以最少样品和最大程度自动化模式进行基于核磁共振的片段筛选

摘要

基于核磁共振的片段筛选是一种快速鉴定小分子与生物大分子（DNA、RNA 或蛋白质）结合的有效方法。本视频介绍了基于自动化样品制备和核磁共振实验的实验方案 & 采集条件和分析流程进行了介绍。该技术可实现对两者的最佳利用 ¹H 和 ¹⁹用于检测的 F 核磁共振活性核。

摘要

基于片段的筛选（FBS）是学术界和工业界药物发现过程中一种经过充分验证且被广泛接受的方法。基于核磁共振（NMR）的片段筛选最大的优势在于，它不仅能够检测到跨越7至8个数量级亲和力的结合分子，还能监测片段的纯度和化学质量，从而获得高质量的阳性结果，并最大限度地减少假阳性或假阴性。在FBS中，一个必要的前提是需对片段库进行初始及定期的质量控制，以确定片段在相关缓冲液中的溶解度和化学完整性，并建立多个片段库以覆盖多样化的骨架结构，从而适应不同类型的生物大分子靶标（如蛋白质/RNA/DNA）。此外，还需针对样品用量、采集与分析速度，在生物分子构建体/片段空间、条件空间（缓冲液、添加剂、离子、pH值和温度）以及配体空间（配体类似物、配体浓度）等方面，对基于NMR的筛选方案进行系统优化。迄今为止，在学术界，这些筛选工作大多仍以手动方式进行，且规模极为有限，导致不仅在药物开发过程中，而且在化学探针开发背景下，可用的筛选基础设施都非常稀缺。为了以经济高效的方式满足上述需求，本文介绍了一系列先进的工作流程。这些流程利用最新的高端硬件设备，可将液体样品以自动化方式、在控温条件下装入NMR样品管中。¹H/¹⁹F NMR配体检测谱图随后在设定温度下采集。高通量样品更换器（HT样品更换器）可在控温样品架中同时处理超过500个样品。结合先进的软件工具，可显著加快数据的采集与分析速度。此外，本文还描述了该筛选流程在蛋白质和RNA样品中的应用，旨在为生物大分子研究领域的广大用户提供可参考的标准操作方案。

引言

基于片段的筛选现已成为一种常用方法，用于鉴定对蛋白质、DNA和RNA等大分子靶标具有弱结合能力的结构相对简单且分子量较低的分子（分子量 <250 Da）。初筛获得的阳性片段可作为基础，进一步对商业可得的更大结构类似物进行二次筛选，并采用基于化学的片段生长或连接策略。一个成功的基于片段的药物发现（FBDD）平台通常需要具备以下几个要素：一种可靠的生物物理方法用于检测和表征弱结合信号、一个片段库、一个生物大分子靶标以及后续化学优化策略。在药物发现项目中，常用的四种生物物理方法包括热迁移实验、表面等离子共振（SPR）、晶体学和核磁共振波谱法（NMR）。

核磁共振（NMR）波谱技术在基于片段的药物发现（FBDD）各个阶段中展现出多种作用。除了确保片段库中的片段在优化的缓冲体系中具有化学纯度和溶解性外，基于配体观测的NMR实验能够检测到片段与靶标之间低亲和力的结合，而基于靶标观测的NMR实验则可描绘出片段的结合表位，从而支持深入的构效关系研究。在表位定位过程中，基于NMR的化学位移变化不仅能够识别正构结合位点，还能发现可能隐匿且仅在生物大分子靶标的所谓“激发态”构象中才可接近的变构位点。如果生物大分子靶标已结合内源性配体，可通过基于NMR的竞争实验，轻松将所鉴定出的片段命中化合物归类为变构或正构调节剂。测定配体-靶标相互作用的解离常数（K_D）是FBDD过程中的重要环节。可通过基于NMR的化学位移滴定实验（无论是观测配体还是观测靶标）便捷地测定K_D。NMR的一大优势在于，相互作用研究在溶液中进行，且接近生理条件，因此可探测所有构象状态，用于分析配体/片段与其靶标之间的相互作用。此外，基于NMR的方法不仅限于对结构明确的可溶性蛋白进行筛选，还正被应用于更广泛的靶标类型，包括DNA、RNA、膜结合蛋白以及内在无序蛋白¹。

片段库是基于片段的药物发现（FBDD）过程中不可或缺的一部分。通常，片段作为初始前体，最终会成为针对特定生物靶点开发的新抑制剂的一部分（子结构）。已有多种药物（如Venetoclax²、Vemurafenib³、Erdafitinib⁴、Pexidartnib⁵）被报道最初来源于片段，目前已在临床中成功应用。通常，片段是低分子量（<250 Da）的有机分子，具有较高的水溶性和稳定性。一个精心设计、通常包含数百个片段的片段库，即可有效探索化学空间。片段库的总体组成随着发展不断演进，通常通过将已知药物拆解为更小的片段获得，或通过计算方法设计而成。这些多样化的片段库主要包含平面芳香环或杂原子，并遵循Lipinski五规则⁶ ，或当前商业上流行的三规则⁷ ，同时避免含有反应性基团。一些片段库还来源于高溶解性的代谢物、天然产物或其衍生物⁸。大多数片段库面临的一个普遍挑战是下游化学修饰的便利性。

位于法兰克福歌德大学的生物分子磁共振中心（BMRZ）是iNEXT-Discovery（用于转化研究的核磁共振、电子显微镜和X射线基础设施-发现项目）的合作伙伴，该项目是面向所有欧洲地区生物化学与生物医学研究领域研究人员的结构研究基础设施联盟。在2019年结束的前期iNEXT计划中，构建了一个包含768个片段的片段库，其设计目标为"最少数量的片段，最大程度的多样性"，以覆盖广泛的化学空间。此外，与其他任何片段库不同，iNEXT片段库还基于"预设片段"的概念进行设计，旨在简化后续合成复杂、高亲和力配体的过程，因此该库也被称为内部库（Diamond、结构基因组联盟及iNEXT）。

通过核磁共振（NMR）建立基于片段的药物发现（FBDD）需要人力、专业知识和仪器设备。在BMRZ，已开发出优化的工作流程，以提供针对NMR片段筛选的技术支持。这些流程包括片段库的质量控制与溶解度评估⁹、针对选定靶标优化缓冲条件、基于¹H或¹⁹F观测的一维配体筛选、用于区分正构与变构结合的竞争实验、基于二维的靶标观测NMR实验以进行表位作图，以及对初始片段命中化合物的二级衍生物集合进行相互作用表征。BMRZ已建立用于小分子-蛋白质相互作用分析的自动化流程，相关方法在以往文献中已有报道^10,11，并配备了基于NMR的片段筛选所需的全部自动化基础设施。该中心已实施饱和转移差谱NMR（STD-NMR）、通过梯度观测水-配体信号的NMR（waterLOGSY）以及基于Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG-based）的弛豫实验，以识别在广泛亲和力范围内结合的片段，并配备了用于药物发现的先进自动化NMR仪器与软件。尽管基于NMR的片段筛选在蛋白质研究中已较为成熟，但该方法在发现与RNA和DNA相互作用的新配体方面应用较少。BMRZ已建立新方案的概念验证，可用于识别小分子-RNA/DNA相互作用。本文后续部分将报告这些筛选流程在蛋白质和RNA样品中的应用，旨在为生物大分子研究领域的广大用户提供已建立的标准化操作方案参考。

方案

1. 片段文库

1. 内部片段库
   注意：在iNEXT的一项联合研究活动框架内，开发出了一种稳定且适用于下游化学反应的第一代片段库¹²，随后与Enamine合作构建了第二代片段库，称为DSI（Diamond-SGC-iNEXT）预置片段库（以下简称“内部库”）。该片段库可在BMRZ用于筛选目的。
   1. 采用先前报道的基于核磁共振（NMR）的方案⁹，评估片段库的完整性和溶解性。
      ​注意：该内部库包含768个片段，具有极高的化学多样性（>200个单例结构）。将片段以混合物形式进行筛选可显著加快筛选进程；然而，由于¹H-NMR谱图中信号重叠问题，每种混合物中包含的片段数量受到限制。该内部库较高的化学多样性使得可制备包含12种不同片段的混合物，且在¹H检测的NMR谱图中无明显化学位移重叠。
   2. 在768个片段中，有103个含有氟原子。为进行¹⁹F筛选，将这103个含氟片段根据¹⁹F化学位移最小重叠原则划分为5个混合组。为最大限度减少¹⁹F筛选中的信号重叠，应利用单个化合物测量所得的化学位移信息，设计包含最多片段数且信号重叠最小的混合物。每个混合组包含20–21个具有不同¹⁹F化学位移的片段，从而实现对片段的明确归属。
2. 用户自定义或提供的片段库
   1. 使用用户自定义或提供的片段库开展筛选实验；但在开始筛选前需完成以下步骤。
   2. 若用户未事先说明，需对片段进行基于NMR的质量控制（在BMRZ使用先进的软件工具完成此项工作；⁹，第6.1.1章）。
   3. 在使用前，检测片段在目标生物大分子所用缓冲液中的溶解性、结构完整性及浓度。
   4. 设计混合物时应尽量减少NMR谱图中的信号重叠并缩短测量时间。
   5. 按照步骤4.2的方法设计混合物。
   6. 可选择对单个片段或部分混合物进行筛选，而非对整个片段库进行全面筛选。

2. 样品制备

注意：核磁共振（NMR）高通量筛选采用移液机器人进行样品制备。NMR 谱图以及蛋白质、RNA 和 DNA 在数天信号采集过程中的稳定性对温度波动极为敏感，因此温度控制的自动化系统将极大提高被移液样品的稳定性。为此，将一个可在 4 至 40 °C 范围内工作的附加装置连接至移液机器人，以便在温度受控的环境中进行 NMR 样品的液体处理。

1. 配体混合物的制备
   1. 使用样品制备机器人准备用于核磁共振（NMR）检测的筛选样品。该机器人的灵活配置可支持多种应用（例如，将样品从NMR管回收至储存容器，或执行常规液体处理操作）。可使用不同直径的NMR管（1.7、2.0、2.5、3.0和5.0 mm）。样品机器人系统结合先进的控制软件，可读取为每种容器类型分配的条形码，并最优地执行液体填充程序。
   2. 在制备内部文库配体混合物时，使用带条形码的小瓶。带条形码的小瓶可确保样品的最高可靠性与最佳可追溯性。
   3. 将768种化合物分配至8块96孔板中。每种片段的储备浓度为50 mM，溶剂为d₆-DMSO/D₂O（9:1）。共制备64种混合物，每种混合物包含12种片段，每种片段在混合物中的终浓度为4.2 mM。
      注意：移液机器人可兼容多种几何形状不同的容器类型（如冷冻管或自动进样小瓶、96孔圆底或方底深孔板、带条形码的标准小瓶、微量离心管），并可高效地将液体转移至多种NMR管和试管架中。

图1：（A）安装在BMRZ的高通量核磁共振（NMR）样品制备及NMR管填充机器人。（B）安装在BMRZ设施600 MHz谱仪上的高通量样品转换器，配备独立温控样品架。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 制备筛选样品空白对照（参考配体谱）及含靶标的样品（配体在靶标存在下的谱）
   1. 在制备核磁共振（NMR）筛选样品时，若存在靶向生物分子（蛋白质/RNA/DNA）和配体混合物，应使用布鲁克（Bruker）NMR标准样品管系列中选定的3 mm NMR高通量样品更换管。
   2. 将生物大分子靶标（例如：¹H筛选：10 µM RNA或蛋白质）溶于特定筛选缓冲液中，手动或使用移液机器人将其转移至3 mm NMR样品管中（终体积为200 µL）。
   3. 下一步使用机器人系统将10 µL（例如：¹H筛选）配体混合物加入含有靶向生物大分子的条形码标记3 mm NMR管中，并通过控制软件内置程序进行混匀。
      ​注意：NMR管的条形码编号可方便且自动地整合到所采集的NMR数据集中，从而确保基于编号的工作流程无误。移液机器人的温控附件可使制备好的样品在NMR管中保持恒定温度。
3. 实验室自定义条件与参数
   1. 建立针对实验室内部片段库筛选RNA和蛋白质的最佳缓冲条件。BMRZ实验室中RNA所用的样品条件如下：25 mM KPi、50 mM KCl、pH 6.2。Mg²⁺为可选添加。
   2. 蛋白质对溶液条件极为敏感；应使用最适合目标蛋白的缓冲体系。对于每种缓冲液，需额外采集配体的参考谱图，作为后续分析的空白对照。
4. 用户指定条件
   注意：当实验室内部建立的条件不适用于潜在用户待筛选的靶标时，应实施以下步骤。
   1. 单独对缓冲液进行¹H-NMR检测，以确保缓冲液组分在配体观测型筛选实验的实施与分析过程中产生最小干扰。如有干扰组分，可适当替换为氘代对应物。
5. 样品制备（靶标数量）、条件及可用性的限制
   注意：在某些情况下，特定生物大分子的分离或重组表达可能具有挑战性，导致可用于成功开展药物筛选研究的靶标量有限。在靶标供应有限或充足的情况下，可采用以下替代策略以成功实施基于NMR的片段筛选。
   1. 若靶标有限，采用基于¹⁹F-NMR的筛选方法。典型的氟化配体仅有一个¹⁹F信号，因此可使用包含25–30个片段的混合物，避免信号重叠。待分析信号更少，缓冲液组分无信号干扰，且依赖的信号数量较少，有利于命中化合物的识别。
   2. 若靶标充足，可采用更大规模的¹H-NMR筛选。此时可对更大规模的片段库进行筛选。通常片段含有多个质子，意味着可用于分析的信号更多。

3. NMR 采集条件

1. 实验室自定义培养条件
   1. 配备HT自动进样器（自动化）的光谱仪
      1. 对于高通量筛选，使用仅可通过高通量样品进样器进行测量的96孔板。高通量样品进样器还支持对每个样品架进行独立控温。
      2. 为获得最佳信噪比，应使用配备氦气或氮气冷却的低温探头的光谱仪。自动化调谐与匹配模块（ATM）是实现自动化的必要组件。
   2. 参数集 & 脉冲序列
      注意：许多核磁共振（NMR）实验可用于表征结合事件，命中识别结果因实验设置不同而有所差异。以下实验通常用于BMRZ筛选项目中。然而，用户自定义的筛选项目可根据用户的具体要求进行相应调整。
      1. 如果使用 TopSpin 软件，请加载适用于基于配体实验的参数集：SCREEN_STD、SCREEN_T1R、SCREEN_T2、SCREEN_WLOGSY。该参数集包含所有必需参数及脉冲序列：STD：stddiffesgp.3；T_1ρt1rho_esgp2d；T₂：cpmg_esgp2d；以及水抑制配体观测实验（waterLOGSY）：ephogsygpno.2。
      2. 对于所有列出的实验，使用激发 sculpting 方法¹³ 作为水峰抑制。参考方法：采用1D激发塑形序列（zgesgp）。扫描次数取决于系统的灵敏度（磁场强度和探头类型）、样品浓度以及实验选择。建议参数：1D实验，扫描次数NS=64，T_1ρ & T₂ NS=128 的 STD，NS=256 的 STD，以及 NS=384 或 512 的 waterLOGSY。
      3. 对于 ¹⁹F 筛选，同时使用 1D 和 T₂ 实验：一维：F19CPD（脉冲程序=zgig）用于 ¹⁹F{¹H}-探头和 F19(pp=zg) 用于 ¹⁹F/¹H-探头头部；SCREEN_19F_T2（pp = cpmgigsp）
      4. 使用220 ppm的谱宽，激发频率设为-140 ppm。实验时间根据硬件条件和样品浓度在1至5小时之间（需确保生物大分子的长期稳定性）。对于T₂CPMG 时间应在 0 毫秒和 200 毫秒之间交替变化。
   3. 处理
      1. 记录 STD，T_1ρ 和 T₂ 将实验作为伪二维处理。对于两个单独的一维谱图，IconNMR 使用 au 程序 proc_std 进行处理，可选择是否添加 relax 选项。第一种选项生成参考一维谱图及两谱图的差谱。第二种选项生成具有短弛豫时间和长弛豫时间的两个独立谱图。waterLOGSY 是一种单次一维实验，其相位应调整为溶剂信号呈负峰。
2. 用户特定条件
   1. 根据用户自定义条件调整前述任意参数。例如，若用户提供的蛋白质在通常使用的温度下不稳定，可开展优化实验，改变温度、浓度、缓冲条件等。

4. 数据分析

1. 片段库质量控制（d6-DMSO/特定缓冲液）与定量
   1. CMC-q
      注意：在启动筛选项目之前，对片段库进行质量控制至关重要。此外，为了确保片段库在多次筛选项目中的长期稳定性，必须定期评估其质量。为此，使用 TopSpin 中的集成软件 CMC-q 和 CMC-a 进行质量和数量评估。CMC-q 和 CMC-a 是 TopSpin 内的软件模块，可实现平滑的数据采集与分析，包括利用小分子有机化合物的 ¹H-NMR 谱图进行结构验证⁹。
      1. 为评估完整性，制备浓度为 1 mM 的片段样品，溶剂为 d6-DMSO。使用移液机器人以自动化方式将液体样品加入 3 mm NMR 样品管中。
      2. 为评估溶解性，使用含 1 mM 化合物的样品，溶剂为 pH 7.4 的 50 mM 磷酸钠缓冲液，含 150 mM 氯化钠、90% H₂O / 10% D₂O，以及 1 mM 的 3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4 钠盐（TMSP-Na）。
      3. 使用配备三共振 5 mm TCI 低温探头和高通量样品更换器的 600 MHz NMR 谱仪，在 298 K 或 293 K 下采集 NMR 谱图，该样品更换器可同时处理 579 个样品。
      4. 设置 CMC-q 软件时，请遵循用户手册中的说明，包括创建 IconNMR 用户、激活 FastLaneNMR 以及配置高通量样品更换器。
      5. 校准 90° 脉冲，并将其保存至 TopSpin 的 prosol 表中。
      6. 将 96 孔板放置于高通量样品更换器的 5 个架位之一中。
      7. 为加载包含建议化学结构、唯一标识符及每批样品在高通量样品更换器中位置信息的 SDF 文件（结构数据文件），请在 CMC-q 设置窗口中点击 浏览，选择以 .sdf 结尾的文件后点击 打开。
      8. 在 CMC.q 批处理自动化设置中，设定验证类型（定义将要测量的实验）、IconNMR 用户，并定义溶剂。
      9. 为 SDF 文件路径、分子 ID 和样品位置定义相应的 SDF 文件。
      10. 点击 开始 启动采集，再次点击 开始采集。也可通过点击 保存 保存 CMC-q 设置。
      11. 有关 CMC-q 设置步骤的详细说明，请参考布鲁克（Bruker）提供的用户手册。
   2. CMC-a
      1. 对于 CMC-a，使用 TopSpin 中的软件模块，该模块支持利用小分子有机化合物的 1H-NMR 谱图进行分析，包括结构验证⁹。
2. 混合物设计
   注意：在使用 NMR 作为筛选平台时，合理的混合物设计至关重要。每组混合物中包含的片段数量越多，筛选速度越快，但假阳性与假阴性的风险也随之增加；而片段数量较少则降低该风险，但延长了整体筛选时间。通常，在设计混合物时应避免信号重叠。使用本实验室自建库时，对于 ¹H 筛选可忽略此问题，因为该库在设计时已特别注重多样性，并确保信号重叠极少，同时保持高化学多样性。因此，无需采用特殊设计流程即可直接构建 64 组混合物。
   1. 由于 ¹⁹F 筛选依赖于自建库中含氟片段，而该库并未针对这些特定片段优化以减少信号重叠，因此需进行合理的混合物设计。
   2. 对所有含 ¹⁹F 的片段单独测量其化合物谱图。
   3. 记录每个信号的化学位移信息。
   4. 根据上述信息，每组混合物选择 20–21 个片段，共形成 5 组混合物，每组包含 20–21 个无信号重叠的片段，从而实现数据的半自动化分析。
3. 在配体观测的生物大分子-配体相互作用中进行命中识别
   注意：¹⁹F 与 ¹H 筛选流程中对“命中”的定义有所不同。以下命中识别标准由我们设定，并遵循特定规则。命中判定具有较强的主观性，可能因使用者而异。然而，一旦确定命中识别规则，必须保持不变，以确保结果的可验证性与可信度。
   1. ¹H 筛选
      1. 为可靠地确定命中，需在有无靶标存在的情况下，分别采集 1D ¹H 谱图、waterLOGSY 和 T₂ 弛豫实验数据，以识别结合子。这三个实验均有可能显示结合事件。若样品谱图相对于空白谱图出现大于 6 Hz 的化学位移（CSP），则视为潜在命中的指示。同样，若 waterLOGSY 中出现强正信号，或样品谱图中 T₂ 值减少超过 30%，也视为命中迹象。通过比较含样品谱图与其对应空白谱图，可在三个实验中展示结合事件。但结合事件不一定在所有三个实验中均可见。因此，我们约定：只有至少两个前述事件同时出现时，才将该片段归类为结合命中。
      2. 使用 TopSpin 中的 FBS 工具，将片段状态分类为：结合、模糊、未知、聚集态和非结合。
      3. 完成一组混合物分析后，在 FBS 工具中予以确认。
      4. 在 FBS 项目中的摘要标签页中，点击 创建筛选报告，将弹出一个窗口用于生成 .xlsx 文件。用户可选择在电子表格中报告全部配体、仅结合配体、仅非结合配体或仅模糊配体。
   2. ¹⁹F 筛选
      1. 为区分非结合子、弱结合子和强结合子，采用以下方法：将 200 ms 靶标测量值与 200 ms 空白测量值的积分比值，除以 0 ms 靶标测量值与 0 ms 空白测量值的积分比值：
         
         注意：该计算得到的值范围为 0 至约 1（即“命中评分”），从而可为每种结合状态设定阈值。
      2. 以参考 200 ms 测量值的平均值作为基线阈值，用于标记命中评分超过 1 的情况。当导入的积分值为负，或参考测量值高于靶标测量值时，可能出现此情况。命中评分 ≤ 0.67 视为弱命中，< 0.33 视为强命中，而 > 0.67 则视为无命中。示例见 图 2。

图 2：通过 ¹⁹F 筛选鉴定阳性化合物。 代表性化合物的 ¹⁹F CPMG 核磁共振谱图片段。该图示说明了结合剂的特性。在有 RNA 和无 RNA 的混合样品中测得的化合物的 ¹⁹F-CPMG 核磁共振谱图。图中数值表示相应峰的归一化积分值。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 数据分析
   1. 准备数据分析
      注意：采集的数据不应有明显缺陷。这意味着匀场效果不佳或水峰抑制不充分的数据不应纳入分析。建议重新采集数据，并确保样品（例如，无气泡）、温度、匀场和水峰抑制等条件均正常。可通过比较DMSO信号始终评估数据的正确性。
   2. ¹H筛选
      1. 为分析¹H筛选数据，请在TopSpin 4.0.9中使用FBS工具（需额外许可证）。
      2. 按照FBS工具手册中的说明开始数据分析。以下步骤总结了手册中报告的流程。
      3. 存储来自筛选实验的BMRZ NMR数据时，应为每种不同的筛选混合物建立独立的目录，每个目录下再包含用于存放该样品不同实验的子目录。
      4. 使用FBS工具时，需存储参考谱图，即包含所有不含生物大分子靶标但含有混合物以及单个化合物的样品所采集的数据，这些数据应分别保存在不同的/nmr目录中。这一点很重要，因为FBS工具会分别要求提供每个目录的路径。
         注意：若某一目录中存储了以下数据集（csv文件、FragmentScreen XML文档和BAK文件），则FBS工具会将其识别为一个筛选项目。
      5. 使用TopSpin 4.0.9时，创建指向包含采集数据目录的直接路径，即所谓的DIR。选择所有混合物各自拥有独立子目录的/nmr目录。
      6. 要启动已筛选样品的FBS工具，将FBS项目符号拖动到TopSpin窗口中央。若前述数据集已复制到该目录中，则FBS项目符号应出现在所选目录中。
      7. 首次加载新的FBS项目时，应自动弹出Fragment Based Screening Options窗口。在此窗口中选择一个鸡尾酒文件（cocktail file）。该文件为csv格式，包含混合物名称、各片段名称及其在混合物中的分配信息。同时定义一个参考配体谱图文件夹，其中包含所有单一片段测得的谱图。最后，定义一个参考空白实验文件夹，通常为不含被研究靶标的混合物数据集所在文件夹。
      8. “Fragment Based Screening Options”窗口中有一个名为谱图类型（Spectra types）的标签页，可用于定义待分析的谱图类型及谱图显示颜色。根据先前处理的数据设置Spectype。在显示布局（Display layout）标签页中，定义将根据其Spectype进行相互比较的谱图。
      9. 点击确定以启动FBS项目。
      10. 查看数据时，将打开一个独立窗口，以表格形式汇总所有鸡尾酒混合物及每种混合物中的所有配体。双击某个单元格后，相应的数据集将被打开，例如将¹H 1D空白谱图与含靶标的谱图进行比较。
      11. 在判定结合物之前，确保所有测量中的参考峰（DMSO峰以及单个化合物峰）相互匹配且化学位移一致。若发现差异，可通过TopSpin的批量处理功能进行校正。
      12. 批量处理功能位于处理（Process）标签下的高级（Advanced）选项中。该功能可对所选数据集中的所有谱图应用统一修改。通过此方式，可轻松将Spectype分配给实验编号，并一次性调整所有谱图以与参考谱图对齐。
   3. ¹⁹F筛选
      1. 对¹⁹F混合物进行初步分析时，需为每种混合物创建一个积分文件。为定义积分区域，请点击分析（Analyse）标签中的积分（Integrate）功能。确保为混合物中的每个片段明确定义其对应的¹⁹F单峰的积分区域。
      2. 使用保存/导出积分区域（Save/Export integration regions）按钮导出积分文件以供后续使用。将所有使用的积分文件保存至C:\Bruker\TopSpin4.0.9\exp\stan\nmr\lists\intrng，或TopSpin安装目录的相应路径中。
      3. 对于¹⁹F数据，打开一个包含或不包含被研究靶标的原始数据集。
      4. 要将积分文件载入当前谱图，请再次打开分析（Analyse）标签，进入积分（Integrate）功能，然后使用读取/导入积分区域（Read/Import integration regions）按钮加载相应的积分文件。这会将该文件中定义的所有区域载入当前谱图。
      5. 保存并返回，在积分（Integrals）标签中可找到所有已积分区域的列表。将其复制到电子表格或其他用于进一步数据分析的工具中。
      6. 对每种混合物（含靶标和不含靶标）重复上述步骤。
   4. 数据管理
      1. 为便于使用并提高工作效率，应为采集数据的后续分析与存储建立统一的工作流程。对于¹H和¹⁹F筛选，分别使用专门设计的电子表格。
         注意：对于¹H筛选，该电子表格仅用于数据管理和汇总各靶标信息；而对于¹⁹F筛选，则利用第4.3节所述的比值，在积分数据复制入表格后自动将每个片段标记为“命中”或“未命中”。只要文件设置正确，这种方法可降低分析过程中人为错误的风险，并便于信息共享，因为所有关键信息都集中在一个文件中，几乎任何人都可直接打开查看，无需其他程序即可初步评估数据。

结果

片段文库的质量控制
内部片段文库中的片段以50 mM的储备液形式提供，溶剂为90% d6-DMSO和10% D₂O（其中10%的D₂O可有效减少因反复冻融循环导致的化合物降解¹⁴）。单个化合物样品由1 mM配体溶于50 mM磷酸盐缓冲液（25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mM MgCl₂）中制备，pH 6.0，溶剂组成为90% H₂O/9% D₂O/1% d6-DMSO。¹H-NMR实验在500/600 MHz NMR波谱仪上对iNEXT文库中的片段进行检测。该数据进一步用于结合CMC-q软件开展¹H筛选实验时的单个化合物鉴定；同时利用分析插件CMC-a评估各片段的质量（包括溶解性和完整性）。CMC-a自动化分析的结果以图形化方式输出，示例如图3所示。图形输出呈现一个96孔板的布局，红色圆圈表示该孔中的片段在结构或浓度上存在不一致；绿色孔位则表示片段状态一致。

图3：片段库的质量控制。 基于CMC-a的自动化输出示意图。评估片段的各项性质，如浓度和结构完整性。绿色表示一致，橙色在此表示不一致。对于不一致的片段，需按照所示工作流程进行人工修正。 请点击此处查看该图的放大版本。

在DMSO和缓冲液中，约65%和35%的片段分别被分类为一致性和不一致性。此外，经过对谱图的仔细人工检查后，30%原本被分类为不一致的配体变为一致⁹。

¹⁹F 混合物设计
从内部化合物库中选取的103个含一个或多个氟基团的片段被分为5个混合物（A、B、C、D、E），每个混合物包含20至21个片段。在此情况下，必须谨慎设计混合物以避免信号重叠。¹⁹F横向弛豫实验针对每种混合物进行测定，并应用了CPMG脉冲序列。通过调整弛豫延迟时间，可对这些实验进行优化。混合物A-E的¹⁹F化学位移如图4所示。

图 4：来自内部文库的混合样品的¹⁹F 1D-NMR 谱图。 请点击此处查看此图的放大版本。

样品制备
¹⁹F 筛选实验中的样品制备可通过手动操作或使用移液机器人进行自动化移液完成。每种混合物中的片段浓度为 2.5 mM，溶剂为 90% d6-DMSO 和 10% D₂O。筛选样品的最终体积为 170 µL，其中含有 5% D₂O 作为锁场试剂。每种混合物分别移取两份：一份加入含缓冲液但不含靶标的溶液中，另一份加入含靶标的缓冲溶液中。靶标与片段的比例设定为 1:1，从而使最终的靶标/配体浓度为 50 µM。此外，还需设置对照样品：一份为在筛选缓冲液中仅含靶标生物分子而不含混合物的样品，用于确保靶标完整性；另一份仅为缓冲液和 D₂O 的样品，用于确保缓冲液质量。

RNA 样品在缓冲液中的 ¹⁹F-1D 和 ¹⁹F-CPMG-T₂ 核磁共振筛选数据的测量方法如 3.1 节所述。例如，针对单一靶标样品，采用跳返回波序列（pp = zggpjrse,¹⁵）进行检测。

数据分析
¹⁹F 筛选方法已应用于大肠杆菌（E. coli）的 TPP 核糖开关 thiM 以及结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的蛋白酪氨酸激酶（PtkA），以及其他多个靶标¹⁶。该 ¹⁹F 筛选片段库包含 103 个片段，分为从 Mix A 到 Mix E 的 5 个混合物。筛选样品的制备可手动完成，无需使用自动移液机器人。将 40 µM 的 thiM RNA 溶液（缓冲条件）与 3.2 µL 的各混合物混合。此外还制备了对照样品，包括仅含缓冲液的样品、含 5% DMSO 的缓冲液（此前已确认目标 DMSO 浓度下生物大分子的稳定性），以及含 RNA 的缓冲液。共制备 13 个筛选样品，并转移至 3 mm NMR 管中。扫描 NMR 管的条形码，并按照前述在 298 K 下进行的 ¹⁹F NMR 实验方案，分别测量各混合物在有 RNA 和无 RNA 条件下的信号，以及对照样品。对 thiM RNA 与本实验室片段库的筛选，通过针对每个不同样品进行 CPMG 延迟时间为 0 ms 和 200 ms 的 T₂ 测量来完成。测量结束后，通过比较所有样品额外测得的 ¹H 一维实验中 DMSO 峰的展宽程度和强度损失，监测适当的匀场效果和水峰抑制情况。所获得的 CPMG T₂ ¹⁹F 弛豫谱数据分别使用 TopSpin 中预先编写并自动化的宏程序进行处理。数据分析按照本方案部分的说明进行。通过 TopSpin 获得的积分数据（依照方案中的说明）可利用预先制作的电子表格或任何类似软件，在设定正确条件和阈值后快速简便地进行评估。如前所述，设定阈值有助于界定强结合物、弱结合物或非结合物。图 5 分别展示了 thiM RNA 和 PtkA 的典型 CPMG 谱图结果。在某些情况下，还需进一步由专家进行审阅。

图5：基于CPMG实验中不同延迟时间获得的¹⁹F CPMG核磁共振谱图片段，显示信号强度变化。 （A）在大肠杆菌（E. coli）thiM核糖开关RNA上进行的¹⁹F片段筛选实验中，结合物（阳性结果）与非结合物的图示。（B）在结核分枝杆菌（M. tuberculosis）PtkA蛋白上进行的¹⁹F片段筛选实验中，结合物与非结合物的图示。请点击此处查看该图的高清版本。

¹H 筛选

混合物设计
所使用的内部化合物库具有高度多样性，因此在进行¹H筛选时未进行特定的混合物设计。这意味着通过随机选择12个化合物组成一组混合物，共制备了64组混合物。

样品制备
针对一种典型的 SARS-CoV-2 RNA 进行 ¹H 筛选时，采用移液机器人进行自动化移液以制备样品。每种混合物中的片段浓度为 4.2 mM，溶剂为 90% d6-DMSO 和 10% D₂O。筛选样品的终体积为 200 µL，其中含有 5% D₂O 作为锁场试剂。共制备 64 个不含靶标 RNA 的样品，每个样品含有在 25 mM KPi、50 mM KCl（pH 6.2）中不同的混合物。相应地，另制备 64 个含有靶标 RNA 的样品，每个样品也含有不同的混合物。RNA 与配体的比例设定为 1:20，使得 RNA 浓度为 10 µM，配体浓度为 200 µM。

数据分析
对于¹H分析，使用TopSpin中的FBS工具。为确定某个片段是否为阳性信号，需进行一维化学位移、waterLOGSY和T₂弛豫实验。在T₂弛豫实验中，信号强度降低超过30%即判定为阳性；在化学位移实验中，位移超过6 Hz为判定阈值。waterLOGSY实验必须显示显著的信号变化（本例中为从负信号变为正信号）。若上述三项标准中有任意两项为阳性，则该片段被判定为阳性信号。两个示例见图6。

图6：对一种典型的SARS-CoV-2 RNA进行的¹H筛选，展示命中化合物的判定标准。通过三种不同实验（¹H T₂ CPMG（5/100 ms）、waterLOGSY 和 1D ¹H）获得的数据。请点击此处查看此图的放大版本。

Hit-1 的 T₂ 下降约 50%，且化学位移扰动（CSP）≥ 6 Hz。waterLOGSY 实验的信号变化不够显著，因此不计为阳性。由于三项实验中有两项为阳性，该片段被计为一个阳性片段。对于 Hit-2，T₂ 信号强度下降约 80%，且 waterLOGSY 可观察到明显的信号变化。尽管该情况下 CSP 未达到显著水平，但由于前两项标准均为阳性，仍被计为一个阳性片段。

讨论

基于核磁共振的片段/药物筛选的多功能性 BMRZ已成功实施了先进的自动化核磁共振（NMR）仪器，以及饱和转移差（STD-NMR）、水配体观测通过交换转移（waterLOGSY）和弛豫实验，用于在广泛的亲和力范围内识别药物发现中的片段。所安装的硬件包括高通量样品制备机器人、高通量样品存储系统、样品更换装置及数据采集单元，均与一台600 MHz谱仪相连。最近购置的低温探头用于 ¹H, ¹⁹F, ¹³C 和 ¹⁵N 确保了所提出测量所需的灵敏度，并允许 ¹H (1) 去耦期间 ¹⁹F检测。该探头连接至最新一代的NMR控制台，可使用布鲁克（Bruker）提供的先进软件工具，包括CMC-q、CMC-assist、CMC-se和FBS（包含在TopSpin中）。基于片段的筛选（fragment-based screening, FBS）工具已集成于最新版TopSpin软件中，有助于分析高通量数据，包括STD、水LOGSY、T₂/_1r-弛豫实验。通过使用样品填充机器人，可自动将液体一维¹H样品装入核磁共振管中。. 通常，一个96管（3 mm）的样品块可在约两小时内完成填充。96孔板架可直接放置于高通量样品转换器中，样品转换器读取样品块上的条形码，并通过自动化软件将核磁共振（NMR）样品管分配至相应的实验中IconNMR)可将五个96孔板架存放在HT样品更换器中并进行编程 同时，每个独立样品架的温度均可单独控制和调节。此外，每个样品在测量前均可进行预处理（包括预热和管路干燥以去除冷凝湿气），使其达到所需的温度。

适用于多种应用领域。 这种基于自动化核磁共振（NMR）筛选的广泛应用之一是识别和开发与生物大分子靶标（DNA/RNA/蛋白质）结合的新型配体。这些配体可包括通常以非共价方式结合的正构或变构抑制剂。此外，基于NMR的片段筛选（FBDD）通常用作选择有前景化合物的第一步，其实现所需满足的条件是能够获得足量的生物分子靶标。该目标可分为两个主要任务。

任务一：构建并表征内部片段库，原因如下：对1000多个片段进行初始和定期的质量控制、表征与定量；测定片段在针对每个靶标（特别是蛋白质靶标）优化的缓冲液中的溶解度；建立多个片段库以容纳多样化的骨架结构，并扩展至其他大分子类别。任务二：通过核磁共振（NMR）整合基于片段的药物设计（FBDD）工作流程，包括：自动化的1D配体观测筛选（¹H 和 ¹⁹F 观测）；自动化的置换实验（与（天然）配体进行竞争实验），以区分正构和变构结合；多个片段的自动化二级筛选；自动化2D蛋白质筛选；利用EU-OPENSCREEN库或其他任何片段库，对初始命中化合物的系列衍生物进行二级筛选；以及使用FDA库对选定靶标进行重新筛选。

此外，可对多种细胞系（与疾病相关）进行代谢表型分析，以揭示细胞周期调控与代谢之间关联的调控机制。同时，还可对RNA/DNA/蛋白质的调控元件进行功能表征。 体内 和 体外 用于优化构建体/结构域（针对结构研究的稳定性优化（缓冲液、pH、温度和盐筛选）），以及将基于核磁共振的片段筛选技术拓展至膜蛋白和内在无序蛋白，这些蛋白通常难以通过其他技术手段进行研究。

局限性。¹⁹F 和 ¹H 片段库的使用各有优缺点，以下将提及其中几点。¹⁹F 相较于 ¹H 检测的最大优势在于实际检测时间以及后续分析的速度更快，因为混合物中包含的片段数量几乎多出一倍，所需进行的实验次数也更少。后续分析对于 ¹⁹F 筛选而言也更为简便，由于不存在缓冲液的干扰，且在片段混合物设计优化的情况下，¹⁹F 具有更宽的化学位移范围，几乎不会出现信号重叠。谱图本身也大大简化，通常每个片段仅有一个或两个信号，具体取决于氟原子的数量。因此，这些谱图的分析可以实现自动化，从而进一步节省时间。但代价是化学多样性较低，至少在本研究所使用的片段库中如此。由于该库中仅约 13% 的片段含有 ¹⁹F，而所有片段天然均可用于 ¹H 筛选，因此 ¹⁹F 筛选所用片段的多样性较低。这一问题可通过使用专门设计的、包含更多片段且化学多样性更广的 ¹⁹F 片段库来克服。¹⁹F 筛选的另一个缺点是每个片段产生的信号数量较少。通常情况下，片段包含的氢原子不止一个，因此基于 ¹H 检测的筛选实验可利用同一片段的多个不同信号来确认结合事件，从而在识别阳性结果时具有更高的置信度；而 ¹⁹F 筛选则只能依赖每个片段提供的一个或两个信号。

本文详细介绍了基于现代自动化核磁共振（NMR）的片段筛选仪器、软件、分析方法及相关实验方案。所配备的硬件包括高通量样品制备机器人，以及与600 MHz谱仪相连的高通量样品存储、样品更换和数据采集单元。近期安装的低温探头支持¹H、¹⁹F、¹³C和¹⁵N检测，确保了所需检测灵敏度，并可在¹⁹F检测期间实现¹H去耦。此外，最新一代NMR控制台支持使用先进的分析软件，辅助数据采集和实时分析。上述技术、工作流程及所描述的实验方案，将有助于采用NMR进行片段筛选（FBS）的研究人员取得显著成果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bruker Avance III HD		Bruker	600 MHz 核磁共振波谱仪
Matrix Clear 聚丙烯 2D 条形码开口顶部储存管	3731-11 0.75ML V型底管/带卡扣架	ThermoFisher Scientific	条形码管
Matrix SepraSeal 和 DuraSeal&	4463 盖板，SeptraSeal 10/箱	ThermoFisher Scientific
SampleJet		Bruker	高通量样品更换器
SamplePro 管		Bruker	移液机器人