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方法文章

一种基于荧光光谱法快速评估啮齿类和人类脑组织中肌动蛋白聚合状态的检测方法

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DOI：

10.3791/62268

⸱

2021年6月3日

 , 
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

本文内容

摘要

我们报告了一种基于荧光光谱法的简单、高效且高通量的检测方法，用于定量微丝中的肌动蛋白 离体 来自啮齿类动物和人类受试者脑组织的生物样本。

摘要

肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，在维持神经元结构和功能中起关键作用。在生理状态下，肌动蛋白以两种形式处于动态平衡：单体球状肌动蛋白（G-actin）和聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）。在突触末梢，肌动蛋白细胞骨架构成了突触前和突触后重要功能的基础。此外，肌动蛋白聚合状态的动态变化（球状与丝状形式之间的相互转化）与突触结构和功能的可塑性改变密切相关。本文报道了一种改良的基于荧光的方法，用于评估肌动蛋白的聚合状态 离体 条件。该检测利用荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin），这是一种可特异性结合肌动蛋白丝（F-actin）的毒蕈环肽，能够直接测定聚合态丝状肌动蛋白的含量。作为原理验证，我们提供了实验证据，证明该方法适用于啮齿类动物及死后人脑组织匀浆。通过使用Latrunculin A（一种可使肌动蛋白丝解聚的药物），我们进一步验证了该检测在监测F-actin水平变化中的有效性。此外，我们将该检测拓展至分离的突触末梢生化组分，在其中通过高浓度细胞外K⁺诱导去极化刺激，证实了肌动蛋白聚合程度的增加。+.

引言

细胞骨架蛋白肌动蛋白参与多种细胞功能，包括结构支持、细胞内运输、细胞运动和分裂。肌动蛋白以两种形式处于动态平衡状态：单体球状肌动蛋白（G-actin）和聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）。肌动蛋白聚合状态的快速变化（G型与F型之间的相互转化）导致丝状结构的快速组装与解聚，从而在细胞生理调控中发挥关键作用。肌动蛋白是神经元细胞骨架结构的主要组成成分，影响广泛的神经元功能1,2。值得注意的是，肌动蛋白细胞骨架构成了突触终末结构平台的重要部分，因此在突触形态发生和生理功能中起决定性作用，并在调控突触的大小、数量和形态方面发挥基础性作用3,4,5。特别是，肌动蛋白动态的聚合-去聚合过程是与突触可塑性相关的突触重塑的关键决定因素，而突触可塑性是学习和记忆过程的基础。事实上，无论是突触前功能（如神经递质释放6,7,8,9,10），还是突触后功能（与可塑性相关的动态重塑11,12,13,14），都严重依赖于肌动蛋白细胞骨架聚合状态的动态变化。

在生理条件下，F-肌动蛋白的水平通过涉及翻译后修饰4,15,16以及肌动蛋白结合蛋白（ABPs）4,17的多模式通路进行动态且严密的调控。ABPs 可在多个层面影响肌动蛋白的动力学（例如启动或抑制聚合、诱导丝状结构分支、将丝状体切割为较小片段、促进去聚合以及防止去聚合），并且其自身也受到严格调控，可响应多种胞外和胞内信号18,19,20。这种多层次的调控机制决定了突触细胞骨架中肌动蛋白动力学的严格控制，从而在基础状态和活动诱导状态下精细调节神经元生理学的突触前和突触后特性。

鉴于肌动蛋白在神经元生理学中的重要作用，许多研究已提供证据表明，肌动蛋白动力学的改变是与多种神经系统疾病（包括神经退行性疾病、精神类疾病以及神经发育障碍）相关的关键致病事件3,21,22,23,24,25,26,27。尽管已有大量研究数据揭示了肌动蛋白在神经元生理与病理生理过程中的关键作用，但对于肌动蛋白动力学的理解仍存在显著空白，尤其是在突触细胞骨架层面。目前仍需开展更多研究，以更深入地理解神经元中肌动蛋白的特性及其在病理条件下的变化。这一领域的一个重要研究方向是评估肌动蛋白的聚合状态。目前已有基于蛋白质印迹法的商业化试剂盒（G-Actin/F-Actin 体内检测生化试剂盒；Cytoskeleton 货号 BK03728,29）以及实验室自制的用于检测F-肌动蛋白水平的方法6。然而，这些方法需要对F-肌动蛋白和G-肌动蛋白进行生化分离，且后续定量依赖于免疫印迹技术，因此可能耗时较长。本文报道了一种基于荧光光谱分析的检测方法，该方法改编自先前的一项研究30，并进行了若干改进，可用于评估F-肌动蛋白的基础水平及其组装-去组装过程中的动态变化。值得注意的是，我们已成功将原需适用于1 mL比色皿样品的实验方案优化为适用于96孔板的格式。改进后的方案显著减少了检测所需的组织或样品量。此外，我们还证实该方法不仅适用于脑组织匀浆，也适用于亚细胞组分，如分离的突触末梢（突触小体和突触神经体）。最后，该检测方法既可用于新鲜解剖的啮齿类动物脑组织，也可用于长期保存的死后人脑样本。需要指出的是，尽管本实验方案以神经元为背景呈现，但其同样可合理拓展至其他细胞类型及其相关的生理过程。

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方案

所有实验操作均严格遵守新西兰奥塔哥大学实验动物护理与使用伦理委员会（伦理协议编号：AUP95/18 和 AUP80/17）的规定以及新西兰立法要求。人脑组织来自西班牙巴塞罗那市医院临床-IDIBAPS 生物样本库的神经组织库。所有组织采集程序均经巴塞罗那市医院临床伦理委员会批准，并已获得患者家属的知情同意。

1. 缓冲液和试剂的制备

  1. 准备以下缓冲液用于脑组织匀浆及突触终末富集组分的制备：
    匀浆缓冲液：5 mM HEPES，pH 7.4，含 0.32 M 蔗糖
    重悬缓冲液：5 mM Tris，pH 7.4，含 0.32 M 蔗糖
    洗涤缓冲液：5 mM Tris，pH 8.1
    1.2 M 蔗糖
    1.0 M 蔗糖
    0.85 M 蔗糖
  2. 加入自制或商用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。
    注意：我们使用了无 EDTA 的 Complete 蛋白酶抑制剂混合物（每 10 mL 缓冲液使用 1 片）和磷酸酶抑制剂混合物 IV（1:100，体积比）。
  3. 准备以下缓冲液和试剂用于固定、通透及鬼笔环肽结合：
    Krebs 缓冲液：118.5 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgCl2、2 mM CaCl2、0.1 mM KH2PO4、5 mM NaHCO3、10 mM 葡萄糖、20 mM HEPES，pH 7.4
    1 M KCl
    25% 戊二醛（储存液）
    含 0.1% Triton X-100 和 1 mg/mL NaBH4 的 Krebs 缓冲液
    DMSO 中 400 倍稀释的 Alexa Fluor 647 鬼笔环肽
    含 0.32 M 蔗糖的 Krebs 缓冲液
    DMSO 中 50 μM 毒胡萝卜素 A（储存液）
    1 M KCl（储存液）
    警告：鬼笔环肽具有毒性（LD50 = 2 mg/kg），操作时需谨慎。戊二醛吸入有毒，应在通风橱中操作。
  4. 将缓冲液于 4 °C 保存，鬼笔环肽和毒胡萝卜素 A 于 -20 °C 长期保存。
    ​注意：不建议长期保存缓冲液。本方案可在此处暂停。

2. 脑组织匀浆

  1. 在冰上，使用 Potter-Elvehjem 玻璃匀浆管和研杵，将冷冻保存或新鲜解剖的大鼠脑组织在10倍体积的匀浆缓冲液中进行匀浆。
    注意：脑组织的最佳匀浆效果通常通过手动研杵15–20次实现。可通过观察悬液在玻璃管中顺畅流动来确认匀浆是否充分。此步骤可暂停。
  2. 使用Bradford法测定匀浆液中的蛋白质浓度31。
    注意：也可使用其他自制或商用的蛋白质定量方法。
  3. 将匀浆样品用Krebs缓冲液稀释至每50 µL中含有2–3 mg/mL蛋白质的浓度。
    ​注意：在部分实验中，我们将匀浆液与2 μM 毒胡萝卜素A（latrunculin A）或DMSO（对照）在37 °C孵育1小时。具体操作为：将匀浆液重悬于48 µL Krebs缓冲液中，随后加入2 µL 50 μM 毒胡萝卜素A或2 µL DMSO。若后续需进行免疫印迹分析，可在孵育后取少量样品（10 μg）用于检测。
  4. 固定匀浆样品（见第5节）。

3. 分离神经末梢的制备

  1. 突触体的制备
    注意：也可使用其他方案32,33 制备突触体。
    1. 将脑组织匀浆在 4 °C 条件下以 1,200 × g 离心 10 分钟。
    2. 弃去沉淀，该沉淀为粗核组分。
    3. 将步骤 3.1.1 中获得的上清液（S1）在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。
    4. 移除上清液（S2），该上清液为可溶性胞质组分。
    5. 将步骤 3.1.3 中获得的沉淀（P2）重悬于重悬缓冲液中，该沉淀为粗突触体组分。
      注意：重悬缓冲液的体积取决于起始组织量和所获沉淀量。例如，当起始脑组织为 150–300 mg 时，可将所得沉淀重悬于 200 µL 重悬缓冲液中。
    6. 将重悬后的粗突触体加载至由等体积 0.85 M、1.0 M 和 1.2 M 蔗糖溶液组成的不连续蔗糖梯度上。
      注意：我们通常对 150–300 mg 组织使用每种蔗糖溶液 1 mL。若组织量更大，可相应调整。可通过将 25G 注射器针头紧贴超速离心管内壁并轻柔逐层叠加蔗糖溶液来制备不连续梯度。
    7. 在 4 °C 条件下以 85,000 × g 离心 2 小时。
      注意：由于离心速度较高，需使用能够形成真空以减少发热的超速离心机。
    8. 使用 200 µL 移液枪头收集位于 1.0 M 与 1.2 M 蔗糖界面处的突触体组分。
    9. 用预冷的洗涤缓冲液在 4 °C 条件下以 18,000 × g 离心 10 分钟，洗涤突触体组分。
      注意：洗涤时，将位于 1.0 M 与 1.2 M 蔗糖界面处收集到的突触体组分转移至新的 1.5 mL 离心管中，并加入等体积的洗涤缓冲液，以确保彻底去除高浓度蔗糖。
    10. 再次用预冷的匀浆缓冲液在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟，洗涤突触体沉淀。
    11. 将突触体重悬于冰上的匀浆缓冲液中。
      注意：此步骤可短暂暂停。
    12. 使用 Bradford 法测定蛋白浓度。
    13. 将突触体重悬于 Krebs 缓冲液中，终浓度为 2–3 mg 蛋白/mL，体积为 50 µL（若需用 KCl 去极化突触体，则体积为 47.5 µL；见第 4 节）。
      注意：重悬时，先将突触体组分在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液（缓冲液），然后用 200 µL 移液枪头轻轻吹打，将沉淀重悬于 Krebs 缓冲液中。
    14. 进行去极化处理（第 4 节）。
  2. 突触神经体的制备
    注意：也可使用其他方案34,35 制备突触神经体。
    1. 使用 1 mL 注射器将脑组织匀浆通过滤器支架中预先润湿的孔径为 100 μm 的网状滤膜过滤。
      注意：所有滤膜均需预先润湿，以避免样品损失，润湿应使用匀浆缓冲液。具体操作为：用 1 mL 注射器将匀浆缓冲液通过滤器支架中的滤膜，直至 缓冲液流出。
    2. 将滤液（F1）收集至预冷的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。
    3. 对 F1 组分重复上述操作（步骤 3.2.1 和 3.2.2），以获得第二次滤液（F2）。 
    4. 将 F2 滤液通过孔径为 5 μm 的网状滤膜过滤。
    5. 将滤液（F3）收集至预冷的 1.5 mL 离心管中，并置于冰上。
    6. 将滤液 F3 在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟。
    7. 将沉淀（突触神经体）在冰上重悬于 Krebs 缓冲液中，终浓度为 2–3 mg 蛋白/mL，体积为 50 µL（若需用 KCl 去极化突触体，则体积为 47.5 µL；见第 4 节）。
      注意：此步骤可短暂暂停。
    8. 使用 Bradford 法测定蛋白浓度。
    9. 进行去极化处理（第 4 节）。

4. 氯化钾介导的分离突触末梢去极化

  1. 将突触体/突触神经体在 37 °C 下平衡 5–10 分钟。
  2. 通过加入 KCl 使细胞外 K+ 浓度升至 50 mM，在 37 °C 下刺激 30 秒，同时向相应的未刺激对照组加入等体积的 Krebs 缓冲液。
    注意：例如，向重悬于 47.5 µL Krebs 缓冲液中的突触体加入 2.5 µL 1 M KCl；向相应的未刺激对照突触体加入 2.5 µL Krebs 缓冲液。对于涉及大量样本的实验，每次处理不超过 2 个样本，以确保去极化时间不超过 30 秒。
  3. 通过加入戊二醛（第 5 节）终止刺激。

5. 样品的固定与鬼笔环肽染色

  1. 将戊二醛加入匀浆/突触体/突触神经体样品中，使其终浓度为2.5%，室温作用2-3分钟。
    注意：我们向50 µL样品（匀浆液/突触体/突触神经体）中加入6 µL 25%戊二醛溶液，使终浓度约为2.5%。固定步骤至关重要，必须迅速完成；因此在加入戊二醛后应立即剧烈涡旋混匀样品。
  2. 在20,000 × g条件下离心样品5分钟。
  3. 弃去上清液。
    注意：由于戊二醛具有毒性，应在通风橱内弃去上清液。
  4. 通过将沉淀重悬于含0.1% Triton X-100和1 mg/mL NaBH4的100 µL Krebs缓冲液中，室温孵育2-3分钟以通透化沉淀。
  5. 在20,000 × g条件下离心样品5分钟。
  6. 弃去通透化缓冲液。
  7. 用200 µL Krebs缓冲液洗涤沉淀，于20,000 × g离心5分钟 。
  8. 将沉淀重悬于100 µL Krebs缓冲液中，并加入1× Alexa Fluor 647鬼笔环肽（相当于500 μU），避光、室温染色10分钟。
    注意：市面上可提供其他类型的荧光鬼笔环肽类似物，可用于替代本实验中的试剂。鬼笔环肽的浓度及孵育总体积可能需要根据所测试组织/样品的种类和数量进行调整，应据此标准化最适实验条件。
  9. 将染色后的样品在20,000 × g条件下离心5分钟。
  10. 弃去未结合的鬼笔环肽（上清液）。
  11. 用200 µL Krebs缓冲液洗涤样品，于20,000 × g离心5分钟。
  12. 将样品重悬于含0.32 M蔗糖的200 µL Krebs缓冲液中。
    ​注意：此步骤可短暂暂停实验流程。

6. 荧光分析与光散射

  1. 将Alexa Fluor 647鬼笔环肽染色的样品加入黑色96孔板中。
  2. 在室温下，使用酶标仪在激发波长645 nm、发射波长670 nm条件下测定荧光强度。
  3. 使用200 µL移液枪头将样品从黑色96孔板转移至透明96孔板中。
  4. 在540 nm处测定光散射，以校正固定、透化和染色等前序步骤中可能发生的损失。
    注意：染色样品中残留生物材料的差异在起始材料量较少时可能更为显著（见讨论部分）。
  5. 每次实验批次中，需包含一系列不同浓度的Alexa Fluor 647鬼笔环肽Krebs缓冲液（0.05x、0.1x、0.25x、0.35x、0.75x、0.5x和1x，分别对应25、50、125、175、250、375和500 μU），作为标准曲线。
    ​注意：此步骤为可选，尤其当F-肌动蛋白水平以相对方式表达时（第7节），对实验结果影响不大。此处可暂停实验流程。

7. 数据分析

  1. 样品中F-肌动蛋白的含量与结合的鬼笔环肽荧光强度成正比。根据标记鬼笔环肽标准品的线性曲线，以结合鬼笔环肽的绝对单位表示结果。
    注：示例见图2A-B、3A、4A-B和补充图2。
  2. 将F-肌动蛋白水平表示为对照样品的相对比例。
    注：示例见图5A-B。

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结果

用于评估F-肌动蛋白水平的检测方法的线性关系
首先，确定Alexa Fluor 647鬼笔环肽荧光线性增加的标准曲线，并在每组实验中重复该步骤。图1). 为考察该检测方法的线性范围，使用不同量的啮齿类动物脑匀浆（图2A 和 2B）以及死后人类受试者（图3A 和 3B）进行了处理。该检测在50-200 μg 通过标记的鬼笔环肽保留量评估蛋白质含量。使用540 nm处的光散射来确认样品的不同量图 2C 以及 图3C).

Latrunculin（一种肌动蛋白去聚合剂）可减少标记鬼笔环肽的结合
Latru...

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讨论

本实验方法基本改编自先前的一项研究30，并进行了修改，采用了一种与荧光标记物结合的鬼笔环肽（phallotoxin）——鬼笔环肽（phalloidin）。荧光标记的鬼笔环肽类似物被认为是固定组织中肌动蛋白丝染色的金标准47,48,49。事实上，它们是最早用于特异性识别肌动蛋白丝的工具50，至今仍是检测肌动蛋白丝最广泛使用的试剂，尤其适用于后续基于荧光显微镜的分析。重要的是，已有研究表明鬼笔环肽甚至能够染色松散且不规则的短肌动蛋白丝网状结构51，表明鬼笔环肽的结合不依赖于肌动蛋白丝的长度。而我们的实验方案则依赖荧光光谱法来分析离体（ex vivo）生物样品（例如啮齿类动物和人类的脑组织）中的肌动蛋白动态变化。

该方案的主要优势在于，与现有方...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由新西兰神经病学基金会（1835-PG）、新西兰卫生研究委员会（#16-597）以及新西兰奥塔哥大学解剖学系资助。我们感谢西班牙HCB-IDIBAPS生物样本库神经组织库提供人脑组织。我们感谢张佳娴在视频录制和编辑过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3.5 mL 开口厚壁聚碳酸酯管Beckman Coulter349622用于梯度离心（突触体提取）
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽Thermo Fisher ScientificA22287F-肌动蛋白特异性配体
抗  b-actin 抗体Santa Cruz BiotechnologySc-47778用于免疫印迹法检测总肌动蛋白水平
抗 GAPDH 抗体AbcamAb181602用于免疫印迹法检测 GAPDH 水平
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad5000006基于 Bradford 法的蛋白质定量
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）Sigma-AldrichC3306Krebs 缓冲液组分
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich4693159001用于样品制备过程中抑制内源性蛋白酶活性
Corning 96 孔透明平底聚苯乙烯板Corning3596用于光散射测量
D-(+)-葡萄糖Sigma-AldrichG8270Krebs 缓冲液组分
二甲基亚砜Sigma-AldrichD5879鬼笔环肽和拉帕酮 A 的溶剂
荧光平板扫描仪（Odyssey 红外扫描仪）Li-Cor Biosciences用于检测免疫印迹上的免疫反应信号
戊二醛溶液（25% 水溶液）II 型Sigma-AldrichG6257固定剂
HEPESSigma-AldrichH3375样品制备缓冲液组分及 Krebs 缓冲液组分
拉帕酮 ASigma-AldrichL5163肌动蛋白丝解聚剂
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）Sigma-AldrichM2670Krebs 缓冲液组分
微孔板
Millex 5 mm 膜滤器MilliporeLSWP01300突触体的制备
Nunc F96 黑色微孔板Thermo Fisher Scientific237105用于荧光测定
100 mm 尼龙网滤器MilliporeNY1H02500突触体的制备
磷酸酶抑制剂混合物 IVAbcamab201115用于样品制备过程中抑制内源性磷酸酶活性
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP9541Krebs 缓冲液组分，用于突触末梢去极化
磷酸二氢钾（(KH2PO4)Sigma-AldrichP9791Krebs 缓冲液组分
硼氢化钠（NaBH4)Sigma-Aldrich71320透化缓冲液组分
氯化钠（NaCl）LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL944Krebs 缓冲液组分
碳酸氢钠（NaHCO3)LabServ (Thermo Fisher Scientific)BSPSL900Krebs 缓冲液组分
SpectraMax i3xMolecular Devices用于荧光测定
蔗糖Fisher ChemicalS/8600/60样品制备缓冲液组分
Swimnex 滤器支架MilliporeSx0001300突触体的制备
5 mL Potter-Elvehjem 组织研磨器Duran Wheaton Kimble358034用于组织匀浆
Triton X-100Sigma-AldrichX100透化缓冲液组分
Trizma 碱Sigma-AldrichT6066样品制备缓冲液组分

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