一种基于荧光光谱法快速评估啮齿类和人类脑组织中肌动蛋白聚合状态的检测方法

摘要

我们报告了一种基于荧光光谱法的简单、高效且高通量的检测方法，用于定量微丝中的肌动蛋白 离体 来自啮齿类动物和人类受试者脑组织的生物样本。

摘要

肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，在维持神经元结构和功能中起关键作用。在生理状态下，肌动蛋白以两种形式处于动态平衡：单体球状肌动蛋白（G-actin）和聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）。在突触末梢，肌动蛋白细胞骨架构成了突触前和突触后重要功能的基础。此外，肌动蛋白聚合状态的动态变化（球状与丝状形式之间的相互转化）与突触结构和功能的可塑性改变密切相关。本文报道了一种改良的基于荧光的方法，用于评估肌动蛋白的聚合状态 离体 条件。该检测利用荧光标记的鬼笔环肽（phalloidin），这是一种可特异性结合肌动蛋白丝（F-actin）的毒蕈环肽，能够直接测定聚合态丝状肌动蛋白的含量。作为原理验证，我们提供了实验证据，证明该方法适用于啮齿类动物及死后人脑组织匀浆。通过使用Latrunculin A（一种可使肌动蛋白丝解聚的药物），我们进一步验证了该检测在监测F-actin水平变化中的有效性。此外，我们将该检测拓展至分离的突触末梢生化组分，在其中通过高浓度细胞外K⁺诱导去极化刺激，证实了肌动蛋白聚合程度的增加。⁺.

引言

细胞骨架蛋白肌动蛋白参与多种细胞功能，包括结构支持、细胞内运输、细胞运动和分裂。肌动蛋白以两种形式处于动态平衡状态：单体球状肌动蛋白（G-actin）和聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）。肌动蛋白聚合状态的快速变化（G型与F型之间的相互转化）导致丝状结构的快速组装与解聚，从而在细胞生理调控中发挥关键作用。肌动蛋白是神经元细胞骨架结构的主要组成成分，影响广泛的神经元功能^1,2。值得注意的是，肌动蛋白细胞骨架构成了突触终末结构平台的重要部分，因此在突触形态发生和生理功能中起决定性作用，并在调控突触的大小、数量和形态方面发挥基础性作用^3,4,5。特别是，肌动蛋白动态的聚合-去聚合过程是与突触可塑性相关的突触重塑的关键决定因素，而突触可塑性是学习和记忆过程的基础。事实上，无论是突触前功能（如神经递质释放^6,7,8,9,10

方案

所有实验操作均严格遵守新西兰奥塔哥大学实验动物护理与使用伦理委员会（伦理协议编号：AUP95/18 和 AUP80/17）的规定以及新西兰立法要求。人脑组织来自西班牙巴塞罗那市医院临床-IDIBAPS 生物样本库的神经组织库。所有组织采集程序均经巴塞罗那市医院临床伦理委员会批准，并已获得患者家属的知情同意。

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 准备以下缓冲液用于脑组织匀浆及突触终末富集组分的制备：
   匀浆缓冲液：5 mM HEPES，pH 7.4，含 0.32 M 蔗糖
   重悬缓冲液：5 mM Tris，pH 7.4，含 0.32 M 蔗糖
   洗涤缓冲液：5 mM Tris，pH 8.1
   1.2 M 蔗糖
   1.0 M 蔗糖
   0.85 M 蔗糖
2. 加入自制或商用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。
   注意：我们使用了无 EDTA 的 Complete 蛋白酶抑制剂混合物（每 10 mL 缓冲液使用 1 片）和磷酸酶抑制剂混合物 IV（1:100，体积比）。
3. 准备以下缓冲液和试剂用于固定、通透及鬼笔环肽结合：
   Krebs 缓冲液：118.5 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、0.1 mM KH₂PO₄

结果

用于评估F-肌动蛋白水平的检测方法的线性关系
首先，确定Alexa Fluor 647鬼笔环肽荧光线性增加的标准曲线，并在每组实验中重复该步骤。图1). 为考察该检测方法的线性范围，使用不同量的啮齿类动物脑匀浆（图2A 和 2B）以及死后人类受试者（图3A 和 3B）进行了处理。该检测在50-200 μg 通过标记的鬼笔环肽保留量评估蛋白质含量。使用540 nm处的光散射来确认样品的不同量图 2C 以及 图3C).

Latrunculin（一种肌动蛋白去聚合剂）可减少标记鬼笔环肽的结合
Latru.......

讨论

本实验方法基本改编自先前的一项研究³⁰，并进行了修改，采用了一种与荧光标记物结合的鬼笔环肽（phallotoxin）——鬼笔环肽（phalloidin）。荧光标记的鬼笔环肽类似物被认为是固定组织中肌动蛋白丝染色的金标准^47,48,49。事实上，它们是最早用于特异性识别肌动蛋白丝的工具⁵⁰，至今仍是检测肌动蛋白丝最广泛使用的试剂，尤其适用于后续基于荧光显微镜的分析。重要的是，已有研究表明鬼笔环肽甚至能够染色松散且不规则的短肌动蛋白丝网状结构⁵¹，表明鬼笔环肽的结合不依赖于肌动蛋白丝的长度。而我们的实验方案则依赖荧光光谱法来分析离体（ex vivo）生物样品（例如啮齿类动物和人类的脑组织）中的肌动蛋白动态变化。

该方案的主要优势在于，与现有方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3.5 mL 开口厚壁聚碳酸酯管	Beckman Coulter	349622	用于梯度离心（突触体提取）
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽	Thermo Fisher Scientific	A22287	F-肌动蛋白特异性配体
抗  b-actin 抗体	Santa Cruz Biotechnology	Sc-47778	用于免疫印迹法检测总肌动蛋白水平
抗 GAPDH 抗体	Abcam	Ab181602	用于免疫印迹法检测 GAPDH 水平
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液	Bio-Rad	5000006	基于 Bradford 法的蛋白质定量
二水合氯化钙（CaCl2·2H2O）	Sigma-Aldrich	C3306	Krebs 缓冲液组分
cOmplete Mini 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	4693159001	用于样品制备过程中抑制内源性蛋白酶活性
Corning 96 孔透明平底聚苯乙烯板	Corning	3596	用于光散射测量
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	Krebs 缓冲液组分
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879	鬼笔环肽和拉帕酮 A 的溶剂
荧光平板扫描仪（Odyssey 红外扫描仪）	Li-Cor Biosciences		用于检测免疫印迹上的免疫反应信号
戊二醛溶液（25% 水溶液）II 型	Sigma-Aldrich	G6257	固定剂
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	样品制备缓冲液组分及 Krebs 缓冲液组分
拉帕酮 A	Sigma-Aldrich	L5163	肌动蛋白丝解聚剂
六水合氯化镁（MgCl2·6H2O）	Sigma-Aldrich	M2670	Krebs 缓冲液组分
微孔板
Millex 5 mm 膜滤器	Millipore	LSWP01300	突触体的制备
Nunc F96 黑色微孔板	Thermo Fisher Scientific	237105	用于荧光测定
100 mm 尼龙网滤器	Millipore	NY1H02500	突触体的制备
磷酸酶抑制剂混合物 IV	Abcam	ab201115	用于样品制备过程中抑制内源性磷酸酶活性
氯化钾（KCl）	Sigma-Aldrich	P9541	Krebs 缓冲液组分，用于突触末梢去极化
磷酸二氢钾（(KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791	Krebs 缓冲液组分
硼氢化钠（NaBH4)	Sigma-Aldrich	71320	透化缓冲液组分
氯化钠（NaCl）	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL944	Krebs 缓冲液组分
碳酸氢钠（NaHCO3)	LabServ (Thermo Fisher Scientific)	BSPSL900	Krebs 缓冲液组分
SpectraMax i3x	Molecular Devices		用于荧光测定
蔗糖	Fisher Chemical	S/8600/60	样品制备缓冲液组分
Swimnex 滤器支架	Millipore	Sx0001300	突触体的制备
5 mL Potter-Elvehjem 组织研磨器	Duran Wheaton Kimble	358034	用于组织匀浆
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	透化缓冲液组分
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T6066	样品制备缓冲液组分