点击 View、Analysis Control、Annotations and Measurements，打开包含多个选项的面板（补充文件 C）。在 Annotation and Measurements 面板中选择 Semiaxis，然后点击 Ellipse。
   3. 在 Image Search 中，寻找最符合样品形状的轴线，按键盘上的 Enter 键将获得的数值传送到右侧面板的表格中。
   4. 对至少 10 个样品重复 步骤 6.3.3 以获得足够数据。点击 Export to Excel Data Sheet 导出数据并保存。
4. 三维 Z-Stack 图像可视化与体积数值计算
   1. 在光学显微镜软件中打开共聚焦显微镜采集的三维图像（补充文件 D）。
   2. 要查看三维重建图像，请在图像工具栏中点击 Show Volume View；通过按住鼠标左键可将样品向任意方向旋转。如需选择体积的一部分，请持续按住 ctrl + 左鼠标键（补充文件 E）。
   3. 按下键盘上的 x 键，截取三维图像快照并保存。
   4. 要计算样品体积，请点击 Measure，选择 3D object measurements 以打开面板（补充文件，图像 F）。点击面板工具栏中的 Define 3D threshold，并结合平滑和去噪滤波器设置最佳阈值（补充文件，图像 G）。点击 OK 后，在 3D object measurements 面板中将显示包括体积在内的多个参数。
   5. 点击 Export to Excel 导出数据并保存。

7. 类球体数据分析

1. 对于类球体体积的计算，将三维结构近似为一个长椭球体，并通过二维投影估算其长轴和短轴，如图3插图所示。
2. 通过将如步骤6.4所示的数值计算体积与长椭球体体积公式 进行比较，验证长椭球体近似的准确性，其中 b>a=c，a、b 和 c 分别为椭球体的轴长。
3. 计算至少10个类球体的平均体积及其对应的标准偏差。如果类球体的体积分布呈正态分布，应用狄克逊检验识别并剔除异常值。随后，计算处理组与对照组之间的体积比，并结合如图6A所示的误差传递方法进行误差分析。

结果

根据方案（第1节）制备了Dox@DDAB-MDs，其过程如图1所示。所获得的MDs由单层DDAB包裹DFP核心构成（图1A）。DDAB的阳离子电荷及超声处理可防止DDAB在DFP与水界面处形成多层脂质结构²³。

共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）显微图像（图1B）显示，生成了浓度为 1.5 × 10¹⁰ MDs/mL、平均直径约为 1 µm 的浓缩球形液滴。阿霉素（Dox）发出的红色荧光表明药物有效稳定地被封装并限制在微滴（MDs）内部。动态光散射（DLS）测量结果证实，MDs 的粒径分布较窄，平均粒径为 1.1 ± 0.1 µm，多分散系数（PDI）为 0.1（图1B）。MDs 的 ζ-电位为 90 ± 5 mV。

讨论

为了提高蒽环类药物作为抗肿瘤药物的疗效，本研究介绍了包裹化疗药物阿霉素（Dox）且由DDAB包壳的全氟化碳液滴的制备方法，并探讨了该制剂与高侵袭性三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231相互作用的效果。

构建 DOX@DDAB-MDs
通过声乳化法，采用一种极为快速、高度可重复、操作简便且高效的方案，已成功制备出载药多相液滴（MDs）。该方法可获得粒径分布非常均一、平均粒径约为 1 µm 的 MDs，并实现较高载药量。以下实验步骤需特别注意：a) 步骤 1.1.3：为最大化药物在 MDs 中的负载与储存效率，应在声乳化前立即将多柔比星（Dox）的醇溶液缓慢注入油相，以避免大量 Dox 分配进入水相。b) 步骤 1.1.4：建议在声乳化后立即稀释所得分散液，因为即使由于测得的高ζ电位提供了静电稳定作用，高浓度液滴仍可能加速聚并。c) 步骤 1.1.6：如前所述，高ζ电位不仅有助于抑制液滴的自发聚并，还为离心和洗涤操作提供了充足的时间，而不会影...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
µ- 培养皿	Ibidi	81156	35毫米高，IbiTreat
1,1,1,2,3,4,4,5,5,5-十氟戊烷	Sigma-Aldrich	138495-42-8	b.p. 55°C
12孔培养板	康宁
15 ml 离心管	Falcon	89039-664
3D-Petri 培养皿 12:256	微组织（Sigma-Aldrich）	Z764000-6EA	小
3D-Petri 培养皿 12:81	微组织（Sigma-Aldrich）	Z764019-6EA	大
5%CO₂ 培养箱，37℃°C	赛默飞世尔科技		HERAcell 150i
50 ml 离心管	Falcon	352070
II级生物安全柜
钙黄绿素	Sigma-Aldrich
Calcein-AM	Sigma-Aldrich	148504-34-1	DMSO 中 4 mM 储备液
cam sCMOS Andor Zyla 4.2	Andor Instruments
Hettich Universal 320R 离心机	Hettich 实验室技术
DAPI	Sigma-Aldrich
二甲基二十八烷基溴化铵粉末	Sigma-Aldrich	3700-67-2
DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）	康宁	15-013-CV
盐酸多柔比星	Sigma-Aldrich	25316-40-9
DPBS（Dulbecco 改良型 PBS）	康宁	21-030-CV	pH 7.4
70% 乙醇	Sigma-Aldrich
EZ-C1 数字共聚焦显微镜	尼康仪器公司		银色版本 3.91
胎牛血清（FBS）	康宁	35-079-CV
Goniometer BI-200SM	布鲁克海文仪器公司
Laser Ar+	Spectra Physics
氦氖激光器	Melles-Griot
L-谷氨酰胺	康宁	25-005-CI
尼康Eclipse Ti显微镜	尼康仪器公司
MDA-MB 231细胞系	ATCC
Microsoft Excel	微软
Spark 酶标仪	Tecan 集团
NanoZetaSizer ZS	马尔文仪器有限公司
Neubauer 改良计数室		718605
NIS Elements 软件	尼康仪器公司		AR 4.30
青霉素/链霉素	康宁	30-002-CI
光子相关仪 BI-9000 AT	布鲁克海文仪器公司	62927-1
光度计 HC120	布鲁克海文仪器公司	N° 1275
移液器和吸头，多种规格	Gilson
碘化丙啶	Sigma-Aldrich
不同规格的血清移液管	康宁
固态激光器	Suwtech 激光器	N° 22368
T25 培养瓶	Sarstedt	83.3910.002
T75 培养瓶	Sarstedt	83.3911.002
0.05% 胰蛋白酶/EDTA	EuroClone	ECB3052D
Vibra-Cell VCX-400	声学 & 材料有限公司
水浴锅			37°C