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利用经颅功能超声成像在小鼠中进行全脑三维激活与功能连接图谱绘制

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DOI：

10.3791/62267

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2021年2月24日

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1Physics for Medicine Paris, ESPCI Paris, INSERM, CNRS, PSL Research University, 2Institute of Psychiatry and Neurosciences of Paris, INSERM U1266, Université de Paris, 3Iconeus, 4Department of Pharmacology and Toxicology, Jena University Hospital - Friedrich Schiller University Jena

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了使用功能超声（fUS）对小鼠大脑中体积性脑血流动力学变化进行定量分析的方法。文中以麻醉状态和清醒状态的小鼠为例，提供了在感觉刺激后获得三维功能激活图以及静息态功能连接图的操作流程。

摘要

功能超声（fUS）成像是一种新型脑成像技术，其基于超快多普勒血管造影实现对脑血容量的高灵敏度测量。由于脑灌注与局部神经元活动密切相关，该技术能够以无创方式实现任务诱导的全脑三维区域激活图谱绘制以及静息态功能连接分析，具有无与伦比的空间-时间分辨率和操作简便性。与功能磁共振成像（fMRI）相比，fUS成像的一个主要优势在于可完全兼容清醒且行为自由的动物实验。此外，小鼠作为神经科学中最常用的临床前模型，其fMRI脑成像因脑体积小以及难以维持稳定的生理状态而仍面临技术挑战。本文介绍了一种简单、可靠且稳健的全脑fUS成像方案，适用于使用市售商用fUS系统配合电动线性探头对麻醉和清醒小鼠进行成像，可在感觉刺激后获得显著的皮层激活，并生成可重复的三维功能连接模式用于脑网络识别。

引言

在过去的二十年中，神经影像学已成为研究大脑功能和组织结构的重要工具，使研究人员能够在神经科学领域取得重要发现。如今，功能磁共振成像（fMRI）已成为临床神经影像学的金标准技术，用于评估任务或药物诱发的大脑激活，并绘制静息态下的功能连接图谱。尽管人类fMRI具有较高的可靠性和敏感性，但小鼠fMRI由于多种原因在技术上仍面临诸多挑战1。首先，fMRI的空间和时间分辨率较低。小鼠大脑体积微小，需要使用昂贵的扫描仪施加强磁场，才能获得较为理想的空间分辨率。其次，在麻醉小鼠中维持神经血管耦合所需的狭窄范围内的稳定生理参数极为困难。最后，fMRI研究所依赖的血氧水平依赖（BOLD）信号本身灵敏度相对较低，应用于小鼠时信噪比较低，通常需要在长时间数据采集过程中重复施加刺激，才能检测到微小的信号变化。由于小鼠是生物医学临床前研究中最广泛使用的动物模型，这些局限性在一定程度上导致了神经精神疾病领域的转化鸿沟，阻碍了实验室中具有前景的新型治疗靶点向临床有效疗法的转化。

功能超声成像（fUS）是一种基于超快多普勒技术新近开发的神经影像学方法2。通过直接采样脑血容量，该技术能够利用神经血管耦合机制实时探测脑活动。与其他神经影像技术相比，fUS具有100 µm的空间分辨率和数十毫秒的时间分辨率。该技术可完全无创地实现小鼠脑全脑冠状切面的完整成像。此外，它完全适用于清醒且行为自由的动物3,4,5。目前fUS的主要局限性之一是其二维特性，即同一时间只能记录单个冠状面。尽管已利用二维矩阵阵列换能器在大鼠中成功实现了三维容积fUS成像6，并在小鼠中得到验证7，但其当前灵敏度不足，需要进行完全开颅，并对大量试验数据进行平均，才能检测到微弱的活动变化。另一种替代方法是将线性换能器在多个位置逐步移动，逐层进行功能成像以覆盖整个脑区。然而，该方法需要大量重复实验范式，因而导致较长的采集时间（小鼠脑约为3–4小时）8,9。

在本研究中，我们描述了一个可靠的实验平台，该平台包括一台 commercially available 的功能超声成像仪和一种快速平面切换线性探头，结合相应的操作流程，可在麻醉及清醒小鼠中无创、无需造影剂且在较短时间内获取三维 fUS 数据，实现小鼠脑部的容积式及经颅功能性成像。我们通过绘制胡须刺激后体感皮层的激活图以及静息态功能连接图来展示该技术的优势。除动物准备和数据采集外，我们还详细描述了实时 fUS 信号的可视化、图谱配准及分析流程。

方案

本研究中所有实验程序均遵循2010年9月22日欧洲共同体理事会指令（010/63/UE）以及本单位动物实验伦理委员会（编号59，“Paris Centre et Sud”伦理委员会，项目编号#2017-23）的规定。成年小鼠（雄性C57BL/6 Rj，年龄2-3个月，体重20-30 g，购自法国Janvier Labs）以每笼4只的标准饲养，饲养环境保持12小时光照/12小时黑暗循环，恒温22 °C，并可自由摄食和饮水。在实验开始前，动物均在饲养环境中适应至少一周时间。

1. 麻醉状态下fUS成像的动物准备

  1. 麻醉
    1. 称量小鼠体重。
    2. 在无菌生理盐水中配制浓度分别为 10 mg/mL 的氯胺酮和 2 mg/mL 的赛拉嗪混合液。使用 26 号针头和 1 mL 一次性注射器，按 0.2 mL 剂量腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪混合溶液。数分钟后，将动物固定于立体定位仪上，确保头部保持水平。
    3. 追加第二剂麻醉药物，使氯胺酮总剂量达到 100 mg/kg，赛拉嗪总剂量达到 20 mg/kg（需计入初始剂量）。
      注：麻醉作用应持续约 1 小时。若需延长稳定镇静时间，可每隔 30 分钟腹腔注射 0.05 mL 氯胺酮/赛拉嗪混合液。
  2. 麻醉状态下成像实验的动物准备
    1. 在小鼠眼部涂抹眼膏（例如 Ocry-Gel），以防止成像过程中发生白内障。使用剃毛器剃除小鼠头部毛发，涂抹脱毛膏，数分钟后冲洗干净。重复操作直至毛发完全去除。
    2. 在四肢皮下插入针状电极用于心电图（ECG）记录。将经离心处理的超声耦合剂（1500 rpm，5 分钟）涂抹于头部。
    3. 在整个实验过程中（包括麻醉诱导阶段）持续监测麻醉深度。使用连接直肠探针的加热垫维持动物体温在 37 °C。
    4. 监测以下生理参数，这些参数可作为麻醉深度的间接指标：心率（220–250 次/分钟，通过皮下植入的细电极心电图监测）和呼吸频率（130–140 次/分钟，使用连接至心电图采集系统的呼吸传感器监测）。
      ​注：实验装置示意图见 图 1。

用于小鼠活体脑刺激实验的超声引导聚焦超声系统示意图。
图1：麻醉状态下功能性超声（fUS）实验的实验装置示意图。该图展示了麻醉实验过程中所需全部科学设备的实验设置。1. 生理监测：实时显示呼吸频率和心率。2. 四轴电机模块（三个平移轴和一个旋转轴），由Iconeus One系统（9）控制，可用于执行经颅三维断层扫描或四维图像采集。3a. 驱动胡须刺激器（3b.）的伺服电机。该伺服电机由Arduino Uno控制板调控，并与Iconeus One系统（9）连接，以实现刺激模式与成像序列的同步。4.a. 注射泵控制器。4.b. 注射泵支架。5.a. 温控板监测仪，用于控制加热板。5.b. 加热板及直肠温度计，与温控板监测仪（5.a.）连接。6. 超声耦合凝胶，置于动物头部与超声探头之间，以实现两者间的声学耦合。7. 15 MHz超声探头。8. 探头支架，用于连接探头（7）与电机模块（2）。9. Iconeus One设备及软件，可用于编程设置不同的成像序列，并控制驱动探头（7）的电机模块（2）。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 清醒固定头部小鼠实验的动物准备

  1. 头颅固定板手术
    1. 将麻醉后的动物（步骤 1.1–1.2）置于立体定位仪中，并放置在加热垫（37 °C）上。在眼睛上涂抹保护性凝胶，并使用 26 号针头在头皮皮下注射利多卡因（0.2 mL，2%），等待数分钟。
      注意：每 10–30 分钟通过夹捏脚趾（无反应即为合适）监测麻醉深度。
    2. 沿矢状缝从枕骨后方至鼻骨起始处做切口。使用手术剪将双侧半球的皮肤剪除。
    3. 用 1% 碘溶液清洁颅骨，并去除残留的骨膜。以头颅固定板为模板，在颅骨上钻两个孔（直径 1 mm），用于安装固定螺钉。
      注意：钻孔时需小心，避免穿透颅骨，以防造成脑组织损伤或硬脑膜炎症。
    4. 将头颅固定板与螺钉对位，使用牙科水泥在框架前后固定螺钉和头颅固定板，以确保植入物牢固。
      注意：注意不要将水泥涂入框架窗口内，否则会显著降低信号质量。在颅骨表面覆盖一层薄的外科胶水，以保护骨骼并封闭成像窗口侧缘的伤口。
    5. 待水泥干燥后，将动物从立体定位仪中取出，并皮下注射阿替美唑（1 mg/kg）以逆转麻醉。术后预防性给予美洛昔康（5 mg/kg/天，皮下注射）以缓解疼痛。
    6. 将动物置于带有加热垫（37 °C）的恢复笼中。小鼠可在数小时内返回与同伴共用的饲养笼。在头颅固定板上安装一个磁性 3D 打印保护帽（聚乳酸材料，内置磁铁）以提供保护（图 2A）。在开始对移动饲养笼（MHC）进行适应训练前，让小鼠恢复 4 至 6 天。
      注意：帽和头颅固定板的总重量为 2.8 g。
  2. 操作与适应训练
    1. 术后恢复第 1 天（PR 第 1 天），每天多次用手轻轻握住小鼠 5–10 分钟。
    2. 术后恢复第 2 天（PR 第 2 天），重复第 1 天的操作，并让动物在移动饲养笼（MHC）中自由探索 5–10 分钟。
      注意：在房间内播放轻柔背景音乐有助于减轻动物应激。
    3. 术后恢复第 3 天（PR 第 3 天），让动物在 MHC 中自由探索 5–10 分钟。随后，小心抓住头颅固定板，轻轻将其放入夹具中，并手动移动碳纤维笼以配合小鼠动作。使动物在头部固定状态下适应 5–10 分钟。每次训练之间用 70% 乙醇溶液清洁 MHC，并用自来水冲洗。
      注意：确保 MHC 具备足够的气流，符合制造商建议。头部夹具的高度需手动调节，以提供舒适的体位。
    4. 术后恢复第 4 和第 5 天（PR 第 4–5 天），反复将小鼠夹入 MHC，并逐步延长头部固定时间，从 5 分钟逐渐增加至 30 分钟。在成像窗口处滴加生理盐水和超声耦合剂以进行适应。
    5. 术后恢复第 6 天（PR 第 6 天），重复第 4–5 天的训练流程，并按照步骤 3.1 将探头置于动物头部上方。
    6. 实验当天，按上述流程操作。随后用生理盐水润湿成像窗口，并涂抹适量超声耦合剂。启动动物追踪系统，并进行探头定位（见下文）。
      注意：在 MHC 中夹持小鼠时，也可用布包裹小鼠。若采用此方法，需在头部固定前先让小鼠适应包裹操作。完整的清醒成像实验装置示意图见 图 2B。

小鼠脑成像装置；头固定板系统、扫描设备示意图、密集/稀疏扫描方法。
图 2：清醒小鼠功能性超声（fUS）实验的实验装置。A. 用于保护成像窗口的头固定板磁性盖板的示意图（使用 BioRender.com 制作）。在成像过程中（左图），移除盖板，以便利用头固定板提供的大开口对脑部进行扫描。B. 对头部固定且自由行为的小鼠进行经颅清醒成像的实验装置照片。1. Iconeus One 系统及软件，可用于设置不同的成像序列并控制电机模块。2. 四轴电机模块（三个平移轴和一个旋转轴），由 Iconeus One 系统（1）监控，支持三维断层扫描或四维数据采集。3. 隔振气浮台。4. 移动式家庭笼（MHC）。5a,5b. 显示 MHC 内动物生活环境的特写照片。6. 用于夹紧头固定板的头部固定系统。7. 连接探头与电机模块（2）的探头支架。8. 15 MHz 超声探头。9. 置于小鼠头部与超声探头之间的超声耦合凝胶，用于实现两者之间的声学耦合。10. 驱动胡须刺激器的伺服电机。该伺服电机由 Arduino Uno 控制板控制，并通过 TTL 信号（1）与 Iconeus One 系统连接，以实现刺激模式与成像序列的同步。C. 不同空间采样方式的示意图（使用 BioRender.com 制作）：在每种情况下，探头从起始位置逐步移动至最终位置，并在每个位置记录一幅多普勒图像，以重建堆叠的三维体积数据。此过程在整个采集期间持续重复。密集扫描（左）：切片之间的步长必须足够小（通常为 400 µm，对应于探测器的高程分辨率），以实现容积成像。稀疏扫描（右）：若目标为相距较远的功能区域（位于不同位置），也可降低空间采样密度，仅对穿过这些区域的不同切片进行成像，同时不牺牲时间采样率。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 探针定位

  1. 启动软件（例如 IcoScan）并创建实验会话。进入 移动探头 菜单，使用导航键盘调节超声探头的位置。
    注意：探头应置于动物头部上方约 1 mm 处。在开始任何成像序列之前，必须确保探头已接触超声耦合凝胶。
  2. 开始 实时成像 采集，并根据动物脑血容量（CBV）的实时图像，必要时调整探头位置。将大脑对齐至图像中心。优化成像参数以获得最高的信噪比。
    注意：在清醒小鼠实验中，需要减小孔径尺寸，以避免由侧部肌肉收缩引起的伪影。

4. 血管造影扫描与图谱配准

  1. 在采集软件中打开Angio 3D选项。在预设面板中调整扫描参数（起始层面、终止层面和步长），以实现对整个脑部的扫描（图3A，B），然后开始数据采集。
    注意：设置扫描参数时，需确保扫描范围覆盖脑部的后部区域
  2. 保持采集软件处于打开状态，启动数据分析与可视化软件（例如 IcoStudio），加载 Angio 3D 扫描数据。通过三平面视图面板浏览采集体积，并选择冠状扫描方向：前-后方向或后-前方向。
  3. 进入脑部配准面板。加载用于配准过程的小鼠参考模板。使用全自动或手动配准模式，将扫描图像配准至Allen 小鼠通用坐标框架（图3C）。
  4. 通过观察 Angio 3D 扫描图像与参考模板的叠加效果，或通过图谱管理器面板查看扫描图像与 Allen 参考图谱的叠加情况，来检查配准结果（图3D）。将配准结果保存为 .bps 文件。
    注意：该配准文件可在同一实验会话中进行的其他采集过程中重复使用

5. 脑部定位系统（BPS）

  1. 在 IcoStudio 软件中，确保血管造影扫描及其 .bps 文件（在步骤 4.4中生成）已加载。
  2. 进入脑导航面板。在图谱管理器面板中，通过小鼠Allen 脑图谱的父子树导航器进行浏览。找到目标解剖区域，并选中它们以在三视图中叠加到您的扫描图像上。
  3. 在三视图面板中观察目标区域，并选择一个与实验目标区域重叠的成像平面。为此，请在包含感兴趣区域的冠状位上手动设置两个标记。
  4. 点击脑定位系统（BPS）以提取相应的电机坐标。这些坐标对应于探头位置，可实现对目标成像平面的观察。检查由血管造影扫描计算得出的图像预览。
  5. 在 IcoScan 软件中，进入探头定位面板，然后点击输入 BPS 坐标。应用步骤 5.4中提供的坐标。探头将移动并校准至目标成像平面。
  6. 执行实时成像采集，并确认当前成像平面与步骤 5.4中的预测一致。
    ​注意：也可选择旁矢状面或非正交平面。

脑成像工作流程图：三维血管造影采集、配准、导航、可视化结果。
图3：快速经颅血管造影扫描与脑部配准实现探针精确定位。A. 小鼠脑部在快速血管造影扫描期间，由超声探头从第一冠状切面（绿色）至最后一冠状切面（蓝色）进行经颅扫描的示意图。当前成像切面（红色表示）逐步从脑后部（绿色）移动至前部（蓝色）。图示由 BioRender.com 制作。B. IcoScan 采集软件中血管造影 3D 模块的截图。右侧的预设参数用于配置快速扫描。需合理选择首层切面位置、末层切面位置及步长（单位：mm），以实现对整个脑区的线性扫描。C. IcoStudio 处理软件的截图。快速血管造影 3D 扫描结果自动与小鼠脑参考模板进行配准。三视图（左侧）显示了在冠状面、矢状面和轴状面中血管结构与小鼠脑艾伦图谱的叠加情况。D. 来自 3D 血管造影扫描的 16 个切面（共 31 层）的线性布局（拼接图），其中已将配准后的艾伦参考图谱叠加至血管结构上。E. 脑导航模块的截图，显示了软件根据置于左右侧初级体感皮层桶状区中心的两个标记点所计算出的运动坐标，预测得到的成像平面。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 任务诱发实验：胡须刺激

  1. 预先定义刺激序列，包括刺激时间、刺激间时间间隔和重复次数。
  2. 通过定义总采集时间、位置数量以及位置之间的死区时间，运行三维fUS序列。若通过TTL输入将自动刺激与采集系统同步，请在开始采集前选择 Trig-IN 选项。
    注意：本研究中所展示的结果采用棉签进行刺激，将其放置于可使大部分须毛在背腹方向发生偏转的位置。棉签固定在由Arduino UNO控制板驱动的伺服电机上，并与Iconeus One系统连接以确保同步。推荐的刺激参数为开启30秒、关闭30秒、偏转幅度20°、频率4 Hz。此外，也可在采集过程中于指定时间手动偏转须毛以施加刺激。
  3. 在IcoStudio软件中打开采集数据，进入 激活图 菜单。在激活模式字段中填写起始和结束时间，计算生成激活图。调整显示参数以优化可视化效果。将激活图导出为.h5文件，用于离线分析。
    ​注意：激活程度通过广义线性模型（GLM）方法进行估计，其中刺激信号与默认的小鼠血流动力学响应（HRF）函数进行卷积。此外，也可通过估算每个体素的血流动力学信号与刺激模式之间的皮尔逊相关系数，直接可视化激活情况。

7. 4D 功能连接

  1. 通过定义总采集时间、成像平面位置的数量以及各位置之间的死区时间，运行三维fUS序列。
    注意：对于4D功能连接，我们建议每个体数据之间的采集时间间隔 < 2.5 秒（采样频率至少为 0.4 Hz）以及至少 10 分钟的总采集时间（时间点数量） > 180).
  2. 保存采集数据并将其载入 IcoStudio 软件。如有需要，载入 .bps 文件及 Allen 小鼠脑坐标框架。在 图谱管理器，选择图谱中的区域作为感兴趣区域（ROI）。
  3. 输入 功能连接性 在菜单中选择 ROI 管理器中的目标区域。将结果可视化为功能连接矩阵（有监督分析）或基于种子点的相关性图谱（无监督分析）。根据需要选择并调整带宽滤波器，并导出相关性结果用于统计分析。
    注意：在3D fUS成像模式下，探头的相对位置需手动设置。因此，可根据具体功能应用选择两种类型的扫描方式：密集扫描与稀疏扫描（图 2C).

结果

本方案描述了在静息状态或感觉刺激响应下，经颅对小鼠大脑脑血流动力学变化进行三维定量的方法。以胡须刺激作为感觉刺激诱发反应的示例，该范式是啮齿类动物脑功能激活定位研究中的标准方法。 图4 显示了通过经颅功能性超声（fUS）成像在麻醉小鼠中获得的对机械性胡须刺激的代表性激活图。总试验时长为760秒，包括60秒基线期（刺激前后）、80秒刺激期和60秒恢复期，重复5次。采用默认的小鼠血流动力学响应函数（HRF），通过一般线性模型（GLM）分析确定显著激活区域（Z分数，p值＜0.05）。激活区域（Z分数，p值＜0.05）以彩色编码叠加于解剖图像上。 >在经过严格的Bonferroni多重比较校正后（p = 0.0000006），结果以颜色编码的形式叠加显示于Allen通用坐标框架模板上。对侧初级躯体感觉皮层桶状区（S1BF）的体素级时间进程显示，与基线相比，脑血容量（CBV）增加了15–20%。

脑活动图谱、颜色编码的脑图、CBV图表、功能分析、3D模型
图4：氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠在胡须刺激后经颅激活图谱及相对脑血容量（rCBV）时间进程。A. 在氯胺酮/赛拉嗪麻醉条件下，对右侧胡须进行机械刺激（80秒开启，60秒关闭，重复5次）后显示显著激活体素的激活图谱。该图谱通过基于一般线性模型分析（GLM）计算Z分数，并采用Bonferroni校正进行多重比较。Z分数（颜色编码）叠加于Allen脑3D模板（经与脑定位系统配准后），以三种视图展示：冠状面（左）、矢状面（中）和轴状面（右）。图中标注了Allen小鼠脑公共坐标框架中的解剖区域以供参考。激活体素准确定位于左侧S1BF皮层内。比例尺：1 mm。每个样本体积在2.8 mm范围内（对应高度方向上的7个切片）扫描耗时3.85秒，可在每次功能反应期间记录20个体积样本。B. 胡须刺激诱发的相对脑血容量（rCBV）相对于基线水平增加的3D渲染图。S1BF的解剖边界以蓝色标示。C. 左侧S1BF内CBV变化的时间进程（蓝色）及相应施加的刺激信号（红色）。请点击此处查看该图的放大版本。

使用IcoScan的清醒预设模式，在移动家居笼中对头部固定的活动小鼠应用了相同的实验范式。图5展示了采用图2所述实验装置进行多根胡须刺激实验后的激活图谱。实验中对几根后部和尾侧胡须施加如下刺激模式：30秒基线期，随后进行五次连续的30秒“开启”（4 Hz）与30秒“关闭”交替阶段（图5C）。刺激通过由Arduino UNO控制板触发成像采集序列的伺服电机实现，以确保同步。显著激活通过一般线性模型（GLM）分析确定，采用默认的小鼠血流动力学响应函数（HRF）。多重比较校正采用Bonferroni方法。传统的显著性水平α值0.05根据采集体积内的体素总数进行归一化，最终得到严格的阈值0.000003。

小鼠脑部fMRI分析；Z分数图谱、rCBV变化、实验设置、时间进程图。
图5：清醒行为小鼠在胡须刺激后获得的激活图谱与相对脑血容量（rCBV）时间进程。A. 激活图谱显示，在清醒小鼠的可移动家居笼中对右侧胡须进行机械刺激（30秒开启，30秒关闭，重复5次）后显著激活的体素。图谱通过基于一般线性模型（GLM）分析计算Z分数，并采用Bonferroni校正进行多重比较（以体素总数为归一化基准）获得。Z分数（以颜色编码）叠加于Allen脑3D模板（经与脑定位系统配准后），并以三种视图展示：冠状面（左）、矢状面（中）和轴状面（右）。图中同时标注了Allen小鼠脑公共坐标框架中的解剖区域以供参考。激活体素主要集中于左侧S1BF皮层内。比例尺为1 mm。每个样本体积在1.6 mm范围内（对应高度方向上的3个切片）扫描耗时3.85秒，可在每次功能反应期间记录17个体积样本。B. 胡须刺激诱发的相对于基线水平的相对脑血容量（rCBV）增加的3D渲染图。S1BF的解剖边界以蓝色标示。C. 小鼠在可移动家居笼中接受右侧胡须刺激实验的示意图，实验中共进行5次30秒的刺激，总采集时间为330秒。D. 在激活区域内部提取的瞬时相对CBV时间进程（蓝色），叠加对应刺激信号（红色）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6 显示了在氯胺酮-赛拉嗪麻醉小鼠中，通过与艾伦公共坐标框架配准所识别的三维脑区之间，标准化的低频（<0.2 Hz）自发性脑血容量（CBV）波动的时间相关性。总采集时间为20分钟（1200秒）。基于图谱的监督分析揭示了强烈的半球间连接模式，相关系数最高可达0.8。以背侧海马为种子点的分析显示，左右海马之间以及深部海马后区和梨状皮层之间存在显著的半球间连接性。在S1BF区域选定的种子点也呈现出对称的（皮层-皮层）相关模式，与先前报道一致。

脑连接性分析；相关系数热图与MRI示意图；神经科学研究。
图6：在氯胺酮/赛拉嗪麻醉下，通过20分钟3D fUS采集评估小鼠大脑的经颅容积静息态功能连接性。A. 基于艾伦通用坐标框架中3D脑区的功能连接矩阵，该框架已配准至经颅功能成像数据。该矩阵通过计算各感兴趣区（ROI）内所有体素平均时间信号在切片时间校正后自发低频波动（<0.1 Hz）的归一化皮尔逊相关系数获得。每个采样体积在升维方向上扫描1.6 mm（对应4个切片），采集时间为2.2秒。B。基于种子点的分析结果投影至3D模板。种子点位于右侧背侧海马区，β值为-2.1 mm。相关图通过计算种子点时间信号与全脑每个体素时间信号在切片时间校正后的皮尔逊相关系数获得。C. 基于种子点分析的3D相关图，种子区域位于S1BF区，β值为-2.1 mm。比例尺：1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

全脑成像方法是深入理解脑生理学与病理学的关键工具。本文所述方法能够在实验台旁直接对活体大脑中的血流动力学信号进行精确量化。功能超声具有无与伦比的灵敏度和时空分辨率，特别适用于小鼠生理学研究。功能反应和静息态脑网络可在较短的采集时间内被快速绘制，支持纵向研究，且无需通过多次试验或多个个体的平均即可获得可靠测量结果。结合高灵敏度超声线性探头与快速电动化装置，可在合理的时间内完成小鼠经颅容积功能超声成像。该实验方案既可在麻醉小鼠上实施，也可在使用移动式家庭笼具的清醒小鼠上进行。

本文以胡须刺激作为示例所使用的感官刺激，是啮齿类动物中一种标准的功能激活范式，可用于研究感觉信息处理、神经血管耦合及其变化的可靠读出方法5,6,10, 11。尽管粗略的手动刷动胡须因其操作简便而可能更受青睐，但该方法在空间和时间精度上存在不足。使用自动刺激器（例如本文所述与fUS成像扫描仪同步触发的装置），可更精确地控制多个参数，包括刺激起始时间、位移幅度、频率以及棉签/梳子的角度，从而提高动物间实验结果的可重复性。此外，更精确的刺激时序有助于通过确定起始时间和达峰时间等参数来建模血流动力学响应函数（HRF）12,13。为了更准确地控制刺激过程中偏转的胡须数量（从而控制激活区域的范围），可将更复杂的刺激装置适配于本实验方案。许多其他类型的刺激，如光刺激8、声音刺激14或气味呈现15，也可采用相同的实验流程实施。

与其它神经成像技术相比，功能超声（fUS）适用于清醒且可活动的动物，这一特性具有重要优势，能够在无麻醉偏倚的情况下实现功能激活图谱的绘制。采用气浮式可移动家笼是现有头部固定装置（如线性或球形跑台）的一种良好替代方案。在动物头部被牢固固定的同时，家笼的运动可使小鼠产生在环境中自由移动的错觉，从而能够将多种行为学测试与fUS成像相结合16。然而，头部固定前的适应性训练是降低动物应激反应的关键步骤，尤其在可能将应激视为混杂因素的实验中尤为重要。本文所述的适应程序（为期6天的抓握训练及头部固定适应）在感觉刺激和静息态功能连接研究中已获得可靠结果。但对于更精细的行为学测试，可能需要延长适应周期17。

披露

Jeremy Ferrier 和 Bruno-Félix Osmanski 是 Iconeus 公司的员工。Thomas Deffieux、Zsolt Lenkei、Bruno-Félix Osmanski 和 Mickael Tanter 是 Iconeus 公司的联合创始人及股东。

致谢

本工作得到了欧洲研究理事会（ERC）高级资助项目 N° 339244-FUSIMAGINE、法国国家研究署“Pinch”项目资助（ANR-18-CE37-005）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）生物医学超声研究技术加速器、巴黎神经科学研究所（IPNP）Inserm U1266 的 ElfUS 技术核心、人类脑计划欧洲研究项目 FUSIMICE，以及授予 Andrea Kliewer 的 EMBO 短期奖学金 8439 的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD Plastipak 1 mL 注射器Dutscher, 法国303172
BD Microlance 26 号针头Dutscher, 法国303800
动物体温控制器（加热板与直肠探头组合）PhysitempTCAT-2DF
ArduinoArduinoArduino Uno-Rev3
阿替美唑Orion Pharma, 法国Antisedan®5 mg/ml 注射液
牙科水泥Sun Médical, 滋贺, 日本Superbond C&B
脱毛膏KloraneN/A
眼膏TVM, 英国Ocry-gel
毛发修剪器Wella ProfesionnalsN/A
头固定板Neurotar, 芬兰Model 14
fUS 用 Iconeus One 标准套装Iconeus, 法国Iconeus One
IcoScan 采集软件 (v1.0)Iconeus, 法国IcoScan
IcoStudio 分析软件 (v1.0)Iconeus, 法国IcoStudio
异氟烷麻醉工作站Minerve, Esternay, 法国
氯胺酮Virbac, 法国Ketamine1000100 mg/ml 注射液
利多卡因VetoquinolLurocaine®20 mg/ml 注射液
美托咪定Orion Pharma, 法国Domitor®1 mg/ml 注射液
美洛昔康Boehringer IngelheimMetacam®0.5 mg/ml 注射液
带追踪功能的移动式大号家养笼Neurotar, 芬兰MHC-L-T-V4
ECG 和呼吸频率监测AD Systems, (美国) 和 LabChart 软件
伺服电机FeetechFT90B
立体定位仪David Kopf (Tujunga, 美国)900-WA使用小鼠适配器  (货号: 922) 和无损伤耳杆 (货号: 922)
外科粘合胶3M, 美国Vetbond
注射泵KD Scientific, 美国Legato® 130, 货号 788130
超声耦合凝胶DREXCO medical, 法国Medi'Gel
2% 赛拉嗪Bayer, 法国Rompun®20 mg/ml 注射液

参考文献

  1. Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
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