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冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

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DOI：

10.3791/62261

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2021年5月29日

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1Centro Nacional de Biotecnología, Campus Universidad Autónoma de Madrid, 2Faculty of Informatics, Masaryk University, 3Institute of Computer Science, Masaryk University, 4Campus Urbanización Montepríncipe, Universidad San Pablo CEU

本文内容

摘要

冷冻电子显微镜中的单颗粒分析是用于高分辨率解析生物大分子复合物结构的主要技术之一。Scipion 提供了完整的工具链，可用于处理显微镜获取的数据，并实现生物样本的三维重构。

摘要

冷冻电子显微镜已成为生物研究中揭示大分子近原子分辨率结构信息的最重要工具之一。在单颗粒分析中，通过电子束对玻璃态冰冻样品进行成像，显微镜柱末端的探测器生成该样品的电影图像。这些电影包含数千张相同颗粒在随机取向下的图像。这些数据需要经过包含多个步骤的图像处理流程，以获得最终的三维重构体积。图像处理流程的目标是确定采集参数，从而能够重构所研究的样品。Scipion 提供了使用多种图像处理软件包在集成框架中构建该流程的全部工具，同时支持结果的可追溯性。本文以一个真实测试案例的数据为例，全面介绍并讨论了 Scipion 中的整个图像处理流程，详细说明了从显微镜获取的电影图像到高分辨率最终三维重构的全过程。此外，还探讨了使用共识性工具的强大功能，这些工具可整合不同方法，并在流程的每一步验证结果，从而提高最终结果的准确性。

引言

在冷冻电子显微镜（cryo-EM）中，对玻璃态冷冻水合样品进行单颗粒分析（SPA）是生物大分子成像中最广泛使用且最成功的方法之一，因为它能够揭示分子间的相互作用以及生物复合物的功能1。这得益于该成像技术的近期进展，引发了所谓的“分辨率革命”2，并成功解析出接近原子分辨率的生物三维结构。目前，单颗粒分析冷冻电镜达到的最高分辨率为1.15 Å，针对脱铁铁蛋白3（EMDB编号：11668）。这些技术进步包括样品制备4、图像采集5和图像处理方法6的改进。本文重点讨论最后这一方面。

简而言之，图像处理方法的目标是确定所有采集参数，以逆向解析显微镜的成像过程，从而重建所研究生物样本的三维结构。这些参数包括相机的增益、电子束诱导的运动、显微镜的像差（主要是离焦）、每个颗粒的三维角度取向和位移，以及在样本存在构象变化情况下的构象状态。然而，参数数量极多，且冷冻电镜（cryo-EM）需采用低剂量成像以避免辐射损伤，这显著降低了所获取图像的信噪比（SNR）。因此，该问题无法被唯一求解，所有待计算的参数仅能通过估计获得。在整个图像处理流程中，应识别出正确的参数，并剔除其余不准确的参数，最终获得高分辨率的三维重构结果。

显微镜生成的数据以帧的形式收集。简化来说，当使用电子计数探测器时，每一帧包含到达图像中特定位置（像素）的电子数量。在特定视野范围内会收集多帧图像，这称为一段电影。由于采用低电子剂量以避免辐射损伤破坏样品，信噪比（SNR）非常低，因此需要对同一段电影中的各帧进行平均，以获得能够揭示样品结构信息的图像。然而，所采用的并非简单的平均方法，因为在成像过程中，样品可能因电子束诱导的运动而发生漂移或其他类型的移动，这些运动需要被校正。经过漂移校正并平均后的帧最终生成一幅显微图像。

获得显微照片后，我们需要估计每张图像中由显微镜引入的像差，称为对比度传递函数（Contrast Transfer Function, CTF），它表示显微照片对比度随频率变化的情况。随后可以进行颗粒的选择与提取，这一过程称为颗粒挑选（particle picking）。每个颗粒应为仅包含一份待研究样品的小图像。目前有三类颗粒挑选算法：1）仅利用颗粒外观的一些基本参数化特征（如颗粒大小）在整套显微照片中寻找颗粒；2）通过用户输入或预训练数据集学习颗粒外观特征的算法；3）使用图像模板的算法。这三类算法具有不同的特性，将在后续展示。

显微照片中提取的颗粒集合将用于二维分类过程，该过程有两个目标：1）通过剔除包含纯噪声图像、重叠颗粒或其他伪影的子集来净化颗粒集合；2）每个类别的平均颗粒可作为初始信息用于计算三维初始体积。

三维初始体积的计算是接下来的关键步骤。获得三维结构的问题可以被视为一个多维解空间中的优化问题，其中全局最小值即为能够最好地代表原始结构的三维体积，但该空间中还存在多个代表次优解的局部最小值，很容易陷入其中。初始体积是搜索过程的起点，因此初始体积估计不佳可能会导致我们无法找到全局最小值。从初始体积出发，通过三维分类步骤有助于发现不同的构象状态，并再次对粒子集进行清理；其目标是获得结构上均一的粒子群体。随后，三维精修步骤将负责优化每个粒子的角度和位移参数，以获得尽可能最佳的三维体积。

最后，在最后的步骤中，可对获得的三维重构结果进行锐化和优化。锐化是指增强重构体积中高频信息的过程，而优化则是指在颗粒水平上进一步调整一些参数，如CTF或电子束诱导运动校正。此外，还可以采用一些验证方法，以更好地理解整个工作流程结束时所达到的分辨率。

经过上述所有步骤后，通过从头构建原子模型或拟合现有模型，示踪和对接过程7将有助于为获得的三维重构赋予生物学意义。如果达到高分辨率，这些过程将揭示结构中生物大分子的精确位置，甚至包括各个原子的位置。

Scipion8 能够以整合的方式结合最相关的图像处理软件包，创建完整的 workflow。Xmipp9、Relion10、CryoSPARC11、Eman12、Spider13、Cryolo14、Ctffind15、CCP416、Phenix17 以及许多其他软件包均可集成到 Scipion 中。此外，它还集成了所有必要的工具，以提升整合性、互操作性、可追溯性和可重复性，从而实现对整个图像处理 workflow 的全面追踪8。

Scipion 允许我们使用的最强大工具之一是共识（consensus）方法，即在处理流程的某一步骤中，将多种方法获得的结果进行比较，整合不同方法所传递的信息，从而生成更精确的输出。这种方法有助于提升性能，并改善所估计参数的达到质量。需要注意的是，可以构建不使用共识方法的更简单工作流程；然而，我们已经认识到该工具的强大作用22,25，本文所呈现的工作流程将在多个步骤中使用这一方法。

前文所述的所有步骤将在下一节中详细说明，并结合使用 Scipion 软件进行完整的流程演示。同时，还将展示如何利用一致性分析工具，提高生成结果之间的吻合度。为此，本研究选用Plasmodium falciparum 80S 核糖体的示例数据集（EMPIAR 编号：10028，EMDB 编号：2660）。该数据集包含 600 段电影图像，每段包含 16 帧，图像尺寸为 4096×4096 像素，像素大小为 1.34Å，数据采集于 FEI POLARA 300 电镜，配备 FEI FALCON II 相机，EMDB 报道的分辨率为 3.2Å18。

方案

1. 在 Scipion 中创建项目并导入数据

  1. 打开 Scipion，点击创建项目，指定项目名称以及保存位置（补充图 1）。Scipion 将打开项目窗口，显示一个画布，左侧面板列出了可用的方法，每个方法代表一个可用于管理数据的图像处理工具。
    注意：Ctrl+F 可用于查找未出现在列表中的方法。
  2. 要导入显微镜拍摄的电影文件，请在左侧面板中选择pwem - 导入电影（或按 Ctrl+F 后输入该名称）。
  3. 此时将打开一个新窗口（补充图 2）。在此处填写数据路径和采集参数。本示例使用以下设置：显微镜电压 300 kV，球面像差 2.0 mm，振幅对比度 0.1，放大倍率 50000，采样率模式 设为来自图像，像素尺寸 1.34 Å。填写完表单中的所有参数后，点击执行按钮。
    注意：当方法开始运行时，画布上会出现一个黄色标签为运行中的方框。当方法完成时，方框变为绿色，标签变为已完成。如果方法执行过程中发生错误，方框将显示为红色，标签为失败。此时，请检查画布底部的输出日志选项卡，其中将显示错误说明。
  4. 方法完成后，在画布底部的摘要选项卡中查看结果。此处会列出该方法生成的输出内容，本例中为电影文件集合。点击分析结果按钮，将弹出一个显示电影列表的新窗口。

2. 电影对齐：从电影文件到显微照片

  1. 使用方法 xmipp3 - 光学对齐，该方法实现了光流法19。使用以下参数填写表单（补充图3）：输入电影为步骤1中获得的结果，对齐帧范围设置为从第2帧到第13帧，其余选项保持默认值。运行程序。
    注意：表单中加粗的参数必须始终填写。其他参数将具有默认值或非必填项。在表单窗口的上方部分，可以找到用于分配计算资源的字段，例如线程、MPI 或 GPU。
  2. 点击 分析结果 以检查所获得的显微照片以及估计位移的轨迹（图1）。对于每一张显示的显微照片，需查看其功率谱密度（PSD）、用于对齐电影的轨迹（每帧对应一个点）在笛卡尔坐标和极坐标下的表现，以及所生成显微照片的文件名（点击文件名可查看该显微照片）。请注意，与电影中的单帧图像相比，样品中的颗粒在显微照片中更加清晰可见。

3. CTF 估计：计算显微镜的像差

  1. 首先，使用方法 grigoriefflab - ctffind15。设置如下：输入显微图像为步骤2的输出，手动CTF下采样因子设为1.5，分辨率范围从0.06到0.42。此外，在高级选项中（可在表单的专家级别中选择该选项以显示），将窗口大小设为256。其余参数保持默认值（补充图4）。
    注意：在Scipion的大多数方法中，高级选项会显示更多配置参数。请谨慎使用这些选项，仅在完全了解待运行程序及其参数含义时使用。某些参数若不查看数据可能难以填写；此时Scipion会在右侧显示一个魔法棒图标，点击后将弹出向导窗口（补充图5）。例如，本表单中的分辨率字段特别有用，因为这些值应大致覆盖PSD中从第一个零点到最后一个明显环状结构的区域。
  2. 方法运行完成后，点击执行和分析结果（图2）。检查估计的CTF是否与实验结果相符。为此，请查看PSD，并将角落中估计的环状结构与数据产生的环状结构进行比较。同时检查获得的离焦值，以发现任何异常值，并据此剔除或重新计算相应显微图像。在本示例中，整套显微图像均可使用。
    注意：如有需要，可使用窗口底部的按钮创建显微图像子集（使用显微图像红色按钮）或重新计算CTF（使用重新计算CTF红色按钮）。
  3. 为优化先前的估计结果，使用xmipp3 - ctf estimation20。将步骤2的输出选为输入显微图像，选择使用先前CTF估计的离焦值选项，在先前CTF估计中选择grigoriefflab - ctffind的输出结果，并在高级级别中将窗口大小更改为256（补充图6）。运行该方法。
  4. 点击分析结果以检查获得的CTF。此方法会估计并展示更多数据，体现在额外的若干列中。由于未发现任何错误的估计值，所有显微图像将在后续步骤中被使用。

4. 颗粒挑选：在显微照片中识别颗粒

  1. 开始挑选前，对显微照片进行预处理。打开 xmipp3 - preprocess micrographs，将步骤 2 中获得的显微照片设置为 Input micrographs，并选择 Remove bad pixels? 选项，其 Multiple of Stddev 设为 5，同时选择 Downsample micrographs? 选项，其 Downsampling factor 设为 2（补充图 7）。点击 Execute，并确认所得显微照片的尺寸已减小。
  2. 进行颗粒挑选时，使用 xmipp3 - manual-picking (step 1) 和 xmipp3 - auto-picking (step 2)21。手动挑选用于手动准备一组颗粒，自动挑选步骤将基于该组颗粒进行学习并生成完整的颗粒集合。首先，运行 xmipp3 - manual-picking (step 1)，将上一步预处理得到的显微照片作为 Input Micrographs。点击 Execute，将出现一个新的交互式窗口（图 3）。
  3. 在此窗口中会显示显微照片列表（图 3a）及其他选项。将 Size (px) 更改为 150，这将是包含每个颗粒的框的大小。所选显微照片将在较大的窗口中显示。选择一个区域，并挑选其中所有可见的颗粒（图 3b）。然后点击 Activate Training 以开始学习过程。显微照片的其余区域将被自动挑选（图 3c）。检查已挑选的颗粒，必要时可通过点击添加更多颗粒，或通过按住 Shift 并点击删除错误的颗粒。
  4. 在第一个窗口中选择下一张显微照片。该显微照片将被自动挑选。再次检查以添加或删除部分颗粒（如有必要）。重复此步骤，大约处理 5 张显微照片，以创建一个具有代表性的训练集。
  5. 完成上述操作后，点击主窗口中的 Coordinates 以保存所有已挑选颗粒的坐标。该颗粒训练集现已准备就绪，可用于自动挑选，以完成对所有显微照片的处理。
  6. 打开 xmipp3 - auto-picking (step 2)，在 Xmipp particle picking run 中指定前述的手动挑选结果，并将 Micrographs to pick 设为 Same as supervised。点击 Execute。该方法将输出约 100000 个坐标。
  7. 采用一致性方法，再执行第二种挑选方法，以选择两种方法均认可的颗粒。打开 sphire - cryolo picking14，将预处理后的显微照片选为 Input Micrographs，将 Use general model? 设为 Yes，Confidence threshold 设为 0.3，Box Size 设为 150（补充图 8）。运行该程序。此方法也应生成约 100000 个坐标。
  8. 运行 xmipp3 - deep consensus picking22。在 Input coordinates 中包含 sphire - cryolo picking（步骤 4.7）和 xmipp3 - auto-picking（步骤 4.6）的输出结果，将 Select model type 设为 Pretrained，并将 Skip training and score directly with pretrained model? 设为 Yes（补充图 9）。运行该程序。
  9. 点击 Analyze Results，然后在新窗口中点击 Select particles/coordinates with high 'zScoreDeepLearning1' values 旁边的“眼睛”图标。将打开一个新窗口，列出所有颗粒（图 4）。列中的 zScore 值可反映颗粒质量，低值表示质量较差。
    1. 点击标签 _xmipp_zScoreDeepLearning，按 zScore 从高到低对颗粒排序。选择 zScore 高于 0.75 的颗粒，然后点击 Coordinates 以创建新的子集。这应生成一个包含约 50000 个坐标的子集。
  10. 打开 xmipp3 - deep micrograph cleaner。将上一步获得的子集作为 Input coordinates，将 Micrographs source 设为 same as coordinates，并将 Threshold 保持为 0.75。运行该程序。在 Summary 选项卡中检查坐标数量是否减少，尽管在此情况下仅会移除少量坐标。
    注：此步骤可进一步清理坐标集，在处理含有更多电影伪影（如碳区或大尺寸杂质）的其他数据集时可能非常有用。
  11. 运行 xmipp3 - extract particles（补充图 10）。将上一步得到的坐标作为 Input coordinates，将 Micrographs source 设为 other，将 Input micrographs 设为步骤 2 的输出结果，将 CTF estimation 设为 xmipp3 - ctf estimation 的输出结果，将 Downsampling factor 设为 3，将 Particle box size 设为 100。在表单的 Preprocess 选项卡中，全部选择 Yes。运行该程序。
  12. 检查输出结果，应包含尺寸减小为 100×100 像素的颗粒，像素大小为 4.02 Å/px。
  13. 再次运行 xmipp3 - extract particles，更改以下参数：Downsampling factor 设为 1，Particle box size 设为 300。检查输出结果是否为同一组颗粒，但现在为全分辨率。

5. 二维分类：将相似颗粒分组归类

  1. 打开方法 cryosparc2 - 2d classification11，将Input particles设置为步骤4.11中获得的结果，在2D Classification选项卡中将Number of classes设为128，其余参数保持默认值，运行该方法。
  2. 点击Analyze Results，然后点击Display particle classes with Scipion旁边的“眼睛”图标（图5）。该分类有助于清理粒子集合，因为部分类别会显示为噪声或含有伪影。选择包含良好视图的类别，点击Particles （窗口底部的红色按钮）以生成更干净的子集。
  3. 接着打开xmipp3 - cl2d23，将上一步获得的图像作为Input images，Number of classes设为128，点击Execute。
    注意：第二次分类用作粒子集合的额外清理步骤，通常有助于尽可能去除噪声粒子。然而，若希望流程更简化，仅使用一种2D分类方法亦可。
  4. 方法完成后，点击Analyze Results并选择What to show: classes，查看生成的128个类别。大多数生成的类别显示出大分子具有一定细节水平的投影，但其中部分类别仍呈现噪声（本例中约10个类别）。选择所有质量良好的类别，点击Classes 按钮，生成仅包含优质类别的新子集。该子集将作为生成初始体积的方法之一的输入。使用相同的选择，点击Particles 按钮，移除属于不良类别的粒子，从而创建更干净的粒子子集。
  5. 打开pwem - subset，将Full set of items设为4.13步骤的输出结果（全尺寸的所有粒子），Make random subset设为No，Other set设为上一步生成的粒子子集，Set operation设为intersection。此操作将从全分辨率粒子中提取前述子集。

6. 初始体积估计：构建三维体积的初步猜测

  1. 在此步骤中，使用两种不同方法估算两个初始体积，然后利用共识工具生成最终的三维体积估算结果。打开 xmipp3 - reconstruct significant24 方法，将 Input classes 设置为步骤5后获得的结果，Symmetry group 设置为 c1，其余参数保持默认值（补充图11），然后执行该操作。
  2. 点击 分析结果。确认获得一个尺寸为 100×100×100 像素、像素大小为 4.02 Å/px 的低分辨率体积。
  3. 打开 xmipp3 - crop/resize volumes（补充图12），将上一步获得的体积作为 Input Volumes，将 Resize volumes? 设置为 是，Resize option 设置为 Sampling Rate，并将 Resize sampling rate 设置为 1.34 Å/px，然后运行。在 摘要 选项卡中检查输出体积是否具有正确的尺寸。
  4. 现在创建第二个初始体积。打开 relion - 3D initial model10，将全分辨率下的优质粒子（步骤5.5的输出）作为 Input particles，将 Particle mask diameter 设置为 402 Å，其余参数保持默认值，然后运行。
  5. 点击 分析结果，然后选择 Display volume with: slices。确认获得一个低分辨率但具备结构主要形状的体积（补充图13）。
  6. 接下来，打开 pwem - join sets，将两个生成的初始体积合并，以作为共识方法的输入。仅需将 Volumes 设置为 Input type，并在 Input set 中选择这两个初始体积，然后运行。输出应为一个包含两个体积的集合。
  7. 共识工具包含在 xmipp3 - swarm consensus25 中。打开该工具，将全分辨率下的优质粒子（步骤5.5的输出）作为 Full-size Images，将上一步生成的包含两个体积的集合作为 Initial volumes，并确保 Symmetry group 为 c1，然后点击 执行。
  8. 点击 分析结果。确认获得一个细节更丰富的输出体积（图6）。尽管结构周围存在更多噪声，但结构图中更丰富的细节有助于后续的精修步骤避免陷入局部极小值。
    注：若已安装 UCSF Chimera26，可使用窗口上方的最后一个图标对所得体积进行三维可视化。
  9. 打开并执行 relion - 3D auto-refine10，以对粒子进行首次三维角度分配。将步骤5.5的输出作为 Input particles，并将 Particle mask diameter 设置为 402 Å。在 Reference 3D map 选项卡中，选择上一步获得的体积作为 Input volume，Symmetry 设置为 c1，Initial low-pass filter 设置为 30 Å（补充图14）。
  10. 点击 分析结果。在新窗口中，将 final 选为 Volume to visualize，然后点击 Display volume with: slices 查看所得体积。同时在结果窗口中点击 Display resolution plots 查看傅里叶壳层相关性（FSC），并在 Display angular distribution: 2D plot 中检查角度覆盖情况（图7）。重建的体积包含更多细节（结构外周可能有部分模糊区域），FSC 在约 4.5 Å 处穿过 0.143 阈值，角度覆盖完整覆盖整个三维球面。

7. 三维分类：发现构象状态

  1. 采用共识方法，可判断数据中是否存在不同的构象状态。打开 relion - 3D 分类10（补充图15）。在 输入颗粒 中使用步骤6.10中获得的结果，并将 颗粒掩膜直径 设置为402Å。在 参考3D图谱 选项卡中，将步骤6.10后获得的图谱作为 输入体积，将 对称性 设为c1，将 初始低通滤波 设为15Å。最后，在 优化选项卡 中，将 类别数量 设置为3，运行该任务。
  2. 点击 分析结果 查看结果，选择 在Scipion中显示分类。系统将显示生成的三个类别及一些重要指标。前两个类别的分配图像数量（大小 列）应相近且外观非常相似，而第三个类别的图像数量较少且外观更模糊。此外，前两个类别的 rlnAccuracyRotations 和 rlnAccuracyTranslations 值应明显更优。选择其中两个最佳类别，点击 类别 按钮以生成包含这两个类别的子集。
  3. 重复步骤7.1和7.2，生成第二组优质类别。这两组子集将作为共识工具的输入。
  4. 打开并运行 xmipp3 - 三维类别共识，将前几步生成的两个子集选为 输入类别。
  5. 点击 分析结果。系统将显示类别间重合颗粒的数量：第一个数值表示子集1的第一个类别与子集2的第一个类别之间的重合颗粒数，第二个数值表示子集1的第一个类别与子集2的第二个类别之间的重合颗粒数，依此类推。请确认颗粒被随机分配至类别一或类别二，这表明3D分类方法未能识别出构象变化。基于此结果，后续处理将使用全部颗粒集合。

8. 三维精修：对均一粒子群体的取向角度分配进行优化

  1. 在此步骤中再次采用共识方法。首先，打开并运行 pwem - subset，将 Full set of items 设置为 6.9 步骤的输出结果，将 Make random subset 设为 Yes，并将 Number of elements 设为 5000。通过此操作，可生成一个已进行过初步对齐的图像子集，用于训练下一步所使用的方法。
  2. 打开 xmipp3 - deep align，将 Input images 设置为 5.5 步骤中获得的优质颗粒输出结果，将 Volume 设置为 6.10 步骤后获得的体积，将 Input training set 设置为上一步创建的训练集，将 Target resolution 设为 10Å，并保持其余参数为默认值（补充图16）。点击 Execute。
  3. 点击 Analyze Results 以检查获得的角度分布，此时应无缺失方向，且角度覆盖范围相较于 6.10 步骤略有改善（图8）。
  4. 打开并执行 xmipp3 - compare angles，将 Input particles 1 选择为 6.9 步骤的输出结果，将 Input particles 2 选择为 8.2 步骤的输出结果，并确保 Symmetry group 为 c1。该方法用于计算 xmipp3 - deep align 与 relion - 3D auto refine 之间的结果一致性。
  5. 点击 Analyze Results，将显示包含各颗粒在偏移量和角度上差异的列表。点击窗口上方的柱状图图标，将打开另一个可绘制计算变量图表的窗口。选择 _xmipp_angleDiff 并点击 Plot，以查看每个颗粒的角度差异分布图；同样操作 _xmipp_shiftDiff。在这些图中，约一半的颗粒两种方法结果一致（图9）。选择角度差异小于 10º 的颗粒，并创建新的子集。
  6. 现在，打开 xmipp3 - highres27 以对已分配的角度进行局部精细化。首先，将 Full-size Images 设置为上一步获得的图像，将 Initial volumes 设置为 6.9 步骤的输出结果，将 Radius of particle 设为 150 像素，Symmetry group 设为 c1。在 Angular assignment tab 中，将 Image alignment 设为 Local，Number of iterations 设为 1，Max. Target Resolution 设为 5Å/px（补充图17）。运行该流程。
  7. 在 Summary 选项卡中，确认输出体积小于 300×300×300 像素，且像素尺寸略大。
  8. 点击 Analyze Results 查看获得的结果。点击 Display resolution plots 查看傅里叶壳层相关系数（FSC），点击 Display volume: Reconstructed 查看重建的体积（补充图18）。可获得分辨率达到约 4–3.5Å 的高质量体积。
  9. 点击 Display output particles，在显示颗粒列表的窗口中点击上方的柱状图图标。在新窗口中，将 Type 设为 Histogram，Bins 设为 100，选择 _xmipp_cost label，最后点击 Plot （补充图19）。由此可展示 cost 标签的直方图，该标签包含颗粒与其所选投影方向之间的相关性。本例中获得单峰密度函数，表明颗粒集合中不存在不同亚群，因此所有颗粒均可用于后续精细化。
    注：若观察到多峰密度函数，应选择对应于较高主峰的颗粒子集，仅使用这些颗粒继续后续流程。
  10. 再次打开并运行 xmipp3 - highres，将 Continue from a previous run? 设为 Yes，将 Full-size Images 设置为 8.5 步骤后获得的图像，并在 Select previous run 中选择上一次执行的 Xmipp Highres 运行结果。在 Angular assignment 选项卡中，将 Image alignment 设为 Local，迭代次数设为 1，目标分辨率为 2.6Å/px（全分辨率）。
  11. 此时输出应包含一个全分辨率的体积（尺寸为 300×300×300 像素）。点击 Analyze Results 再次检查获得的体积和 FSC，此时应获得分辨率达到约 3Å 的高分辨率体积（图10）。

9. 评估与后处理

  1. 打开 xmipp3 - local MonoRes28。该方法将计算局部分辨率。将 8.10 步骤中获得的结果设为 Input Volume，将 Would you like to use half volumes? 设置为 Yes，并将 Resolution Range 设置为 1 到 10Å。运行该程序。
  2. 点击 Analyze Results ，并选择 Show resolution histogram 和 Show colored slices（图 11）。此时将显示结构不同区域的分辨率。结构中心区域的大部分体素分辨率应在 3Å 左右，而最差的分辨率出现在外周区域。此外，还会显示每个体素的分辨率直方图，其峰值位于 3Å 附近（甚至低于 3Å）。
  3. 打开并运行 xmipp3 - localdeblur sharpening29 以进行图像锐化。将 8.10 步骤中获得的结果作为 Input Map，将上一步通过 MonoRes 获得的结果作为 Resolution Map。
  4. 点击 Analyze Results 以查看所得体积图。打开最后一个结果，即算法最后一次迭代的输出。建议使用其他工具（如 UCSF Chimera26）打开该体积图，以便更清晰地观察其三维特征（图 12）。
  5. 最后，打开 xmipp3 - validate overfitting30 中包含的验证工具，该工具将展示分辨率随粒子数量变化的情况。启动后，将 8.5 步骤中获得的粒子作为 Input particles，将 Calculate the noise bound for resolution? 设置为 Yes，并将 8.10 步骤的输出作为 Initial 3D reference volume。在 Advanced 选项中，将 Number of particles 设置为 "500 1000 1500 2000 3000 5000 10000 15000 20000"（补充图 20）。运行该程序。
  6. 点击 Analyze results。将出现两个图表（图 13），其中绿色线条表示随着用于重构的粒子数量增加，分辨率的变化趋势。红色线条表示对齐的高斯噪声重构所达到的分辨率。随着粒子数量增加，分辨率逐步提升，且由真实粒子重构的结果与噪声重构结果之间存在显著差异，这表明粒子中含有良好的结构信息。
  7. 根据上述结果，可对后处理后的体积图进行模型拟合，从而揭示大分子的生物学结构。

结果

我们使用了Plasmodium falciparum 80S核糖体的数据集（EMPIAR编号：10028，EMDB编号：2660）进行测试。采用上一节中介绍的Scipion流程，从显微镜采集的信息开始，该信息包含大量噪声严重的图像，这些图像中是样品在任意方向上的二维投影，最终在此特定示例中获得了该大分子的高分辨率三维重构体积。

完成整个实验流程后获得的主要结果如图10、图11、和 图12所示。图10展示了后处理前获得的三维重构体积。图10a中显示的傅里叶壳层相关（FSC）分辨率达到3 Å，接近奈奎斯特极限（当像素尺寸为1.34 Å时，奈奎斯特极限为2.6 Å）。图10b展示了重构三维体积的若干切片，具有丰富的细节和清晰定义的结构。在图11中展示了对所得三维体积进行局部分辨率分析后的结果。可以看出，结构中大部分体素的分辨率优于3 Å，尤其是位于结构中心区域的体素。然而，外围区域的分辨率较差，这与图10b切片中这些区域出现的模糊现象一致。图12展示了经过后处理后的相同三维图谱，该处理能够增强体积中的高频信息，揭示更多细节并改善结构的可视化效果，这一点在图12c的三维展示中尤为明显。

在图14中，使用Chimera26查看所获得体积的三维结构（图14a）、后处理后的结构（图14b）以及分辨率图（图14c），其中分辨率图根据局部分辨率的颜色编码进行着色。这可以提供关于所获结构的更详细信息。该工具对于了解所获体积的质量非常有用，因为可以在整个三维结构背景下观察到非常细微的细节。当达到足够分辨率时，甚至可以识别出结构中的某些生化组分（例如，图14d中的α-螺旋）。在该图中，应特别指出三维结构所有中心区域所达到的高分辨率，这些区域在图14c中表现为深蓝色区域。

所有上述结果的取得都依赖于整个实验流程的良好表现，但情况也可能并非如此。有多种方法可以识别出异常情况。在最普遍的情况下，当所获得的结构分辨率较低且无法进一步优化至更高分辨率时，即表明存在问题。这种情况的一个示例如图15所示。模糊的三维重构体积图（图15c）导致较低的傅里叶壳层相关系数（FSC），这一点可以从FSC曲线（图15a）以及局部分辨率估计的直方图（图15b）中观察到。该示例是使用一种三维精修方法生成的，但输入数据不正确，因为该方法期望输入的粒子集具备某些特定性质，而实际粒子集并未满足这些条件。由此可见，了解不同方法对输入数据的要求并正确准备数据始终至关重要。通常情况下，当获得如图15所示的输出结果时，可能意味着数据处理流程或原始数据本身存在问题。

在整个工作流程中存在多个检查点，可用于判断实验方案是否正常推进。例如，在颗粒挑选完成后，前述的多种方法可对颗粒进行排序，并为每个颗粒提供评分。如果存在质量较差的颗粒，这些方法能够识别并将其剔除。此外，二维分类结果也可作为判断颗粒集质量的重要指标。图16展示了一个质量较差颗粒集的示例。图16a显示了包含结构细节的优质分类结果，而图16b则展示了质量较差的分类结果，表现为图像噪声明显或颗粒未居中；在后一种情况下，可以看出颗粒挑选存在错误，两个颗粒似乎被合并为一个。另一个检查点是初始体积估计结果，图17展示了良好（图17a）与不良（图17b）初始估计的示例。该不良估计是由于方法参数设置不当所致。必须注意，所有参数设置都应谨慎进行，需根据所分析的数据合理选择每一项参数。如果最终未能获得包含最基本结构信息的三维图谱，则后续的精修步骤将无法得到高质量的重构结果。

当问题出在质量不佳的数据采集上时，例如电影序列未能保留结构信息，将无法从中提取出良好的颗粒，也无法获得成功的处理结果。在这种情况下，应采集更多的电影序列，以实现高分辨率的三维重构。然而，如果问题并非出在数据采集阶段，则可以在处理流程中通过多种方式应对各种问题。如果颗粒挑选效果不理想，可尝试多种方法进行修正，例如重新挑选、采用不同的挑选方法，或手动补充挑选更多颗粒，以帮助算法从这些颗粒中进行学习。在进行二维分类时，若仅有少数几类结果较好，也应考虑重新执行颗粒挑选过程。在初始体积估计阶段，若某些方法产生了不准确的结果，应尝试使用多种不同的方法进行验证。三维精修阶段同样适用这一原则。基于上述思路，本文介绍了一系列共识工具，这些工具在避免问题并确保后续处理使用准确数据方面具有重要价值。通过整合多种方法的共识结果，我们可以剔除那些难以挑选、分类或对齐的数据，而这些数据往往正是质量较差的体现。相反，若多种方法在输出结果上达成一致，则表明这些数据很可能包含有价值的信息，可继续用于后续处理。

我们鼓励读者下载更多数据集，并根据本文提供的建议尝试对其进行处理，同时创建类似的工作流程，利用 Scipion 结合多种处理软件包。尝试处理一个数据集是学习当前冷冻电镜（Cryo-EM）领域先进处理工具强大功能的最佳方式，有助于掌握克服处理过程中可能出现的各种问题的最佳策略，并提升现有方法在各个具体案例中的性能表现。

冷冻电镜数据处理流程；图像对齐图示；颗粒可视化结果。
图1．电影帧对齐结果。（a）结果的主窗口，列出了生成的所有显微图像及相关附加信息：功率谱密度、以极坐标表示的估计对齐轨迹、对应的直角坐标表示、生成的显微图像文件名。（b）以直角坐标系表示的对齐轨迹。（c）生成的显微图像。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜数据分析；以表格形式显示的CTF显微图像；聚焦测量、离焦角度、比值。
图 2．利用Ctffind结果进行CTF估计。 显示结果的主窗口包含一个估计的PSD图（位于角落），以及来自数据的实际PSD图和多个离焦参数。请点击此处查看该图的放大版本。

Xmipp 粒子挑选界面及结果；电子显微镜，粒子检测，图像分析。
图 3．使用 Xmipp 进行手动挑选的窗口界面。（a） 主窗口，包含待处理的显微图像列表及其他一些参数。（b） 在一幅显微图像的特定区域内手动挑选粒子。（c） 和 （d） 自动挑选出的粒子，需进行人工监督以生成用于 Xmipp 自动挑选方法的训练粒子集。请点击此处查看该图的放大版本。

粒子图像数据集、元数据、可视化、显微镜、数据分析、粒子识别。
图 4．使用 Xmipp 进行深度共识筛选的结果。 参数 zScoreDeepLearning 用于衡量粒子质量的优劣，是识别劣质粒子的关键。 (a) 最低的 zScore 值与伪影相关。 (b) 最高的 zScore 值与包含大分子的粒子相关。 请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜分类平均图像；蛋白质形状分析；显微镜数据；结构生物学研究。
图 5．Cryosparc 进行二维分类的结果。 展示了生成的类别（来自相同取向粒子子集的平均图像）。其中一些质量较好的类别以红色标出（具有一定程度的细节），而部分未被选中的低质量类别（噪声大且未居中）则未被选择。请点击此处查看该图的高清版本。

冷冻电镜重构过程；二维投影网格与三维密度图；结构分析。
图6．通过群体一致性方法获得的三维初始体积。 该三维初始体积是通过运行共识工具 xmipp3 - swarm consensus 得到的，所用输入为之前由 Xmipp 和 Relion 生成的三维初始体积估计结果。(a) 以切片形式展示的体积结构。(b) 体积的三维可视化图像。请点击此处查看该图的高清版本。

冷冻电镜流程：(a) FSC 曲线；(b) 角度分布；(c) 蛋白质结构的三维分类平均图。
图7．利用Relion结果对三维初始体积进行精修。(a) 获得的FSC曲线，其阈值交叉点约为4.5Å。(b) 以三维球体的上视图显示的角度覆盖范围。本例中由于无对称性，分配的颗粒应覆盖整个球面。(c) 以切片形式表示的精修后体积。请点击此处查看该图的放大版本。

显微镜实验中的角分布图与颗粒元数据分​​析结果
图8．基于深度学习与Xmipp的3D比对结果。由xmipp3-deep align方法生成的3D比对结果。(a) 以变换矩阵形式表示的每个颗粒的角分配。(b) 角度覆盖情况。请点击此处查看此图的放大版本。

颗粒分析；显微镜图像、数据图；xmipp_shiftDiff、angleDiff 数据的可视化。
图 9．三维对齐一致性结果。（a） 获得的平移和角度参数差异的颗粒列表。（b） 每个颗粒的角度差异图。（c） 每个颗粒的平移差异图。请点击此处查看该图的放大版本。

傅里叶壳层相关曲线与电子显微镜图像切片；图像重构分析。
图10．三维精修结果的最终迭代。（a） FSC曲线。（b） 全分辨率下获得的切片体积图像。请点击此处查看该图的放大版本。

冷冻电镜局部分辨率切片与直方图分析；分辨率，基于像素的数据比较。
图11．使用Xmipp进行局部分辨率分析的结果。 方法 xmipp3 - local MonoRes 的结果。(a) 一些代表性切片，根据每个体素的分辨率值进行着色，颜色编码如图所示。(b) 局部分辨率直方图。请点击此处查看该图的放大版本。

MRI图像处理，多层面视图（图a，图b），重建的三维模型（图c），分析。
图12. 使用 Xmipp 进行修整的结果。 结果 xmipp3 - 局部去模糊锐化 方法 (a) 每次迭代获得的体积列表 (b) 最后一次迭代后得到的三维体积，以切片形式表示。 (c) 最终体积的三维表示。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显示颗粒分辨率分析中过拟合现象的三维重建验证图
图13验证 Xmipp 结果中的过拟合工具。 实验结果 xmipp3 - 验证过拟合绿色线条对应于从数据重建的结果，红色线条对应于从噪声重建的结果。 (a) 粒子数对数与分辨率平方的倒数关系 （b） 分辨率与粒子数量的关系。 请点击此处以查看此图的放大版本。

蛋白质结构分析；示意图显示了研究中的电子密度和表面轮廓图。
图14．获得的体积数据的几种三维表示。（a）预处理后的体积数据。（b）后处理后的体积数据。（c）局部分辨率，深蓝色体素表示分辨率较高（2.75Å），深红色体素表示分辨率较低（10.05Å）。（d）后处理体积数据的放大图，可见α-螺旋（红色椭圆所示）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示FSC曲线、分辨率直方图和3D体积重建的冷冻电镜分析。
图15．不良3D重建示例。（a）FSC曲线出现急剧下降，并在低分辨率处跨越阈值。（b）局部分辨率直方图。（c）按切片显示的3D体积。请点击此处查看该图的放大版本。

延时成像序列；细胞生长分析；实验设置；显微镜图像。
图16．二维分类示例。（a）显示一定细节的优质分类。（b）包含噪声和伪迹的劣质分类（上半部分使用Xmipp获得，下半部分使用CryoSparc获得）。请点击此处查看该图的放大版本。

电子显微镜重建结果，用于结构分析的冷冻电镜断层图示意图。
图17．不同质量的三维初始体积示例。（a）良好的初始体积，可观察到大分子的形状。（b）较差的初始体积，所获得的形状与预期形状完全不同。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1. 创建Scipion项目。 Scipion显示的窗口，可在其中选择一个已有项目，或通过指定项目名称和存储位置创建一个新项目。 请点击此处下载该文件。

补充图2. 导入电影文件的方法。 打开pwem - 导入电影文件时，Scipion 显示的窗口。此处必须包含主要的采集参数，以便电影文件可在 Scipion 中进行后续处理。请点击此处下载该文件。

补充图3. 电影序列校准方法。 使用 xmipp3 - 光学校准 时 Scipion 显示的窗口。应填写输入的电影序列、用于校准的帧范围以及其他一些处理电影序列所需的参数。请点击此处下载该文件。

补充图4. 使用Ctffind进行CTF估计的方法。 在Scipion中的表单，包含运行程序Ctffind所需的所有必要字段。请点击此处下载该文件。

补充图5. Scipion中的向导功能。 该向导可帮助用户填写表单中的部分参数。本例中，此向导用于在grigoriefflab-ctffind方法中补充分辨率字段。请点击此处下载该文件。

补充图6. 使用Xmipp进行CTF精细优化的方法。 该图为xmipp3 - CTF估计的界面形式，包含对先前已估算的CTF进行精细优化所需的所有参数。请点击此处下载该文件。

补充图7. 预处理显微图像方法。 该表单为 xmipp3 - 预处理显微图像，可用于对图像执行若干操作。在此示例中，去除坏像素 和 对显微图像进行下采样 是常用的操作。请点击此处下载该文件。

补充图8. 使用Cryolo进行颗粒挑选的方法。 使用预训练网络运行Cryolo颗粒挑选方法的表单。请点击此处下载该文件。

补充图9. 使用Xmipp进行共识挑选的方法。 该方法基于深度学习，采用 xmipp3-deep consensus picking 形式，通过预训练网络对多种不同挑选方法获得的坐标集进行整合，以计算出坐标的共识结果。请点击此处下载该文件。

补充图10. 提取颗粒方法。输入 和 预处理 选项卡中的 xmipp3 - 提取颗粒。 请点击此处下载该文件。

补充图11. 使用Xmipp进行三维初始体积重建的方法。 该方法采用 xmipp3 -reconstruct significant 来获得初始的三维图谱。图中显示了 输入 和 判定标准 选项卡。请点击此处下载该文件。

补充图12. 调整体积大小方法。 用于裁剪或调整体积大小的表单。在此示例中，该方法用于在执行 xmipp3-reconstruct significant 后生成完整尺寸的体积。请点击此处下载该文件。

补充图13. 使用Relion方法获得的三维初始模型体积。 通过切片方式展示使用relion-3D初始模型方法获得的三维初始体积视图。请点击此处下载该文件。

补充图14. 使用Relion对初始体积进行优化。 该方法为 relion-3D 自动优化。在此示例中，该方法用于对共识分析后估算的初始体积进行优化。图中显示了输入和参考3D图谱选项卡。请点击此处下载该文件。

补充图15. 三维分类方法。 为 relion-3D分类 的形式。显示了 输入、参考三维图谱 和 优化 选项卡。请点击此处下载该文件。

补充图16. 基于深度学习方法的三维结构比对。 此处显示的是方法 xmipp3 - deep align 所打开的表单。该方法需要先使用训练集训练一个神经网络，然后该网络将对每个颗粒预测其角度分配。 请点击此处下载该文件。

补充图17. 三维精细结构重构方法。 采用 xmipp3-highres 方法。显示了 输入 和 角度分配 选项卡。请点击此处下载该文件。

补充图18. 三维精修结果的首次迭代。（a）FSC曲线。（b）获得的体积（尺寸小于全分辨率）以切片形式展示。请点击此处下载该文件。

补充图19. 三维精细校正相关性分析的首次迭代。 点击窗口上部粒子列表区域的条形图标后，将弹出一个新窗口。在绘图列窗口中，可生成所需估计参数的直方图。请点击此处下载该文件。

补充图20. 验证过拟合工具。 形式 xmipp3 - 验证过拟合 方法 请点击此处下载此文件。

讨论

目前，冷冻电镜（cryo-EM）是解析生物样品三维结构的关键工具。当显微镜采集到高质量数据时，现有的处理工具即可用于获得所研究大分子的三维重构。冷冻电镜数据处理能够达到近原子分辨率，这对于理解大分子的功能行为至关重要，同时在药物发现中也具有关键作用。

Scipion 是一款软件，能够以整合方式结合最相关的图像处理软件包，构建完整的流程，从而有助于整个图像处理流程的可追溯性和可重复性。Scipion 提供了一套非常完整的工具用于执行处理操作；然而，获得高分辨率重构结果完全取决于所获取数据的质量以及数据的处理方式。

要获得高分辨率的三维重构，首要条件是从显微镜获取高质量的电影数据，以在高分辨率下保留结构信息。如果无法满足这一条件，后续流程将无法从数据中提取出高分辨率信息。随后，一个成功的处理流程应能够准确提取出真实对应于目标结构的颗粒，并确定这些颗粒在三维空间中的取向。如果流程中的任何步骤失败，重构体积的质量将会下降。Scipion 允许在各个处理步骤中使用不同的软件包，有助于找到最适合数据处理的方法。此外，由于可选用的软件包众多，还可以使用共识工具，通过整合不同方法所得估计结果的一致性来提高准确性。同时，在代表性结果部分已详细讨论了多种验证工具，以及如何在流程的每一步识别准确与不准确的结果，以发现潜在问题并尝试解决。在整个实验方案中设有多个检查点，有助于判断流程是否正常运行，其中最关键的包括颗粒挑选、二维分类、初始体积估计和三维比对。检查输入数据、使用不同方法重复步骤或采用共识策略，都是 Scipion 提供给用户在遇到问题时可选择的解决方案。

在冷冻电镜领域，关于以往的软件包集成方法，Appion31 是唯一能够实现不同软件包真正集成的平台。然而，Appion 与 Leginon32（一种用于从电子显微镜自动采集图像的系统）紧密关联。Scipion 与 Appion 的主要区别在于，其数据模型与存储之间的耦合度更低。因此，在 Scipion 中创建新协议时，仅需开发一个 Python 脚本即可；而在 Appion 中，开发者不仅需要编写脚本，还必须修改底层数据库。总之，Scipion 的设计旨在简化系统的维护与扩展。

本文介绍了一套完整的冷冻电镜（Cryo-EM）处理工作流程，采用的是恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）80S核糖体的真实数据集（EMPIAR编号：10028，EMDB编号：2660）。文中涵盖并讨论的步骤包括：电影堆栈的图像校正、CTF估计、颗粒挑选、二维分类、初始三维图谱构建、三维分类、三维精修、结果评估以及后期处理。在多个步骤中使用了不同的软件包，并应用了共识性工具。最终获得的三维重构体积图分辨率达到3 Å，在经过后期处理的体积图中，可分辨出一些二级结构，如α-螺旋，有助于描述原子在空间中的排布方式。

本文所示的工作流程展示了如何以直接且集成的方式使用 Scipion 结合不同的冷冻电镜（Cryo-EM）软件包，从而简化数据处理过程，同时获得更可靠的结果。

未来，新方法和软件包的开发将持续增长，而像 Scipion 这样能够轻松整合所有工具的软件对研究人员而言将变得更加重要。当大量基于不同原理的方法可供使用时，共识性方法将变得更加重要，有助于在冷冻电镜三维重构过程中获得更准确的各类参数估计。研究过程中的追踪性和可重复性至关重要，而 Scipion 通过提供统一的完整工作流执行框架，使这两项目标更容易实现。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢以下机构提供的经费支持：西班牙科学与创新部通过以下项目资助：PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033 "马德里自治区" 通过以下项目资助：S2017/BMD-3817、Carlos III 健康研究所（Instituto de Salud Carlos III）、PT17/0009/0010（ISCIII-SGEFI/ERDF）、欧盟（European Union）以及“地平线2020”计划（Horizon 2020）资助项目：INSTRUCT - ULTRA（INFRADEV-03-2016-2017，提案编号：731005）、EOSC Life（INFRAEOSC-04-2018，提案编号：824087）、iNEXT - Discovery（提案编号：871037）和 HighResCells（ERC - 2018 - SyG，提案编号：810057）。产生这些成果的项目获得了以下 fellowship 的支持： "la Caixa" 基础基金会（ID 100010434）。博士后项目编号为 LCF/BQ/DI18/11660021。本项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 No. 713673 下的资金支持。作者感谢Instruct（欧洲科学基础设施路线图ESFRI标志性项目）提供的支持及其资源的使用。

材料

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