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方法文章

绵羊成年与未成年卵巢体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻

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DOI：

10.3791/62272

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2021年7月10日

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1Department of Veterinary Medicine, University of Sassari

本文内容

摘要

本方案旨在提供一种用于成年和幼年绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的标准方法。该方案涵盖了从体外成熟培养基的制备到复苏后培养的全部步骤。卵母细胞在MII期采用Cryotop法进行玻璃化冷冻，以确保使用最小必要体积。

摘要

在畜牧业中，由于可以从屠宰场方便地获取大量卵巢和卵母细胞，体外胚胎生产系统得以建立并维持。成年动物的卵巢始终带有多个腔状卵泡，而在未成年供体中，4周龄时可获得的卵母细胞数量最多，此时卵巢中的腔状卵泡数量达到峰值。因此，尽管未成年卵母细胞的发育潜能低于成年个体的卵母细胞，4周龄的羔羊仍被认为是良好的供体。

成功冻存来自成年和青春期前供体的玻璃化卵母细胞，将有助于推动基础研究和商业应用的发展。对青春期前供体所采集卵母细胞进行玻璃化保存，还可缩短世代间隔，从而提高育种计划中的遗传增益。然而，冻存后发育潜能的下降使得哺乳动物卵母细胞成为最难冻存的细胞类型之一。在现有的冻存技术中，玻璃化法已广泛应用于动物和人类卵母细胞的保存。尽管该技术近年来已有进步，但高浓度冷冻保护剂的暴露以及冷损伤和渗透压应激仍会引发多种结构和分子水平的改变，降低哺乳动物卵母细胞的发育潜能。本文介绍了一种对来自未成年和成年供体、经体外成熟后的绵羊卵母细胞进行玻璃化冻存的实验方案。该方案涵盖了从卵母细胞体外成熟、玻璃化冻存、复温到复温后培养的全部操作步骤。处于MII期的卵母细胞经玻璃化冻存和复温后确实可以受精，但在受精前需要额外的培养时间，以修复冻存过程造成的损伤并提升其发育潜能。因此，复温后的培养条件和培养时间对于恢复卵母细胞发育潜能至关重要，尤其是在卵母细胞来源于未成年供体的情况下。

引言

雌性配子的长期保存具有广泛的应用前景，例如通过遗传选育项目改良家畜育种，通过异地野生动物保护计划促进生物多样性保护，以及利用可储存的卵母细胞开展体外胚胎生产或核移植项目，从而推动体外生物技术的研究与应用1,2,3。对幼年个体的卵母细胞进行玻璃化冷冻还可通过缩短育种过程中的世代间隔，提高遗传增益4。目前，通过超快速降温与复温实现卵母细胞玻璃化已被视为家畜卵母细胞冷冻保存的标准方法5。在反刍动物中，通常在从屠宰场获取的卵巢卵泡中采集卵母细胞后，先进行体外成熟，再实施玻璃化冷冻2。成年动物、尤其是未成熟前的幼龄动物的卵巢4,6，实际上可提供近乎无限数量的可用于冷冻保存的卵母细胞。

近十年来，多个实验室普遍报道，牛卵母细胞经玻璃化冷冻及复温后，囊胚发育率通常可超过>10%3。然而，在小型反刍动物中，无论是幼龄还是成年个体的卵母细胞，玻璃化冷冻技术仍相对较新，绵羊卵母细胞的标准化玻璃化冷冻方法尚未建立2,5。尽管近年来取得了一些进展，但经玻璃化冷冻和复温的卵母细胞确实存在多种功能和结构上的改变，限制了其发育潜能7,8,9。因此，仅有少数研究报道了玻璃化冷冻/复温后绵羊卵母细胞的囊胚发育率达到或超过10%2。为减少上述不利改变，研究人员已探索了多种策略：优化玻璃化冷冻液和复温液的成分10,11；尝试使用不同的冷冻载具8,12,13；以及在体外成熟（IVM）期间4,14,15和/或复温后的恢复阶段6施加特定处理措施。

本文描述了一种对来自未成年和成年供体且经体外成熟培养的绵羊卵母细胞进行玻璃化冷冻保存的方案。该方案涵盖了从卵母细胞体外成熟、玻璃化冷冻、复温到复温后培养的全部操作步骤。

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方案

以下所述的动物实验方案及实施步骤均符合萨萨里大学现行的伦理准则，并遵守欧盟指令86/609/EC以及欧洲共同体委员会2007/526/EC建议书的规定。

1. 卵母细胞操作培养基的制备

  1. 通过在 Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中添加 0.1 g/L 青霉素和 0.1 g/L 链霉素，制备用于运输采集卵巢的保存液。
  2. 通过将 9.5 g 组织培养基（TCM）199 粉末溶解于 1 L 经 Milli-Q 水配制并添加 0.1% 青霉素和 0.1% 链霉素的溶液中，制备卵母细胞采集与成熟培养基。
    1. 稀释后，过滤 100 mL 培养基，并于 4 °C 保存，作为储备成熟培养基（SMM），可使用一周。
    2. 通过向剩余的 900 mL 培养基中添加 25 mM HEPES、0.36 g/L 碳酸氢盐和 0.1%（w/v）聚乙烯醇（PVA），制备采集培养基（CM）（pH 7.3，渗透压 290 mOsm/kg）。
  3. 使用 SMM 并补充 0.021 g/L 碳酸氢盐、10% 热灭活发情期绵羊血清、1 IU/mL FSH、1 IU/mL LH、100 µL 半胱胺和 8 mg/mL 丙酮酸，制备成熟培养基。
    注意：成熟培养基需在使用前于标准条件下（39 °C、5% CO2、空气环境中最大湿度）孵育至少 4 小时，体积为 10 mL。
  4. 制备用于体外成熟后卵母细胞操作的基础培养基（BM），成分为不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS，并补充 20% 胎牛血清（FCS）。

2. 卵母细胞的采集与成熟

  1. 从幼年（30-40日龄，体重6-10 kg）和成年卵巢中回收卵母细胞。
  2. 将从商业屠宰场收集的卵巢置于27 °C的PBS中，在1-2小时内运送至实验室。
  3. 在PBS新鲜培养基中清洗后，使用微型刀片在CM中切开卵巢，释放卵泡内容物。
  4. 在体视显微镜下以60倍放大倍数进行观察，选择具有4-10层颗粒细胞、细胞质均匀、胞质内脂滴分布均一且外径约为90 µm（平均值）的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），用于体外成熟。
  5. 将选出的COCs在CM中清洗三次，最后转移至成熟培养基中。
    注意：对于幼年动物的卵母细胞，为提高玻璃化冷冻后的存活率，可在成熟培养基中添加100 µM海藻糖。
  6. 进行体外成熟时，将30-35个COCs转移至四孔培养皿中的600 µL成熟培养基中，覆盖300 µL矿物油，并在39 °C、5% CO2的空气环境中孵育22小时（成年卵母细胞）或24小时（幼年卵母细胞）。
  7. 体外成熟后，通过轻柔吹打去除COCs的卵丘细胞。在体视显微镜下以60倍放大倍数观察后，仅选择显示第一极体排出、处于第二次减数分裂中期（MII期）的卵母细胞进行玻璃化冷冻。

3. 精液采集、冷冻与解冻操作步骤

  1. 制备用于精液冷冻保存的基础培养基，其成分为公羊稀释液（200 mM Tris；70 mM 柠檬酸；55 mM 果糖；pH 7.2，渗透压 300 mOsm/kg），并添加 20%（v/v）的蛋黄。
  2. 仅在绵羊繁殖季节（10月至11月）采集精液。
  3. 通过人工阴道法采集成年公羊（年龄 2–5 岁）的射精样本，公羊饲养于户外环境，并饲喂维持体重所需的日粮。将公羊隔离饲养于单独的圈舍中，但保持彼此间的视觉接触。
  4. 在整个繁殖季节内，每周采集一次精液，以从每只公羊获得至少 8 次射精样本。
  5. 采集后 5 分钟内将精液样品于环境温度下运送至实验室，并立即进行处理。将 2–3 只公羊的射精样本混合，并通过分光光度法评估精子浓度。
  6. 混合后，用添加了 4% 甘油的基础冷冻保存培养基将射精样本稀释至 400 × 106 个精子/mL。随后将稀释后的精液在 2 小时内冷却至 4 °C，并在冷冻前平衡 20 分钟。
  7. 将精液样品以颗粒形式（0.25 mL）在干冰上冷冻，然后投入液氮中保存。
  8. 解冻时，将冻存颗粒放入灭菌的玻璃离心管中，置于 39 °C 水浴中 20 秒。

4. 体外受精与胚胎培养

  1. 准备合成输卵管液（SOF）的储备液。
    1. 制备储备液A：99.4 mL 去离子水；6.29 g NaCl；0.534 g KCl；0.161 g KH2PO4；0.182 g MgSO4·7H2O；以及 0.6 mL 乳酸钠。4 °C 保存，最长可保存3个月。
    2. 制备储备液B：10 mL 去离子水；0.210 g NaHCO3；以及 2–3 g 酚红。4 °C 保存1个月。
    3. 制备储备液C：10 mL 去离子水；以及 0.051 g 丙酮酸钠。4 °C 保存1个月。
    4. 制备储备液D：10 mL 去离子水；以及 0.262 g CaCl2·2H2O。4 °C 保存1个月。
    5. 制备10 mL SOF：包含7.630 mL 去离子水、1 mL 储备液A、1 mL 储备液B、0.07 mL 储备液C 和 0.7 mL 储备液D。
    6. 制备体外受精（IVF）培养基：在SOF中添加2%热灭活发情期绵羊血清、10 µg/mL 肝素和1 µg/mL 低聚鸟氨酸（渗透压为280–290 mOsm/kg）。
      注意：IVF培养基需在使用前至少孵育4小时，孵育条件为标准条件（39 °C、5% CO2、5% O2 和90% N2 的最大湿度环境）。
  2. 将冻融后的精液样品转移至无菌玻璃锥形管中，置于1.5 mL预热的IVF培养基下方，并在39 °C、5% CO2 的湿润空气中孵育15分钟。
  3. 孵育后，活动精子会游向液体柱的上层。收集上层液体并进行精子活力评估。
    注意：应使用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子活力参数，设置如下：采集25帧以避免精子轨迹重叠，最小对比度为10，平均路径速度最小为30 µm/s，前向运动精子的直线性> 80%。该系统具有专用于公羊精子评估的特定设置。每个样品取5 µL精子悬液，加入预热的分析室（深度为10 µm），在37 °C、40倍相差显微镜下进行分析，每个样品至少分析四个不同视野，总计不少于500个精子。评估总活动精子百分比和前向运动精子百分比。用于体外受精的精子样品中，前向运动精子百分比应≥ 30%。
  4. 将经上浮法获得的活动精子稀释至终浓度为1 × 106 个精子/mL，并与MII期卵母细胞共同孵育于四孔培养皿中，每孔含300 µL IVF培养基，并覆盖矿物油。
  5. 受精22小时后，将假定的受精卵转移至含有SOF培养基的四孔培养皿中，培养基中添加0.4%牛血清白蛋白以及按文献16报道的输卵管浓度的必需和非必需氨基酸，表面覆盖矿物油，并在标准条件下培养至囊胚阶段。
  6. 在受精后22小时、26小时和32小时，使用60倍体视显微镜观察并记录卵裂卵母细胞数量（表现为两个明显分裂球）。
  7. 从培养第5天至第9天每天观察胚胎发育情况，并使用60倍体视显微镜记录新形成的囊胚。

5. 卵母细胞玻璃化冷冻与复温

注意：采用最小必需体积（MEV）法，使用Cryotop装置进行玻璃化冷冻17.

  1. 将一组五个卵母细胞在 BM 中于 38.5 °C 平衡 2 分钟。使用 BM 可确保较低的钙离子浓度（[Ca2+] 2.2 mg/dL）10。
  2. 将卵母细胞置于含 7.5% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO) 和 7.5% (v/v) 乙二醇 (EG) 的平衡液中，暴露 3 分钟，以进行脱水处理。
  3. 将卵母细胞转移至玻璃化冷冻液中，该溶液含有 16.5% (v/v) DMSO、16.5% (v/v) EG 和 0.5 M 海藻糖，溶于 BM 中；随后在 30 秒内将其加载至冷冻载体（cryotop）装置中，并立即浸入液氮中。
  4. 为恢复至生理温度，将每个玻璃化冷冻装置的内容物从液氮中转移至 200 µL 含 1.25 M 海藻糖的 BM 液滴中，于 38.5 °C 孵育 1 分钟，并轻轻搅拌以促进混合。
  5. 为促进去除卵母细胞内的冷冻保护剂，将卵母细胞逐步转移至含递减浓度海藻糖的 200 µL 液滴中（BM 中分别含 0.5 M、0.25 M、0.125 M 海藻糖），每次在 38.5 °C 下孵育 30 秒，最后在 BM 中于 38.5 °C 平衡 10 分钟。

6. 卵母细胞复温后质量评估

  1. 复温后，将卵母细胞在不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS 中，加入 20% 胎牛血清（FCS）（BM），于 38.5 °C、5% CO2 的空气环境中孵育 6 小时。
    注意：卵母细胞在玻璃化冷冻后恢复其生物学和结构特征的能力与物种及所用卵母细胞的类型有关。
  2. 由于卵母细胞修复冷冻损伤的能力具有时间依赖性，因此应在复温后体外培养的不同时间点（0 小时、2 小时、4 小时、6 小时）评估卵母细胞质量，以确定卵母细胞受精的最佳时间窗口。
    ​注意：在成年绵羊卵母细胞中，最佳时间为复温后 4 小时；在未成年（青春期前）绵羊卵母细胞中，最佳时间为复温后 2 小时。

7. 卵母细胞存活率评估

  1. 复苏后立即进行操作，并在复苏后培养的每个时间点，使用倒置显微镜在100倍放大倍数下对卵母细胞进行形态学评估。
    注意：若卵母细胞出现细胞质模糊、透明带和/或细胞膜损伤等结构改变，应将其归类为退化卵母细胞。
  2. 采用双荧光染色法验证细胞膜完整性。
  3. 将卵母细胞在含有碘化丙啶（PI；10 µg/mL）和Hoechst 33342（10 µg/mL）的2 mL BM培养基中孵育5分钟，气体环境为5% CO2，温度为38.5 °C。
  4. 用新鲜BM培养基洗涤三次后，在荧光显微镜下观察卵母细胞，Hoechst 33342使用350 nm激发滤光片和460 nm发射滤光片，PI使用535 nm激发滤光片和617 nm发射滤光片。
    ​注意：细胞膜完整的卵母细胞可显示出Hoechst 33342染色DNA产生的蓝色荧光；细胞膜受损的卵母细胞则因PI对DNA的染色而呈现红色荧光。

8. 通过共聚焦激光扫描显微镜评估线粒体活性和细胞内活性氧水平

  1. 准备MitoTracker Red CM-H2XRos（MT-Red）探针。
    1. 将1个小瓶（50 µg）内容物用1 mL DMSO溶解，配制成1 mM溶液。将稀释后的溶液保存于液氮中。
    2. 用DMSO将1 mM溶液进一步稀释，获得100 µM的储存液，并于-80 °C避光保存。
  2. 准备2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）探针。
    1. 将H2DCF-DA溶于0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVA）/PBS中，配制成初始100 mM溶液。将该溶液于-80 °C避光保存。
    2. 用0.1% PVA/PBS将初始溶液稀释，获得100 µM的储存液，于-20 °C避光保存。
  3. 配制封片介质（MM）：每10 mL MM中加入5 mL甘油、5 mL PBS和250 mg叠氮化钠。使用前于-20 °C保存。
  4. 将卵母细胞在含有500 nM MT-Red（储存液：100 µM溶于DMSO）的BM中，于38.5 °C孵育30分钟。
  5. 与MT-Red探针孵育后，用BM洗涤卵母细胞三次，然后在含5 µM H2DCF-DA（储存液：100 µM溶于BM）的相同培养基中继续孵育20分钟。
  6. 探针处理后，用BM洗涤卵母细胞，并在2.5%戊二醛/PBS中固定至少15分钟。
  7. 固定后，用BM洗涤卵母细胞三次，然后将其置于载玻片上，滴加4 µL MM，并加入终浓度为1 mg/mL的Hoechst 33342，使用石蜡垫圈避免样本受压。
  8. 将载玻片于4 °C避光保存，直至检测。
  9. 使用共聚焦激光扫描显微镜对免疫标记切片进行分析。显微镜配备Ar/He/Ne激光器，采用40/60倍油镜。通过顺序激发方式对切片进行分析。
  10. 在线粒体评估中，使用多光子激光观察样本以检测MT-Red（激发波长：579 nm；发射波长：599 nm）。
  11. 使用488 nm氩离子激光束及B-2 A滤光片（激发波长495 nm，发射波长519 nm）检测二氯荧光素（DCF）18。
  12. 在每个单独的卵母细胞中，在赤道面处测量MT-Red和DCF的荧光强度19。
  13. 在整个图像采集过程中，保持与荧光强度相关的参数恒定（激光能量26%，顺序设置1：PMT1增益649-PMT2增益482；顺序设置2：PMT1增益625-PMT2增益589；偏移量0；针孔大小：68）。
  14. 采用Leica LAS AF Lite图像分析软件包进行荧光强度的定量分析，操作步骤参照文献20标准化流程。
  15. 沿Z轴移动，仅采集一次图像，直至到达赤道面。
  16. 对每张图像转换为灰度图，并关闭通道1（对应Hoechst蓝色）。然后手动在感兴趣区域（ROI）绘制一个包围区域，即围绕减数分裂纺锤体的范围。
    注：该软件可自动读取通道2（FITC）的像素平均值，并从中扣除背景值。
  17. 记录像素的平均值，并用于统计分析。

9. 统计分析

  1. 采用卡方检验分析以下差异：幼年与成年卵母细胞的存活率，对照组与海藻糖处理组幼年卵母细胞的存活率及发育能力，不同钙离子浓度培养基玻璃化冷冻的成年卵母细胞的存活率、孤雌激活率及发育能力，低钙与高钙浓度培养基玻璃化冷冻幼年卵母细胞的受精率与胚胎发育情况，幼年玻璃化冷冻卵母细胞在复苏后不同培养时间点的线粒体活性表型变化，以及成年与幼年玻璃化冷冻卵母细胞之间的孤雌激活率差异。
  2. 采用Levene方差齐性检验后，通过单因素方差分析（ANOVA）分析玻璃化冷冻成年卵母细胞在复苏后不同培养时间点的卵裂率与胚胎产出率，以及幼年玻璃化冷冻卵母细胞在复苏后不同时间点的线粒体活性荧光强度与细胞内活性氧（ROS）水平；并采用Tukey事后检验（post-hoc test）揭示各组间及组内的差异。
  3. 使用统计学软件进行数据分析，以P < 0.05作为差异具有统计学意义的最低标准。所有结果均以均值±标准误（mean ± S.E.M.）表示。

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结果

来自未成年供体的卵母细胞的冷冻耐受性低于成年供体。首先观察到的现象是，与成年卵母细胞相比，未成年卵母细胞在复温后的存活率较低（图1A；χ2检验 P<0.001）。未成年卵母细胞在复温后表现出较低的膜完整性（图1B）。在成熟培养基中添加海藻糖旨在验证这种糖是否能够减少未成年卵母细胞的冷冻损伤。已有研究数据23表明，添加海藻糖体外成熟24小时的卵母细胞，在玻璃化冷冻/复温后的存活率高于未处理组（表1：分别为85.7% vs 75.3%；χ2检验 P<0.05）。事实上，添加海藻糖与复温后更高的膜完整性相关（图2A）。因此，在未成年卵母细胞的体外成熟过程中使用海藻糖，使其玻璃化冷冻后的存活率（85.7%）提高到接近成年卵母细胞的水平（90.3%）。然而，海藻糖的添加并未提高未成年卵母细胞的卵裂率、受精率及发育率（表...

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讨论

家畜卵母细胞的冷冻保存不仅有助于雌性遗传资源的长期保护，还能推动胚胎生物技术的发展。因此，建立一种标准化的卵母细胞玻璃化冷冻方法将有利于畜牧业和科研领域。本方案提供了一种成年绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的完整方法，可为建立高效的幼龄卵母细胞玻璃化冷冻体系提供可靠的起点。

该方法的主要优势之一在于，它涵盖了从卵母细胞采集、体外成熟、玻璃化冷冻到复温的全部步骤。此外，该方法还包括一段复温后的培养期，使卵母细胞在受精前能够从玻璃化冷冻过程中所受的损伤中恢复。最佳受精时间应根据冷冻保存方法、卵母细胞初始质量、患者年龄和物种进行个性化调整，同时必须兼顾恢复时间和卵母细胞老化两个方面25,26。因此，选择复温后孵育时间的长短具有挑战性，并可能影响卵母细胞玻璃化冷冻项目的最终结果。根据本方案所述条件下获得的卵裂率和胚胎发育结果，成年绵羊卵母细胞在玻璃化冷冻后，最佳受精时间为复温后孵育4小时（表4）6。这一...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者未获得本研究的专项资助。谨此感谢Maria Grazia Cappai教授和Valeria Pasciu博士为视频配音以及在视频制作期间协助实验室的搭建工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯Sigma-AldrichD-6883
牛血清白蛋白V组分，无蛋白酶Sigma-AldrichA3059
双苯并咪唑H 33342三盐酸盐（Hoechst 33342）Sigma-Aldrich14533
氯化钙（CaCl2 2H20）Sigma-AldrichC8106
柠檬酸Sigma-AldrichC2404
共聚焦激光扫描显微镜Leica Microsystems GmbH, WetzlarTCS SP5 DMI 6000CS
Cryotop KitazatoMedical Biological Technologies
半胱胺Sigma-AldrichM9768
D-(-)果糖Sigma-AldrichF0127
D(+)-海藻糖无水物Sigma-AldrichT0167
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD2438
杜氏磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichD8537
蛋黄Sigma-AldrichP3556
乙二醇（EG）Sigma-Aldrich324558
FSHSigma-AldrichF4021
谷氨酸Sigma-AldrichG5638
戊二醛Sigma-AldrichG5882
甘油Sigma-AldrichG5516
甘氨酸Sigma-AldrichG8790
肝素Sigma-AldrichH4149
HEPESSigma-AldrichH4034
次黄嘌呤Sigma-AldrichH1384
倒置显微镜Diaphot, Nikon
L-丙氨酸Sigma-AldrichA3534
L-精氨酸Sigma-AldrichA3784
L-天冬酰胺Sigma-AldrichA4284
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA4534
L-半胱氨酸Sigma-AldrichC7352
L-胱氨酸Sigma-AldrichC8786
L-谷氨酰胺Sigma-AldrichG3126
LHSigma-AldrichL6420
L-组氨酸Sigma-AldrichH9511
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI7383
L-亮氨酸Sigma-AldrichL1512
L-赖氨酸Sigma-AldrichL1137
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM2893
L-鸟氨酸Sigma-AldrichO6503
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP5030
L-脯氨酸Sigma-AldrichP4655
L-丝氨酸Sigma-AldrichS5511
L-酪氨酸Sigma-AldrichT1020
L-缬氨酸Sigma-AldrichV6504
七水合氯化镁（MgSO4.7H2O）Sigma-AldrichM2393
Makler计数板Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.
Medium 199Sigma-AldrichM5017
矿物油Sigma-AldrichM8410
MitoTracker Red CM-H2XRosThermoFisherM7512
新生小牛血清，热灭活（FCS）Sigma-AldrichN4762
青霉素G钠盐Sigma-AldrichP3032
酚红Sigma-AldrichP3532
聚乙烯醇（87-90%水解，平均分子量30,000-70,000）Sigma-AldrichP8136
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP5405
磷酸二氢钾（KH2PO4）Sigma-AldrichP5655
碘化丙啶Sigma-AldrichP4170
羊血清Sigma-AldrichS2263
叠氮化钠Sigma-AldrichS2202
碳酸氢钠（NaHCO3)Sigma-AldrichS5761
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS9888
DL-乳酸钠溶液糖浆Sigma-AldrichL4263
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256
精子分类分析仪Microptic S.L.S.C.A. v 3.2.0
统计软件 Minitab 18.12017 Minitab
体视显微镜OlympusSZ61
硫酸链霉素Sigma-AldrichS9137
牛磺酸Sigma-AldrichT7146
TRISSigma-Aldrich15,456-3

参考文献

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